铜_促进溶菌酶的选择性水解切割反应

铜_促进溶菌酶的选择性水解切割反应 第 30卷 第 5期 Vo .l 30 No. 5 河 南 科 技 大 学 学 报 : 自 然 科 学 版 O c t. 2009 2009年 10月 Jou rna l of H enan U n ive rsity of Sc ience and Techno logy: N a tu ra l Sc ience ( ) 文章编号 : 1672 - 6871 2009 05 - 0060 - 04 ( )铜?促进溶菌酶的选择性水解切割反应 1 1 1 1 2蒋 疆 ,孔德贤 ,蔡向阳 ,吴琼洁 ,李必强 ( )1. 福建农林大学 生命科学学院 ,福建 福州 350002; 2. 福建医科大学 附属协和医院 ,福建 福州 350001 摘要 :采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 ,研究了中性条件下 CuC l与鸡蛋清溶菌酶的选择性水解切割反应 。研 2 究结果表明 ,在近中性条件下 , CuC l可以高效且有选择地切割溶菌酶 。提高 CuC l对溶菌酶的摩尔比 、温度 2 2 2 + 和增加恒温时间均可显著增加切割效率 ,但过高的温度和配比反而会降低切割的选择性 。Cu对溶菌酶的切 2 + 割没有缓冲效应 ,而且 Cu对溶菌酶的选择性切割位点与溶菌酶的二级结构有关 。 : O657. 63 文献标识码 : A 中图分类号 ) ( 关键词 :溶菌酶 Cu ?;聚丙烯酰胺凝胶电泳 ;水解切割 0 前言 [ 1 - 12 ] ( )近些年来 ,多肽和蛋白的选择性水解切割研究备受关注 ,已有的研究表明 , Cu II及其配合物 是具有人工金属酶活性的切割试剂 ,它可用于多肽和蛋白的氧化和水解切割 。目前已研究的多肽和蛋 白有 :氧化胰岛素 B 链 、肌红蛋白 、溶菌酶 、细胞色素 c、牛血清清蛋白等 。 ( )溶菌酶 lysozym e按来源不同 ,可分为蛋清溶菌酶 、动物溶菌酶 、植物溶菌酶 、微生物产生的溶菌酶 ( ) 和细菌噬菌体产生的溶菌酶 。鸡蛋清溶菌酶 H en Egg - wh ite L ysozym e, H EL 作为动植物中广泛存在 [ 13 ] 的溶菌酶的典型代表 ,是溶菌酶群中研究的重点 ,其三维结构已详细表征 ,由于其含有许多潜在的金 属结合位点 ,因此是最适合作为水解切割研究的蛋白之一 。迄今为止 ,直接针对溶菌酶的化学切割研究 2 + ,采用 SD S - PA GE方法 ,在生理条件下详细研究 Cu促进溶菌酶的水解切割反应 。通过探讨 CuC l 酶 2 [ 14 - 16 ] [ 17 ] ( ) ( ) 较少 ,已采用的过渡金属人工酶也仅仅有 Co III和 Cu II的配合物 。为了进一步探索 Cu 对不同多肽或蛋白的水解切割的差异性以及不同种类金属化合物的切割特异性 ,为过渡金属化合物能 ( )II化合物在蛋白切割方面的规律性 ,依据我们课题组对 CuC l促进氧化胰岛素 B 链 、肌红蛋白的水解 成为实际有应用价值的人工金属酶 ,提供一些有益的参考数据 。 2 ( )切割反应研究的成功经验 ,本文选用鸡蛋清溶菌酶作为目标蛋白 ,以简单 Cu II化合物 CuC l为模拟 2 1 材料与方法 1. 1 试验药品 溶菌酶和低相对分子质量蛋白 M a rke r购自 Sigm a 公司 ,其他化学药品均为市售分析纯药品 。 1. 2 试验仪器 台式离心机 , 9100 2UV 2V is分光光度计 , pH S23C pH 计 , TS21型脱色摇床 ,恒温水浴锅 , B io2R ad M in i2 () P ro tean II电泳仪 U. S. A , Epp endo rf微量移液枪 。 1. 3 溶液配制 ( ) 二次蒸馏水 dd HO 用 于所 有 溶液 的配 制 。溶 菌 酶溶 于二 次 蒸馏 水中 , 制 成浓 度 为 100 m g ? 2 - 1- 1 mL 的水溶液 ,一般使用前新鲜制备 ,溶菌酶的蛋白序列如图 1所示 。 μ( ) ,每 60. 0 L 水溶液中含有 1. 0 m g溶菌酶 。 0. 01 mo l?L CuC l pH = 4. 70 与溶 在切割试验中 2 - 1 1. 4 电泳( )菌酶 100 m g?mL 根据需要配成一定摩尔比的温育样品 , 50 ?下恒温一定时间后 , 加入十倍浓度于 ( )基金项目 :国家自然科学基金项目 20271027 ( ) 作者简介 :蒋 疆 1969 - ,女 ,福建福清人 ,副教授 ,博士 ,研究方向为生物无机化学与配位化学. 收稿日期 : 2009 - 06 - 08 2 + - 1 Cu的 0. 5 mo l?L ED TA 终止反应 。反 应终 μ止后加入 360 L SD S还原缓冲溶液 。将该混合 溶液加热到 95 ?,恒温 5 m in,接着冷却到室温 , μ移取 5 L 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 。聚丙烯酰 氨凝胶电泳在 B io2R ad M in i2P ro tean II电泳仪上 进行 ,分离胶 pH 8. 8 , 18 % 聚丙烯酰胺 ; 浓缩胶 图 1 鸡蛋清溶菌酶序列 pH 8. 6 , 7 %聚丙烯酰胺 ; 电压恒定为 100 V; 用 0. 1 %考马斯亮蓝 R250 染色 。 通过 UV P W h ite /U ltravio le t瞬变显示光密度计扫描确定蛋白的蓝色片段的强度 。通过比较含 Cu ( )( )( )( )II和不含 Cu II的溶液中蛋白片段的相对强度计算切割效率 。含 Cu II和不含 Cu II的溶液中含 ( )有等量的蛋白且试验条件完全相同 ,其中不含 Cu II离子的溶液中完整蛋白的强度为 100 % 。光密度 计测量的相对误差约为 10 % ,因此本研究测量的切割效率可以看作是半定量的 。 1. 5 pH 值测定 用 pH S23C pH 计测量溶液 pH 值 ,以 Phoen ix A g2A gC l作参考电极 ,并用 pH 4. 00 , 7. 00 和 10. 00 的 缓冲溶液定标 。 2 结果与分析 ( )2. 1 C u II浓度对溶菌酶水解切割效率的影响 将溶菌酶与 CuC l按 1 ?1 , 1 ?3 , 1 ?5 , 1 ?10 , 1 ?15 的摩尔比制成温育样 ,在 50 ?下恒温 2 d,聚丙烯酰 2 ( )( )胺凝胶电泳如图 2 a所示 。图 2 a的第 1列是控制实验 ,即溶菌酶中未加 Cu II离子 ,未加 Cu II离子 ( )的条件下溶菌酶未见任何切割现象 ,表明实验中的切割反应确实是由 Cu II引起的 。图 2 a 的第 2 - 5 列中 ,除了未被切割的原料带之外 ,都可以见到两个分子质量大约为 6. 5 Ku和 2. 5 Ku的主要片段带 ,随 着所用 CuC l浓度的增加 ,原料带逐渐变浅 ,下面的两条带随之逐渐变深 ,切割效率明显增大 。由光密 2 度计扫描得到的切割百分率分别为 28. 8 % , 48. 7 % , 75. 1 % , 89. 2 %和 96. 3 % 。这证明所用铜化合物的 2 + 浓度对切割效率有着显著的影响 ,升高 Cu浓度会显著增加切割效率 。当 Cu ?H EL ?10 时 ,切割效率 几乎达到 100 % ,且切割条带不再清晰 。说明切割的选择性已大大降低了 。这与 CuC l切割 M b 实验 2 [ 5 ] 中 ,当二者比例超过 15 ?1时 ,切割的选择性就降低的结果是一致 。 2. 2 温育时间对溶菌酶水解切割效率的影响 为了证实温育时间对切割效率的影响 ,在与图 2 a相同的配比的条件下 , 50 ?恒温 1天 ,得到聚丙烯 酰胺凝胶电泳图 2 b。比较图 2 a与图 2 b可以看出 ,相同摩尔配比的情况下 ,温育 2 d比温育 1 d的切割 2 + 效率增加了很多 ,说明增加反应时间 ,会提高 Cu对溶菌酶的水解切割效率 。 2. 3 恒温温度对溶菌酶水解切割效率的影响 ( )切割效率除了与所用的 Cu II化合物的浓度 、恒温时间密切相关 ,还与恒温温度有关 。研究实验 2 + 表明 ,切割反应对温度非常敏感 ,将溶菌酶与 Cu在 40 ?下恒温 1,3 d,如图 2 c 所示 ,聚丙烯酰氨凝胶 () 电泳显示并没有切割 。而相同配比条件下 图 2 a, 50 ?恒温 2 d即可以得到两条切割带 。若 60 ?下恒 温 1 ,2 d,如图 2 d所示 ,切割效率已是很高了 ,已看不到切割碎片的条带 ,只有轻微的划痕 。这些都说 明一定的恒温温度是切割反应发生的必要条件 ,而在切割反应发生的基础上 ,继续升高温度 ,将会显著 ?62? 河 南 科 技 大 学 学 报 : 自 然 科 学 版 2009年 ( )( )螺旋结构得到拉伸 ,也就是说 Cu II离子与氨基酸侧链配位的空间位阻减小 ,从而使 Cu II离子更易 [ 43 ]2 + ( ) 接近其配位点 ,使得水解切割成为可能 。张琳 、蒋疆等 在 CuC l , [ CuL H O ]切割 M b的试验中表 2 2 明 ,铜对肌红蛋白的选择性切割位点与肌红蛋白的二级结构无关 ,添加尿素只是使切割效率有所提高 , 并不影响切割的片段位置 。这一点与 CuC l切割 H EL 的研究结果是不同的 。 2 图 2中 : a. 50 ?下恒温 2 d; b. 50 ?下恒温 1 d; c. 40 ?下恒温 1 d; d. 60 ?下恒温 1 d; a、b: 1 2 + 为不加铜的空白带 ; 2,5 是溶菌酶与 Cu摩尔 比分别为 1 ?1 , 1 ?3 , 1 ?5 , 1 ?10. c: 1 为不加铜的 2 + 空白带 ; 2,6 是溶菌酶与 Cu摩尔比分别为 1 ?1 , 1 ?3 , 1 ?5 , 1 ?10 , 1 ?15. d: 1 为不加铜的空白 2 + 带 ; 2,7是溶菌酶与 Cu摩尔比分别为 1 ?1 , 1 图 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳图 ?3 , 1 ?5 , 1 ?10 , 1 ?15 , 1 ?20。 在 pH6. 5的水溶液中 , CuC l与溶菌酶以不同的摩尔比 2 2. 5 化学环境对溶菌酶水解切割效率的影响 - 1() μ为了探讨 化学 环境 缓冲 溶 液 对 溶菌 酶 混合并添加 20 L 6. 0 mo l?L 尿素 水解切割的影响 ,实验中引入了不同的缓冲溶液 。图 3 给出的是 CuC l与溶菌酶在纯水溶液 、磷酸盐溶液 、Tris - HC l溶液和碳酸氢 2 氨水溶液中切割反应的凝胶电泳图 。由图 3 可见 , pH 范围在 6. 5 ( ) ,8. 5时 ,选择不同的介质 ,铜 II离子对溶菌酶的选择性切割效 图 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳图 ( ) 率变化不大 。这一点与 Cu II对肌红蛋白的选择性切割情况不 CuC l与溶菌酶在不同缓冲 ( )2 同 ,在这里铜 II离子对溶菌酶的切割并没有缓冲效应 ,其原因有 待进一步研究 。 溶液中 ,以摩尔比 5?1混合 图 3中 : 1为纯水溶液 pH 6. 8; 2 为磷酸盐水溶液 pH 7. 0; 3 为 - 1μ并添加 20 L 6 mo l ?L 的 Tris2HC l水溶液 pH 6. 8; 4 为 Tris2HC l水溶液 pH 8. 8; 5 为碳酸氢 尿素后 ,在 50?下温育 2 d 氨水溶液 pH 8. 3。 3 结论 2 + 在中性条件下 , Cu可以有选择地切割 H EL。切割反应在 pH 6. 5 ,8. 5 范围内进行 ,增加溶菌酶 与 CuC l的摩尔比 、恒温时间和升高温度均能提高切割反应的效率 ,而且铜对溶菌酶的选择性切割反应 2 2 + 与溶菌酶的二级结构有关 。另外 , Cu对溶菌酶的切割没有缓冲效应 。 ( ) ( ) 事实上 ,过渡金属配合物切割溶菌酶的研究实例并不多 ,比较成功的有钴 III和铜 II的水合配 [ 15 ] ( )10. 0和 6. 5 Ku两个片段 ,而 Co III配合物主要将 H EL 切割成约 12. 0 和 2. 0 Ku两个片段 。 CuC l 2 ( )( )合物 。但是 ,钴 III和铜 II的配合物对溶菌酶水解切割的选择性不同 , CuC l主要将 H EL 切割成约 2 ( )( )与 Co III配合物相比 ,体现出更高的切割效率 ,尤其是在高摩尔比的情况下 。Co III配合物只需 37 ? 2 + 就可完成切割 ,而 CuC l需在 50 ?下才能使切割反应发生 。在 CuC l切割肌红蛋白的实验中 ,当 Cu : 2 2 M b 15 ,或者温度大于 60 ?时 , 切割反应的选择性降低 。这与 CuC l切割溶菌酶时的情况相近 , 即 2 2 + Cu?H EL 10 ,或者温度接近 60 ?时 ,切割就没有选择性了 。 ( )( ) 总之 ,铜 II化合物在水解切割蛋白中所体现出来的高选择性和高效率 ,为 Cu II化合物成为有 ( )实际应用价值的切割试剂提供了有价值的理论依据 。当然 ,要使 Cu II成为分析生物化学和蛋白工程 ( )中被广泛接受和采用的试剂 ,还需要对不同的 Cu II配合物以及不同的蛋白进行一系列的试验来确定 其切割效率 、选择性和其他相关的性质 ,特别是选择性切割位点的进一步确定 。研究结果也提示 ,过多 ( ) 地摄入 Cu II离子可能引起对溶菌酶的损害作用 。 参考文献 : ( ) [ 1 ] 姚淑琴 ,郭满栋 . 模拟酶研究进展 [ J ]. 理化检验化学分册 , 2003 , 40 8 : 488 - 490. ( ) ( ) M a rge rum D W , W ong L F, Bo ssu F P, e t a l. Cu II2 and Cu III2Pep tide Comp lexe s[ J ]. A dv Chem Se r, 1977, 162: 281 [ 2 ] - 303. ( ) Grove s J T, B a ron L A. Mode ls of Zinc2con ta in ing P ro tea se s: Ca ta lysis of Coba lt III2m ed ia ted Am ide H yd ro lysis by a [ 3 ] Pendan t Ca rboxyla te [ J ]. J Am Chem Soc, 1989 , 111: 5442 - 5448. [ 4 ] H end ry P, Sa rge son A M. M e ta l Ion P romo ted Pho sp ha te e ste r H yd ro lysis: In tramo lecu la r A ttack of Coo rd ina ted H yd roxide ion [ J ]. J Am Chem Soc, 1989 , 111: 2521 - 2527. ( ) [ 5 ] Zhang L , M e i Y H , Zhang Y, e t a l. R egio se lec tive C leavage of M yoglob in w ith Copp e r IICompound s a t N eu tra l pH [ J ]. Ino rg Chem , 2003 , 42: 492 - 498. ′ [ 6 ] Zhu L G, Ko stiC N M. Se lec tive H yd ro lysis of Pep tide s, P romo ted by Pa llad ium aqua Comp lexe s: Kine tic Effec ts of the L eaving Group , pH , and Inh ib ito rs[ J ]. J Am Chem Soc, 1993 , 115: 4566 - 4570. Zhu L G, Q in L , Pa rac T N , e t a l. Site2sp ec ific H yd ro lytic C leavage of Cytoch rom e C and of Its H em e U ndecap ep tide, [ 7 ] ( ) P romo ted by Coo rd ina tion Comp lexe s of Pa llad ium II[ J ]. J Am Chem Soc, 1994 , 116: 5218 - 5224. ′ ( ) Zhu L G, Ko stiC N M. A c ta H yd ro lytic C leavage of Pep tide s by Pa llad ium IIComp lexe s is Enhanced a s Coo rd ina tion of [ 8 ] ( ) Pep tide N itrogen to Pa llad ium IIis Supp re ssed [ J ]. Ino rg Chem , 1994, 217: 21 - 28. Sun X J , Zhang L , Zhang Y, e t a l. N ew In sigh ts In to the Pa llad ium 2m ed ia ted Se lec tive H yd ro lysis of the H is18 2Th r19 [ 9 ] Pep tide Bond in Cytoch rom e c. [ J ]. N ew J Chem , 2003, 27: 818 - 822. ( ) L uo X M , Cheng X, Zhu L G, e t a l. H yd ro lysis of A ce tyl2m e th ion ine2con ta in ing D ip e tide s P romo ted by Pa llad ium II[ 10 ] Comp lexe s Con ta in ing M e th ion ine2am ino A c ide s a s L igand s[ J ]. Chem L e tt, 1998 , 7: 1079 - 1080. Sayre L M. M e ta l ion Ca ta lysis of Am ide H yd ro lysis[ J ]. J Am Chem Soc, 1986, 108: 1632 - 1635. [ 11 ] [ 12 ] R eddy K V , J acob son A R , Kung J I, e t a l. D iva len t M e ta l Ion Ca ta lyzed H yd ro lysis of P ico linan ilide s [ J ]. Ino rg Chem , 1991 , 30: 3520 - 3525. Jo lle s J. L ysozym e: A Chap te r of Mo lecu la r B io logy[ J ]. A ngew Chem In te rna t Ed it, 1969 , 8: 227 - 294. [ 13 ] Kum a r C V , B u ranap rap uk A , Grego ry J O , e t a l. Pho tochem ica l P ro tea se: Site2sp ec ific Pho toc leavage of hen Egg L ysozym e [ 14 ] and Bovine Se rum A lbum in [ J ]. P roc N a tl A cad Sc i, 1998 , 95: 10361 - 10366. Kum a r C V , B u ranap rap uk A , CHO A , e t a l. A rtific ia l M e ta llop ep tida se s: R egio se lec tive C leavage of L ysozym e [ J ]. Chem [ 15 ] Comm un, 2000, 597 - 598. ( ) ( ) Kum a r C V , THO TA J. Pho toc leavage of L ysozym e by Coba lt ?Comp lexe s[ J ]. Ino rg Chem , 2005 , 44 4 : 825 - 827. [ 16 ] ( ) Yoo S H , L ee B J , Kim H , e t a l. A rtific ia l M e ta llop ro tea se w ith A c tive site Comp rising A ldehyde Group and Cu IICyc len [ 17 ] comp lex[ J ]. J Am Chem Soc, 2005 , 127: 9593 - 9602.