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大鼠外侧膝状体中继神经元HRP示踪结合谷氨酸免疫组织化学研究

2017-12-03 9页 doc 43KB 17阅读

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大鼠外侧膝状体中继神经元HRP示踪结合谷氨酸免疫组织化学研究大鼠外侧膝状体中继神经元HRP示踪结合谷氨酸免疫组织化学研究 大鼠外侧膝状体中继神经元 示踪 H R P 3结合谷氨酸免疫组织化学研究 李昌琪卢大华罗学港刘丹 ()湖南医科大学神经生物学研究室, 长沙 410078 ()中继神经元的化学递质。逆行追踪结合谷氨酸免疫组织化学方法观察大鼠外侧膝状体背侧核 采用 摘要 H R P dL GN 光镜下 H R P 标记细胞与谷氨酸免疫阳性细胞清晰可辩。H R P 单标记细胞位于外侧膝状体背侧核内, 胞浆及树突基部充满棕 ( ) 色颗粒。 免疫金银法 单标记的谷氨酸免疫阳性神...
大鼠外侧膝状体中继神经元HRP示踪结合谷氨酸免疫组织化学研究
大鼠外侧膝状体中继神经元HRP示踪结合谷氨酸免疫组织化学研究 大鼠外侧膝状体中继神经元 示踪 H R P 3结合谷氨酸免疫组织化学研究 李昌琪卢大华罗学港刘丹 ()湖南医科大学神经生物学研究室, 长沙 410078 ()中继神经元的化学递质。逆行追踪结合谷氨酸免疫组织化学方法观察大鼠外侧膝状体背侧核 采用 摘要 H R P dL GN 光镜下 H R P 标记细胞与谷氨酸免疫阳性细胞清晰可辩。H R P 单标记细胞位于外侧膝状体背侧核内, 胞浆及树突基部充满棕 ( ) 色颗粒。 免疫金银法 单标记的谷氨酸免疫阳性神经元分布于外侧膝状体背侧核与腹侧核, 胞体内充满黑色银颗粒。IGSS 谷氨酸可在外侧膝状体背侧核内可见 和谷氨酸双标记细胞, 其数目占 标记细胞总数的 7019?614% 。本文提示, H R P H R P 能是外侧膝状体背侧核投射至视皮质的中继神经元的神经递质之一。 关键词 谷氨酸 示踪 外侧膝状体背侧核 视皮质 免疫组织化学 大鼠H R P -DO UBL EL A BELL ING O F HRP A ND GL UTAM A TE IN RA T L A TERAL GEN ICUL A TE NUCL EUS , , , L i C h an gq iL u D ah u aL uo X u egan gL iu D an (), , 410078, D ep a r tm en t of N eu robiology H u n a n M ed ica l U n iv e rs ity C h a n g sh a C h in a T h e re t ro g rade H R P t rac in g tech n iqu e com b in ed w ith imm u no h isto ch em ica l m e tho d fo r g lu tam a te w a s u sed to de tec t th e n eu ro t ran sm it te r s in re lay ce lls w h ich p ro jec t to th e v isu a l co r tex f rom do r sa l la te ra l . gen icu la te n u c leu s in ra t sT h e H R P lab e llin g n eu ro n s an d g lu tam a te imm u no reac t ive ce lls w e re ea sily . d ist in gu ish ed b y th e d iffe ren t reac t ive g ra in sH R P an d g lu tam a te do u b le lab e llin g n eu ro n s w e re fo u n d in () th e do r sa l la te ra l gen icu la te n u c leu s acco u n t in g fo r 7019?614% X ?S n = 15in th e to ta l n um b e r o f H R P . lab e llin g ce lls in th e sam e a reaT h e re su lt su gge st s th a t g lu tam a te is o n e o f th e n eu ro t ran sm it te r s in th e 2.gen icu lo co r t ica l p a thw ay 2; ; H R P t rac in gD o r sa l la te ra l gen icu la te n u c leu sKey W ord s G lu tam a te; V isu a l co r tex; Imm u no h isto ch em ist ry; R a t 6 ( 浓度明显增高, 提示 可能是中继神经元 , 外 侧 膝 状 体 核 G lu G lu la te ra l gen icu la te n u c leu s 的神经递质。 但直到目前尚无直接证据证实这些神 ) 的 神 经 元 可 分 为 两 类: 中 间 神 经 元L GN 经元内含有谷氨酸。 本实验将 逆行追踪法和 H R P ( ) ( )和中继神经元 。中间神经 in te rn eu ro n re lay ce ll免疫组化方法结合起来, 在 观察是否存G lu dL GN 元的突起多局限于外侧膝状体内, 而中继神经元的 1 轴突可投射到视皮质的第K 层。等用免O t te r so n 和 双标记细胞,并作了双标记细胞的在 H R P G lu () 疫组化法证实大鼠外侧膝状体背侧核 dL GN 内有定量研究, 以了解在L GN 至视皮质的传递中含 G lu 2, 3() (神经元 , 但他)谷氨酸 免疫阳性 2 G lu G lu ir 神经元所占百分比。 们没有确定这些 G lu 2ir 阳性神经元是中间神经元 材料和方法 还是中继神经元。 等曾报道 投射至T sum o to L GN 视皮质的中继神经元的神经递质可能是兴奋性氨基 ( 大 鼠 15 只成年 健 康 体 重 200, 300 W ista r 4, 5 酸。发现用电刺激 后, 视皮质内T am u ra dL GN ) () , 在戊巴比妥钠 40 ƒ腹腔注射麻醉下将 g m gk g () 鼠头固定于脑立体定位仪 23 定位, 将SN J ap an 3 ()国家自然科学基金资助课题 . 39270269 N O) ( 30% K 型用微电泳方法导入右侧视H R P S igm a ()皮质。电泳部位如图 1 所示。术后动物存活 48 , 用元图 5、 6。 h 2% 戊巴比妥钠作深度麻醉、胸腹腔联合切开, 经左 讨论 心室主动脉升部灌注生理盐水 100 , 4% 多聚甲m l 醛 250 。取脑后在相同固定液中后固定 2 。然后 许多学者对 中继神经元的解剖学和生m lhdL GN 1 经 10% 、20% 、30% 蔗糖磷酸缓冲液中浸泡以防冰 理 学 特 性 及 其 化 学 性 质 进 行 了 广 泛 的 研 究。 晶形成。连续冠状冰冻切片, 片厚 30 。切片经 011O t te r sen 等 报 道 大 鼠 dL GN 内 有 G lu 2ir 神 经 Λm 2, 3 () 714漂 洗 后 在 012% 的 溶 液 与M PB pH DA B 元。 而在大鼠 中继神经元所投射的区域 dL GN 0101% 的 中孵育约 20 作 反应。 H 2O 2 m in H R P PB即 视 皮 质 第 K 层 的 神 经 元 既 有 兴 奋 性 氨 基 酸 8 ( ) 终止反应。 选择有 标记细胞的切片用漂洗,受 体。 H R P 的 NM DA 受 体 又 有 非 NM DA EA A () 2缓冲液 714漂洗后, 按 011 T r isH c l pH L uo等用微离子透入法将 ƒ拮抗M T sum o to G lu A sp a r ta te 7( ) 等 改良的免疫金银法 IGSS步骤作 G lu 免疫组 剂导入猫的视皮质后, 发现视皮质第K 层的神经元 4 () 对视觉的反应完全被抑制; 受体拮抗剂将 化反应。兔抗 —抗 美国稀释度 1? EA A G lu C h em ico n ( ) ) ((8000, 孵育 24 4?, 羊抗兔免疫金二抗 金粒 如 等导入视皮质后发现视皮 , h k yn u ren a teA PV ) 大小 15 的浓度为 1?100, 反应 24 小质第K 层大部分神经元对电刺激 和视交叉 nm J ack sen dL GN 5 ()无反应。 而 等给猫分别进行视觉刺激和 时 4?。用自配的 011% 硝酸银液代替银强化剂,T am u ra (() 用电刺激 与视束后, 用推挽套管 224室温 ?下反应 6, 7 。 切片终止反应后在 dL GN p u llp u sh m in ) 测量视皮质内各种氨基酸的释放情况, 发 经过滤的自来水中贴片, 自然干燥、梯度酒精脱水, can n u la 6 现视皮质内 浓度明显增加。用免疫二甲苯透明, 中性树脂封片。 免疫组化对照实验以 G lu M o n te ro 正常羊血清取代一抗, 其它步骤同实验组。 多能显 电镜观察到在猫 中继神经元至视皮质的轴dL GN () 突 的 侧 支 在 膝 周 核 的 终 末 有 强 阳 性 免 疫 反微镜 观察并拍照。在 40 倍物镜下用计G lu O lym p u s9, 10 应。我 们 用 抗 的 特 异 性 抗 体 观 察 到 许 多 G lu () 数 网 格 在 dL GN 计 数 H R P 细 胞 和 G lu t 与 H 标记细胞内含有 。和 双标记细胞 H R P G luH R P G lu ()双标记细胞 数, 每一动物在其代表片上H R P D 的数量占 标记细胞总数的 7019% 。 这大 H R P 数 5 个视野, 以 ƒ×100% 算出双标记细胞占= P D H 鼠 内绝大多数中继神经元内含有 , dL GN G lu G lu 总 标记细胞的比值。H R P 在 至视皮质的信息传递中具有重要的意义。dL GN 结 果 我们的研究结果为 内投射至视皮质的中继dL GN 1. 标记细胞 标记细胞位于电泳同神经元含有 提供了直接证据。 因而有理由推测H R P H R P G lu 侧即右侧的 内, 胞体及树突基部充满棕色颗 是 投射至视皮质的中继神经元的重要递 dL GN G lu dL GN 粒。 标记细胞多为大、 中型, 呈多极、 三角或梭形 质之一。 () 图 1, 2。 左侧 内未见 标记细胞。和 双标记神经元占 标记神经元dL GN H R P H R P G lu H R P 2. 标记细胞 用 标记的 2阳性 7019% , 说明还有约 2911% 的 标记细胞末被G lu IGSS G lu ir H R P 神经元内反应产物为黑色银颗粒, 充满整个胞体, 细 标记, 提示 不是 投射至视皮质的中 G lu G lu dL GN () 胞轮廓清晰 图 3, 4。外侧膝状体背侧核和腹侧核继神经元的唯一递质。将氚标记的天门冬Jo h n so n ()内可见 2神经元, 而 内 2神经元的 G lu ir dL GN G lu ir 氨酸注射到大鼠视皮质,发现在 有 dL GN A SP 11 分布明显高于外侧膝状体腹侧核, 结果与 标记细胞用电刺激 后, 在视皮质 O t te r sen T am u ra dL GN 2等发现除了 的浓度明显增加外, 浓度也有明 报道的类似。 免疫组化对照实验结果为阴性。G lu A SP 6 3. 和 双标记神经元 在 内可显增加。这提示一部分 单标细胞的递质也许H R P G lu dL GN H R P ( 见部分 标记细胞内有密集的黑色银颗粒 图 是 A SP。dL GN 中继神经元内是否存在 G lu 与A SPH R P ) 3、4, 说明这些神经元为 和 双标记细胞。 递质的共存以及是否还存在其它的递质有待进一步 H R P G lu 研究。 双标记细胞占 标记细胞总数的百分比为 7019H R P () 内一些 2神经元为非 标记细 ?614% X ?s, n = 15。还有少部分 H R P 标记细dL GN G lu ir H R P 胞, 其可能原因首先是 内的中继神经元没有胞 没有被 标记, 并有一些 2神经元为非 dL GN G lu G lu ir 标记细胞。因此, 我们在 可分辩出 全部被 所标记。 其次是 内的神经元除 H R P dL GN H R P H R P dL GN 和 双标记, 单标记和 单标记三类神经主要传递视觉信息投射到视皮质外, 还有一些神经 G lu H R P G lu 22, te rm ina ls o f re t ino gen icu la tegen icu lo o r t ica l and 元投射到下丘脑的一些核团如: 下丘脑背内侧核、视 12 2. co r t ico gen icu la te axo n s in th e ca tV isua l N eu ro sc i 交叉上核、视前外侧区等。它们也可能以 作 G lu 1994; 11: 675 为其神经递质。 . Jo h n so n R R and B u rk h a lte r AE v idence fo r exc ita to ry 11 收稿 1998212 修回 19992102am ino ac id neu ro t ran sm it te r s in th e gen icu lo co r t ica l () 本文图 1, 6 见文后彩图p a thw ay and lo ca l p ro jec t io n s w ith in ra t p r im a ry v isua l 89: 20 co r tex. E xp B ra in R e s 1992; 12 参 考 文 献M ik k e lsen JD. P ro jec t io n s f rom th e la te ra l gen icu la te nuc leu s to th e h ypo th a lam u s o f th e m o ngo lian ge rb il 1 Ke lly J P. A na tom y o f th e cen t ra l v isua l P a thw ay s. In: ( ) : an an te ro g rade and m e r io ne s ungu icu la tu s Kande l E , Schw a r tz JH ed s. P r inc ip le s o f N eu ra l 299: re t ro g rade t rac ing study. J Com p N eu ro l 1990; .2: 1985; 364Sc ience nd ed N ew Yo rkE lsev ie r 493 2 O t te r sen O P and S t rom M J . G lu tam a te and GA BA , co n ta in ing neu ro n s in th e m o u se and ra t b ra in a s 图 版 说 明 dem o n st ra ted w ith a new imm uno cy to ch em ica l 图 1,标尺:2 注射区位于右侧视皮质内, 300H R P Λm 229: 374 tech n ique. J Com p N eu ro l 1984; 外侧膝状体背侧核内 标记细胞。 标尺: 80 图 3H R P Λm 3 Kaneko T and M izuno N. Imm uno h isto ch em ica l study o f () 图 4外侧膝状体背侧核内 标记细胞 ?和谷氨酸免H R P g lu tam ina se co n ta in ing neu ro n s in th e ce reb ra l co r tex ()80疫阳性神经元 ?。 标尺: Λm . 1988; 267: 590and th a lam u s o f th e ra tJ Com p N eu ro l 图 5() 外侧膝状体背侧核内 单标记细胞 , 谷氨酸单 H R P H 4 . . T sum o to T M a su i H E xc ita to ry am ino ac id ()() 。 标记细胞 G以及 H R P 和谷氨酸双标记细胞 D t ran sm it te r s in neu ro na l c ircu it s o f th e ca t v isua l co r tex. 标尺: 20Λm1986; 55: 469J N eu rop h y sio l () 外侧膝状体背侧核内 单标记细胞 , 谷氨酸单 图 6H R P H 5 . . H ag ih a ra K T sum o to T and H a ta Y A c t io n s o f ()()标记细胞H R P 和谷氨酸双标记细胞 以及 。 GD 2exc ita to ry am ino ac id an tago n ist s o n gen icu lo co r t ica l 标尺: 4Λm ′. t ran sm issio n in th e ca ts v isua l co r texE xp B ra in R e s 1988; 69: 407 EXPL A NA T IO N O F F IGURES 6 . T am u ra HR e lea se o f g lu tam a te and a sp a r ta te fo rm th e 1, 2 F ig. H R P in jec t io n site is lo ca ted in th e r igh t v isua l v isua l co r tex o f th e ca t fo llw ing ac t iva t io n o f affe ren t . = 300co r texB a rΛm . 1990; 80: 447p a thw ay sE xp B ra in R e s 3 F ig. H R P labe lling neu ro n s in th e r igh t do r sa l la te ra l 7 L uo X G . H e rne r R F e t a l . D o ub le labe lling o f . = 80gen icu la te nuc leu sB a rΛm cy to ch rom e o x ida se and gamm aam ino bu ty r ic ac id in () () ??4 H R P and g lu tam a te labe lling neu ro n s in F ig. . cen t ra l ne rvo u s sy stem neu ro n s o f adu lt ca t sJ N eu ro si . = 80th e do r sa l la te ra l gen icu la te nuc leu sB a rΛm () 1989; 30 3: 189M e th () , 5 S ing le H R P labe lling ce lls H sing le g lu tam a te F ig. Kaczm a rek L. G lu tam a te recep to r s in co r t ica l p la st ic ity: 8 () labe lling ce lls G and H R P and g lu tam a te do ub le . 1997;m o lecu la and ce llu la r b io lo gyP h y sio l R ev iew s labe lling neu ro n so in th e do r sa l la te ra l gen icu la te 77: 217 . = 20nuc leu sB a rΛm . . M o n te ro VM Q uan t ita t ive imm uno go ld ana ly sis revea ls 9 () S ing le H R P labe lling ce lls H , sing le g lu tam a te 6 F ig. 2 h igh g lu tam a te leve ls synap t ic te rm ina ls o f re t ino () labe lling ce lls G and H R P and g lu tam a te do ub le 22, gen icu la teco r t ico gen icu la te and gen icu lo co r t ica l axo n labe lling neu ro n so in th e do r sa l la te ra l gen icu la te 4: 437 in th e ca t. V isua l N eu ro sc i 1990; . = 4nuc leu sB a rΛm 10 M o n te ro V. M . Q uan t ita t ive imm uno go ld ev idence fo r en r ichm en t o f g lu tam a te bu t no t a sp a r ta te in synap t ic
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