【doc】动物抗病毒感染基因工程育种研究进展

【doc】动物抗病毒感染基因工程育种研究进展 动物抗病毒感染基因工程育种研究进展 一 7卷J 1994年3月 形 CHINESEJOURNALOFV?t0L0GY V0ll0 March 影 Not 1994 动物抗病毒感染基因工程育种研究进展 垦壁.皇茎垦, {长春农牧大学兽医研究所.长春130012) }8s 动物传染病,尤其是动物病毒性传染病,严重威胁畜禽健康一些很早发现的传染病迄 今未能有效控制.随着集约化饲养和养殖条件的改变,近年来又相继发生和流行一些新的传 染病尽管预防接种发挥了重要的防制作用,但仍不能完全控制和消灭疫病流行.由于病毒 抗原漂移和超强毒株的出现以及母源抗体的干扰等原因,防疫实践中经常发生疫苗接种失败 现象.弱毒疫苗还有毒力返强的潜在危险.因此,人们正在探索新的防疫途径,筛选和培育 抗病的动物品系,是其重要的一个研究领域. 1982年Pakniter等"通过转基因技术将大鼠生长激素基因转移到小鼠的染色体内,不 仅使该基因获得表达并可遗传给子代,且其表达产物呈现明显的促生长效应,培育得到世界 上第1例超级小鼠.这一技术为进行动物的育种研究开辟了有效途径.同时.人们利用 基因工程的原理和技术不仅分离或合成了诸如干扰素,白介素等一类具有抗病毒和免疫调节 等作用的细胞因子以及病毒相关蛋白的DNA或cDNA,还发现了具有终止病毒基因转录和 翻译的诸如反义RNA,Ribozylr~等一类小分子RNA.这些DNA,cDNA或RNA的表达 质粒不仅可以插入细胞染色体DNA内和进行表达,而且可使转化细胞获得抗病毒等功能. 因而国内外学者在8O年代初期相继提出了基因工程抗病育种的设想,并进行了深入的探索 研究 病毒的致病性决定于病毒和机体两者的双重因素:病毒基因决定着病毒的侵入与复制能 力;机体则通过主动或诱导产生的免疫物质发挥抗感染作用.因此,抗病毒感染育种也是从 病毒基因和机体抗病毒相关基因两个方面进行研究 1干扰素基因 干扰素(1FN)是动物机体内可被多种诱导物诱导产生的生物活性蛋白,N产生后与 应答细胞的表面受俸结合.触发多种生物效应,如抗病毒,免疫调节,抗增生等1979年 以来相继克隆了lFN的cDNA,并在重组后于大肠杆菌,酵母和哺乳动物细胞内获得表 达,产生的干扰素具有与天然干扰素相同的生物学活性[waku/-a等0和Hckman 等分别采用同源性小鼠干扰素基因培育转基因鼠,当代雄鼠和由当代雌鼠生育的子代雄 鼠均因干扰素基因在睾丸内高水平表达而表现为不育.Stinnakre等"采用异源性羊滋胚层 lFN基因,在猪?一乳清蛋白启动于调控下使其在转基因小鼠的乳腺中得到表达,因血液 中并无lFN表达,不能在体内发挥抗病毒作用Young等采用8.6kb的人的lFN—基因 培育转基因小鼠,N—转基因的表达调节与内源性小鼠lFN—的表达调节互相平行, 均只在T细胞中表达,但是转基因动物不表现任何生物学反应或发育缺陷,这是因为人 lFN—具有较强的种属特异性,不与小鼠lFN一受体结合人N—1在小鼠细胞上具 1993年3H30日虹稿,7月28日修回 l期殷震等:动物抗病毒感染基因工程育种研究进展 有明显的活'睦,人IFN一比IFN—l活性更高.在攻毒前给小鼠注射重组人IFN—,可 以保护小鼠免受脑心肌炎病毒的感染为此Chen等"将mMT—l与人N一1的融合基 因导人小鼠生殖系培育获得了转基因小鼠,其中有2株(strain)小鼠的血清可以保护WISH 细胞免受水泡性口炎病毒的感染以850PFU的伪狂犬病病毒接种小鼠脚垫,6天后,非转 基因个体全部死亡,转基因个体(A75株)在接种后9天只有1只死亡.另一株(B9)转基 因小鼠,25%的个体在接毒后几个月内均保持健康,并繁殖了6代,建立了转基因鼠克 隆我们实验室在开展人正N—转基因家兔的培育研究中,已经获得整合阳性个体, 正在 检测外源基因的表达及其抗感染效应 2干扰素受体基因 干扰素通过与细胞表面相应受体结合,诱导细胞产生抗病毒蛋白而实现其抗病毒作用. 研究表明,?N—和?N—通过同一受体与细胞结合.因此,可以通过增加机体细胞表 面受体数量的途径,充分发挥干扰素的间接抗病毒作用.Um等已经克隆获得人的 ?N—受体基因,并在小鼠细胞表面实现表达研究结果证明,它与?N—具有很高的 亲和性将该基因导人动物受精卵,有可能培育成功干扰素高反应性的转基因动物——通过 干扰素受体介导,增强动物的抗病毒能力. 3抗流盛病毒基因 早在60年代初,Lindenmann等就发现具有染色体显性Mx等位基因的小鼠对A型 及B型流感病毒具有天然的抵抗力.后来发现Mx基因存在于几乎所有的真核生物中,只是 以隐性等位基因的形式存在.小鼠的这个基因(Mx1)位于其l6号染色体上,在干扰素, 双链RNA及病毒的诱导下可以表达Aebi等证实,在培养细胞内Mxl蛋白与流感病毒 复制的抑制作用密切相关Parlovic等"发现人的MxA及大鼠的Mxl蛋白在细胞上不仅 具有抗流感病毒的作用,而且还抑制水泡性I=l炎病毒的复制,大鼠的Mx2则只能抑制水泡 ? 睦口炎病毒的复制Garber等.利用小鼠Mx1蛋白的全长eDNA转染鸡胚成纤维细胞, 转化细胞对鸡的流感病毒A/'I'urkey/Wisconsin/68和AfI'urkey/Massachussetts/65 均具有抑制其 复制的作用Amheiter等将含有该基因启动子的全长eDNA导A小鼠受精卵内,培育得 到转基因小鼠,其中979系小鼠为高反应系,无论感染的流感病毒剂量大小,抗感染效率均 在63%,69%之间.无反应系(1O09)和同窝非转基因个体一样,均在攻毒后死亡.有趣 的是低反应系(964)转基因鼠用高剂量(50O00u)50)流感病毒攻击时无一死亡,而在以 低剂量(5,50LI]50)攻毒时则不能存活,但在同时注射干扰素和小剂量病毒时又可避免 死亡.这Mx蛋白的水平受病毒剂量或干扰素水平的诱导.并直接影响其对病毒的抗感 染力因而在进行攻毒前必须使Mxl蛋白达到保护水平.据报道,利用该基因培育的抗流 感病毒转基因猪也已取得成功.有关Mxl蛋白抗病毒的具体机制尚待阐明. 4反义核酸 反义RNA最初发现于原核生物,它们以自然存在的方式,通过碱基配对,特异性地与 mRNA结合,阻止mRNA的翻译.是存在于原核生物中的一种基因表达调控因子.在真核 细胞中也发现了一些这样的RNA小分子,并通过基因转移技术证实了反义RNA在真核细 胞内抑制或关闭mRNA翻译的功能它们通过与mRNA结合,形成二聚体,破坏mRNA 的正常翻译过程将人工构建的Rous肉瘤病毒",反转录病毒"和人5型腺病毒.等 病毒l0卷 的反义核酸表达质粒导人对各该病毒敏感的细胞,建立持续表达反义RNA的细胞系,这些 细胞系对病毒感染具有明显的抑制作用.研究表明,病毒RNA5端的前导区,中部的髓v 区以及3端的非编码区均为反义抑制的有效部位",但不同部位的抑制效率有所差异.如 针对腺病毒基因组EIA区13SmRNA的反义抑制效率达90%以上,而针对其12SmRNA的 反义抑制效率只有64%cig)o因而针对不同病毒的基因结构和调控序列,相应有效的反 义表达质粒,就可能实现抑制病毒的目的. 反义核酸抑制病毒复制的试验不仅已在培养细胞上获得巨大成功,在动物体内也实现了 某些病毒的反义抑制Han等.将Moloney鼠白血病病毒(M—MuLV)的前病毒包装序 列(中)反向插入M—MuLVLTR的嗜淋巴细胞启动子/调节因子的转录调节区下游或合胞 病毒的极早区(immediateeadyregion)内,将在NIH3T3细胞上具有阻止病毒RNA包 装进衣壳的反义表达序列导人小鼠受精卵,在小鼠出生当日进行M—MuLv感染试验,l2 周后观察小鼠有无白血病病毒感染症状.结果,反义转基因小鼠在M-MttLV攻毒后无一 发生白血病,而对照的正常鼠有31%患病Ernst等利用人5型腺病毒(AdS)的反义表 达质粒成功地构建了转基因家兔.通过转基因家兔的肾原代细胞培养物滴定抗腺病毒活性,5 只被测转基因家兔中有2只显示明显的Ad5抗性.我们实验室亦在应用反义抑制技术进行 抗猪瘟病毒育种的研究.利用化学合成及反转录合成的猪瘟病毒的反义eDNA转 化PK—l5 细胞,已经筛选获得抗猪瘟病毒的细胞系c21~o可见,应用反义RNA进行抗病育种研究,是 一 个很有价值的探索领域. 5Rl~OZyme 可译为核酶,有人称之为基因剪或酶活性RNA.Ribozyme最初是由Haseloff等在研 究烟草抗病毒侵染时发现的.它是一种天然的RNA小分子,具有催化RNA切割反应的功 能,可以序列特异性地切割RNA.研究表明,Ribozyme主要包括三部分结构,一是与识别 底物RNA上GUX(X=C,A)并与之互补结合的A部分;二是由l3个核苷酸组成的序列高 度保守的形成螺旋型二级结构的B部分.其螺旋部后3对碱基可以改变,末端RNA环可以 断开,因此可以将Ribozyme分成左右两半进行设计:三是B部分两侧与靶RNA序列互补 的C部分,它能使Ribozyme与底物发生特异性结合,使反应基因精确定位,其序列由底物 RNA的核苷酸序列决定.由此看来,A,C两部分的碱基互补区决定了Ribozyme切割反应 的特异性;B部分为R~laozyme的活性部位,决定了Ribozyme的切割活性. 根据以上原理,只要已知某种病毒的RNA序列,就可以设计并合成相应的抗病毒 Ribozyme.体外试验结果表明,人工合成的Ribozyme能够切断动物病毒的RNA.Sarver 等设计了4种针对HIVgag基因和5LTR的Rllaozyme.结果4种Ribozyme均于体外培养 细胞中有效地切割了HIV—l的RNA.其中针对gag的Ribozyme在CD4HeLa细 胞中灭 活了gag的RNA,从而阻止了P24(gag)抗原的表达,病毒复制受到抑制.表达细胞经连续传 代表明,Ribozyme对HeLa细胞无毒害作用,因此,利用Ribozyme进行动物抗病毒育种是 一 个很有前途的方法.目前,澳大利亚CSIRO的研究人员已经设想通过Ribozyme开展抗病 毒转基因动物的研究Ribozyme抗猪瘟育种也是我国"八六三项目 6MHC等位基因 即主要组织相容性抗原复合体基因.MHC基因是参与调节机体免疫反应的基因群,其 I 1期殷震等:动物抗病毒感染基因工程育种研究进展 中很多等位基因与病毒性传染病的抗性有关.根据MHC基因的表达产物的性质与功能不 同,可将其分为I,?,?类抗原.其中?类抗原主要存在于巨噬细胞和B细胞表面, 是T细胞的激活因子,尤其是巨噬细胞表面的?类抗原,当其与经巨噬细胞降解的病原 体分子结台后,形成T细胞的第一激活信号,从而启动细胞和体液免疫反应.动物在感染 病毒后,能否发生免疫反应,主要决定于?类抗原识别病毒抗原分子,并与之结合的程 度.有些动物对某种病原特别易感,原因之一就是缺乏相应的?类抗原.鸡的MHC(即B) 编码基因组分为B—F,B—G和B—L三段,其中B—F编码I类抗原,B—L编码?类抗 原,B—G为禽类所特有,编码?类抗原,存在于红细胞等多种细胞表面,参与免疫调 节. 晟近的研究表明,B—G和B—F都与鸡马立克氏病(MD)的抗性有关.人们正在试图以具 有天然抗MD的B21/1321鸡为研究对象,鉴定和分离抗MD基因 7病毒中和性单克隆抗体基因 抗体的可变区是与相应抗原进行特异性结合的部位,即抗体的活性部位.从杂交瘤细胞 中分离单抗的mRNA,通过反转录途径进行克隆,构建表达该区的重组基因,后者可表达该 单抗的活性部分.如Brinster等利用骨髓瘤细胞MOPC一2l的功能性基因培育转基因 鼠,使外源性K链于转基因鼠脾脏获得表达Rusconi等以抗半抗原三硝基苯(n) Sp6型lgM的链和链分别转化小鼠的生殖系,外源基因不仅表达和遗传给子代,而且 所有转基因鼠均表现抗1P/绵羊红细胞凝集滴度增高,并证明其与Sp6型lgM独特性决定 基的表达增高有关. 将抗病毒中和性单克隆抗体的可变区基因进行克隆后,导人动物受精卵进行种系转化, 培育含该种基因的转基因动物,将为抗病毒感染育种提供又一条新途径.在这一方面,Ye 等一试图分离抗狂犬病毒中和性单抗可变区基因的克隆研究,已获初步成功. 8衣壳定靶病毒灭活(c1V1) 衣壳定靶病毒灭活(Capsid—targetedviralinactivadon)是由Nalsoulis和B?ke于 1991年提出的.将核酸酶基因与病毒衣壳成分基因融合在一起,使表达产生的核酸酶包装 在病毒颗粒的内部,在一定条件下,核酸酶活化,即可发挥其降解病毒RNA的作用.如葡 萄球菌核酸酶(sN),其活性完全依赖于Ca"浓度,由于胞内Ca"水平较低,因此衣壳 一 核酸酶在胞内无活性;当这一融合蛋白释放至胞外后,如在进入血液中后,包装在衣壳 中的核酸酶就被mmol浓度水平的Ca"激活,从而灭活病毒RNA.该酶对宿主细胞RNA 无干扰作用,可以优先应用于哺乳动物的抗病毒感染研究. 9病毒衣壳蛋白基因 应用病毒衣壳蛋白进行抗病毒转基因研究,最初报道于植物.Nejidat等培育成功了 携带花叶病毒衣壳蛋白基因的转基因烟草檀株,对其进行强毒攻击试验.转基因植株较正常 对照植株延迟发病20,30天.应用其他植物病毒结构蛋白基因培育转基因植株,也常对 相应病毒表现出延迟发病或不发病的抗病性.BeaehyMackenzie等进行了相似的试 验,并对其机制作了探讨,认为转基因植株阻止了病毒RNA的释放与表达. 在动物病毒研究方面,Carterallen等将牛鼻气管炎病毒(BRV)的糖蛋白?基因导 人牛成纤维细胞,获得的阳性细胞克隆具有很高的抗BRV感染能力.在此基础上,他们试 图开展转基因小鼠的抗病研究,以期最终达到抗鼻气管炎转基因牛的育种目的.Sarabrook 病毒10卷 等以流感病毒血凝素(HA)基因培育的转基因小鼠,HA于胰细胞表面获得表达.以 流感病毒进行攻击,转基因小鼠产生高滴度的抗HA抗体,说明机体并未产生对HA的免疫 耐受.后者提示我们,利用病毒保护性抗原基因有希望培育抗病毒的转基因动物 在反转录病毒抗病研究方面,也已经取得令人鼓舞的进展.Crittenden和Salter以不 含内源性白血病病毒的0系鸡为试验对象,培育成了携带禽白血病病毒(ALV)基因组1个 DNA拷贝的转基因鸡在获得的23家(family)转基因鸡中,2l家可以产生感染性ALV;2 家未产生感染性ALV,但在细胞表面表达ALv的囊膜糖蛋白,其中1家对A亚群ALV的感. 染和致瘤作用具有抵抗性. 近年来,有关鼠乳腺瘤病毒(MMTV)与其免疫间的关系的研究报道很多C3EI并且取 得了突破.通常认为所有品系的小鼠其生殖系中均含有内源性MMTV的前病毒序列.不同 的品系在基因组的不同部位含有不同的前病毒.但其中大部分为缺陷型,不产生感染性病毒 颗粒部分内源性MMTV在乳腺原位活化后,产生的病毒颗粒释人乳汁含缺陷型前病毒 的小鼠通过哺乳感染是获得MMTV的唯一途径这种感染过程依赖于小鼠的免疫系统,因 为通过试验证明,新生鼠切除胸腺后就大大降低了MMTV诱导乳腺瘤的发病率.最近研究 发现,影响这一免疫事件的内源性基因(次级淋巴细胞刺激位点一M1s,或叫自身超抗原)与 内源性MMTV前病毒在遗传上共分离(oosegregate).Mls基因产物具有刺激T细胞增殖 的能力,MMTV长末端重复序列(LTR)编码的ORF蛋白在这一过程中起介导作用,在体 外它可以刺激特异性带vp受体T细胞的增殖,但在体内于免疫耐受的建立期则可导致含同一 种类v口受体的T细胞的缺陷.Golovkina等建立的高水平表达C3H外源性MMTV ORF蛋白的转基因鼠特异性地缺乏v】4T细胞,该转基因小鼠对外源性MMTV的感染 具有抵抗力,随着ORF蛋白表达水平高低的变化(通过增减载体中该基因的拷贝 数实 现),小鼠抗外源性MMTv感染的能力也随之发生强弱的变化. 10问题夏展望 10.1外源基因的选择及表达根据病毒侵人机体的过程及复制机制,还可以通过阻断病毒 与细胞表面病毒特异性受体结合,以病毒特异性蛋白酶破坏病毒衣壳蛋白等途径达到抗病毒 的目的.在选择抗病毒基因时,产物的作用必须具有病毒特异性,避免影响宿主细胞的功 能.同时应注意到基因产物功能的动物种属特异性.否则,转基因即使表达,也不能发挥其' 应有的生物学效应. 目前,对外源基因在机体内整合的机制尚不十分清楚.由于整合的随机性,插人的外源. 基因经常导致内源性基因的缺失,重排,移位,灭活及非活性基因的激活等后果.通过构建 定点整合载体和选用经反复应用证明安全的启动子的方法可以避免以上问题.同时,载体的 构建及君动子的选择直接决定着外源基因的表达组成性高水平表达,过早或过迟表达,异 位表达等都可能对动物机体产生不利的影响,造成畸胎,跛行,癞皮,不育等.通常以诱导 性君动子(如病毒诱导性启动子),组织(病毒侵人的靶组织)特异性启动子对基因的表达 进行调控 l02基因的导人方法为了实现抗病育种研究的目的,需要将外源基因转移至动物的生殖 系中,使其遗传给后代.在哺乳动物,最有效的途径是通过显微注射技术将基因导人单细胞 受精卵内;在禽类,采用反转录病毒介导技术也实现了生殖系转化.但是显礅注射造成的机 1期殷震等:动物抗病毒感染基因工程育种研究进展 械性损伤使受精卵的存活率大为降低,且操作技术复杂;反录病毒介导具有引起感染的潜在 危险.有必要对精子载体技术,原生殖细胞(PGC)转化,电激技术(Electroporation).基 因枪(Genegun).激光导入(Laser)以及贝康技术(Beakonizadon)等进行尝试. 10_3展望由于基因操作技术的不断发展,目前可以将两个或多个抗病毒基因克隆至同一 载体中将这样的多重抗病毒基因导入动物体.能使不同抗病毒功能的基因协同作用如将 反义核酸和Ribozyme融合在一起,既可阻止病毒RNA的翻译.又可将病毒RNA切断,从 而大大增强其抗病毒作用.又如将Mx基因与中和性单抗可变区基因融合在一起,不仅可以 发挥Mx的胞内抗病毒作用.而且可以发挥单抗可变区的胞外抗病毒作用同样,反义核酸 与中和性单抗可变区基因融合,既有核酸水平的抗病毒作用,又有蛋白水平的作用.总之, 随着胚胎学,分子生物学和基因工程等技术的不断进步,抗病毒感染育种研究将不断深入并 取得进展. 参考文献 IPalmJterRD,etalDramaticgrowthofmicethatdevelopfromeggsmic~injectedwithmetall othio1~fin—gtlo',,ab hormonefusiongenesNature,1982,300:611—615 2I~kumetalMaksterilityoft唧mice~m3ang.鲫吣mouseinterferon—beta静le岫曲the~raml 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