P物质对肉芽组织成纤维细胞bFGF表达的调控作用及意义

P物质对肉芽组织成纤维细胞bFGF表达的调控作用及意义 P物质对肉芽组织成纤维细胞bFGF表达的 调控作用及意义 中华烧伤杂志2003年6月第19鲞笙塑坠!!!!!:!!!!: P物质对肉芽组织成纤维细胞bFGF 表达的调控作用及意义 蒋伟王正国赖西南朱金明朱佩芳 【擅要】目的观察感觉神经肽P物质(substanceP,SP)对离体培养的肉芽组织成纤维细胞中 碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)表达的特点及调控作用.方法采 用甲醛注射的方法造成Wistar大鼠局部无菌性炎性反应,提取肉芽组织进行成纤维细胞原 代培养; 采用RT—PCR方法检测sP对肉芽组织成纤维细胞bFGF基因表达的调控作用,观察时间及 剂量一效应 关系;采用Western—blot方法检测bFGF蛋白表达情况,观察时间及剂量一效应关系.结果10 mol/LSP可诱导成纤维细胞bFGFmRNA的表达,在作用后3,6h与对照组比较,差异有非常 显着性 意义(P<0.01);12h后可检测到bFGF蛋白表达明显增强(P<0.01),24h达高峰,48h后逐渐 回 落.sP在10一,10.mol/L范围内可显着促进成纤维细胞bFGFmRNA表达,在10,10mol/L 范围可诱导bFGF蛋白的表达,均在10mol/L剂量点达到峰值(P<0.O1).结论sP可诱导肉 芽组织成纤维细胞bFGF基因和蛋白的表达,且呈现出一定的时间和剂量特点,在SP调控创 伤愈合 的作用中具有重要意义. 【关t词】P物质;成纤维细胞生长因子,碱性;基因表达;创伤愈合 RegulativeeffectsandsignifianeeofsubstancePontheexpressionofbasicfibroblastgrowthfactorofgranula— tiontissuefrbroblstsinvitroJIANGWei.WANGZheng—guo.LAIXi—NaN.ZHUJin—ruingZHU Pei—hng.InstituteofFieldSurgery.DapingHospita1.TheTh.dMilitaryMedicalUniversity.Chongqing 4ooo42.P.R.Chma 【Abstract】0bjectiveToexploretheregulativeeffectsandsignificanceofneuropeoptidesubstanceP (SP)ontheexpressionofbasicfibroblastgrowthfacor(bFGF)ofgranulationtissuefibroblastsinvitro. MethodsAlocalasepticinflammationwasindticedbyinjectionofformaldehydeinrats.anditsgranulation tissuewascultured.RT—PCRwasemployedtoobserveexpressionofbFGFmRNAafterinducementofSPat dif_ferentconcentrationsandtimepointsinthegranulationtissue.andwesternblottoassayexpressionofbF— GFprotein.ResuhsTheexpressionofbFGFmRNAwasmarkedlyincreasedsignificantly3and6hours afterinducementwithSPin10,mol/L.comparedwithcontrolgroup(P<0.01).TheexpressionofbF— GFproteinwasmarkedlyhigherthanthecontrolgroupafter12hours,anditreachedthepeakatthe24th houranddeclinedgraduallyafter48hours.SPatconcentrationsof10,,10.mol/Lcouldsignificantly promotetheexpressionofbFGFmRNA.andthatat10,一 10.mol/LinducetheexpressionofbFGFpro— tein.BothexpressionsreachedthepeakwhenSPconcentrationwas10mol/L(P<0.01).Conelusion SPcaninducetheexpressionsofbFGFmRNAandbFGFproteinofgranulationtissuefibroblastsinvitro. whichmaypossessanimportantsignificanceinwoundhealing. 【Keywords】Substance;Fibroblastgrowthfactor,basic;Geneexpression;Woundhealing 近年研究表明,创伤愈合时,支配受损组织的周 围神经通过释放包括神经肽(neuropeptide)在内的 介质,如P物质(substanceP,SP),参与伤口愈合的 调控.而在创伤愈合过程中,由修复细胞自分泌 和旁分泌的生长因子是创伤愈合的重要调控因素. 但目前,关于外周神经与伤口局部组织相互作用的 精细调控过程和机制,以及外周神经释放的感觉神 经肽与伤口愈合细胞因子网络调控之间的关系,尚 不十分清楚.本课题组前期的研究表明,在大鼠皮 肤全层切割伤模型中,局部组织中的SP对成纤维细 作者单位:400042重庆,第三军医大学大坪医院野战外科研究所 ? l59 ? 论着? 胞和内皮细胞碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的 表达可能具有重要的调控作用(另文报道).鉴于 在体内实验中,影响细胞因子表达的因素很多,笔者 采用体外原代肉芽组织成纤维细胞培养法,探讨sP 对该类细胞bFGF表达的调控作用. 材料与方法 1.动物及细胞培养:健康雄性Wistar大鼠,体重 250,300g.参照朱旭东等的方法稍作改进,进 行肉芽组织成纤维细胞原代培养.具体方法如下: 采用质量浓度l0g/L戊巴比妥钠35mg/kg腹腔注 射麻醉,剃除大鼠左后肢内侧毛发,肌肉注射质量浓 中华烧伤杂志2003年6月第19卷第3期ChinJBurns,June2003,Vo1.19,No.3 度20g/L甲醛0.6ml.5d后,在无菌条件下用眼 科剪将形成的肉芽组织取出,并将其剪成0.5,1.0 cm大小,均匀放置于250ml培养瓶中,加入含体积 分数为10%胎牛血清(FCS)的DMEM10ml,倒置 于体积分数为5%CO培养箱(德国Heraeus公司) 中孵育,适时传代.实验采用3,5代细胞. 2.RT—PCR法检测bFGFmRNA的表达:(1)总 RNA提取与定量:将成纤维细胞接种于24孔培养 板上,细胞贴壁后用含体积分数0.5%FCS的 DMEM饥饿12h,再经sP作用(分别选用l0一, 10mol/L共5个剂量点和0,3,6,12,24h共5个 时相点)后,弃去培养液,加入tripure0.3ml/~L,超 声破碎,再加入氯仿0.05ml,室温孵育15min后, 12000Xg离心15min(4?),将上清转移至0.5 ml离心管中,加入异丙醇0.15ml,室温孵育l0 min,12000Xg离心10min(4?),弃上清,加入 体积分数为75%的乙醇0.3ml,涡旋,7500Xg 离心5min(4?),弃上清,用DEPC水再悬浮 RNA,60oC水浴15min.采用DV一640紫外分光光度 计定量后分装,一70?保存.(2)逆转录:逆转录试 剂盒购自上海生工公司,按说明书操作.(3)PCR: 引物由上海生工公司合成.B—actin上游5.ATC ATG,IvI’TGAGACCTTCA.3,下游5一CATCTC TTGCTCGAAGTC一3(318bp);bFGF上游5’一GCA GCATCACTTCGCTTCC一3,下游5-TGGAAG AAACAGTATGGCCTTCTG-3(437bp).反应条 件为:94oC预变性3min,94?45S,60oC1min,72? 2min,30个循环后,72?延伸10min.(4)PCR产 物检测:采用质量浓度10g/L琼脂糖电泳溴乙锭染 色法,用MIG凝胶分析系统检测.PCR特异条带以 相对吸光度X面积表示,以各组的校正吸光度与其 p-actin校正吸光度的比值表示.每组实验重复5次. 3.Western-blot法检测bFGF蛋白的表达:(1) 细胞浆蛋白的提取与定量:将原代成纤维细胞接种 于直径10cm培养板上,细胞贴壁后用含体积分数 0.5%FCS的DMEM饥饿12h,再经SP作用(分别 选用l0一,10mol/L共5个剂量点和0,6,12, 24,48h共5个时相点)后,采用超声破碎和超速离 心的方法提取细胞浆蛋白.采用考马斯亮蓝法定量 后分装,一70?保存.(2)电泳,转印,杂交及化学 发光检测:分别取各组样品30g(201)+20txl2 X上样缓冲液,煮沸5min,上样,完毕后在50V电 压下电泳30min,然后在80V电压下电泳3h,在电 转槽内,使用20V电压,4~C恒压电转17h,取出 PVDF膜,置膜固定液中固定15min,于60g/L牛奶 中封闭,4~C过夜.取出PVDF膜,置于1:500的一 抗(兔抗大鼠bFGF)中反应1h,再置于1:4000稀释 的二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG)中反 应45min.在暗室中,采用化学发光反应试剂盒进 行检测.每组实验重复4次. 4.统计学处理:数据以x?s表示,用SPSS10.0 统计程序包行单因素方差分析一均数间差别多重比 较的LSD(1eastsignificantdifference)检验. 结果 1.SP对肉芽组织成纤维细胞bFGFmRNA表达 的时间一效应关系:应用l0.mol/LSP刺激成纤维 细胞后,其促bFGFmRNA表达的效能与对照组相 比,在sP作用3,6h时明显增高(P<0.01),12h 后与对照组比较,差异无显着性意义(P>0.05). 见表1,图1. 表1SP促bFGFmRNA表达的时间一效应关系(x?s) Tab1Relationofthetimeandeffectofexpression ofbFGFmRNAinducedbySP(?s) 注:与对照组比较,P<0.01 BactiOn bl:GF 2bp 3{】()bD 400bp X)【M) 0:361224n~wker36l224 表达时问(h) 图1SP对bFGFmRNA表达的时间.效应关系 Fig1RelationofthetimeandeffectofexpressionofbFGFmRNA inducedbySP 2.SP对肉芽组织成纤维细胞bFGFmRNA表达 的剂量一效应关系:分别使用l0,,10mol/LSP 作用于成纤维细胞3h后,SP在l0一,10mol/L 范围内均可以显着促进成纤维细胞bFGFmRNA表 达,在l0mol/L达到峰值(P<0.01).见表2,图2. 表2SP促bFGFmRNA表达的剂量一效应关系(x?s) Tab1RelationofthedoseandeffectofexpressionofbFGF mRNAinducedbySP(x?s) 注:与对照组比较,P<0.05,P<0.01 中华烧伤杂志2003年6月第19卷第3期ChinJBurn!,!,o1.!!!: 图2SP对bFGFmRNA表达的剂量一效应关系 Fig2RelationofthedoseandeffectofexpressionofbFGFmRNA inducedbySP 3.SP对肉芽组织成纤维细胞bFGF蛋白表达调 控的时间一效应关系:使用10mol/LSP作用培养 的肉芽组织成纤维细胞12h后,可检测到明显的 bFGF蛋白表达(P<0.01),表达高峰出现在作用 后24h,48h有所回落,但仍非常显着地高于对照组 (P<0.01).见表3,图3. 表3SP促bFGF蛋白表达的时间一效应关系(x?s) Tab3Relationofthetimeandeffectofexpression ofbFGFproteininducedbySP(x?s) 注:与对照组比较,P<0.0l ?彝囊葬 对j联gl 鼍_ j 霉一i. 调控I『,jM{h) 图3SP对bFGF蛋白表达调控的时间-效应关系 Fig3RelationofthetimeandeffectofexpressionofbFGFproteinin- ducedbySP 4.SP对肉芽组织成纤维细胞bFGF蛋白表达调 控的剂量.效应关系:分别使用10一,10mol/L剂 量的SP,作用培养的肉芽组织成纤维细胞24h后,在 10,,10.mol/L剂量范围内,SP均能非常显着地刺 激bFGF蛋白表达,P值均<0.01,表达高峰出现在 10mol/L剂量点.见表4,图4. 表4sP促EGF蛋白表达的剂量一效应关系(x4-s) Tab4Relationofthedoseandeffectofexpressionof bFGFproteininducedbySP(x4-s) 注:与对照组比较,P<0.0l 对照1(l01(1l0I 明控制f建(,qlo) 图4SP对bFGF蛋白表达调控的剂量-效应关系 Fig4RelationofthedoseandeffectofexpressionofbFGFproteinin- ducedbySP 讨论 创伤愈合是以成纤维细胞增殖,迁移,肉芽组织 形成,胶原分泌,创口胶原化瘢痕形成及改建为特点 的过程,成纤维细胞参与了创伤愈合的全过程,在其 中起到重要作用.研究在创伤愈合过程中成纤维 细胞的功能状态,对于认识和促进创伤愈合具有重要 意义.在创伤愈合过程中,由修复细胞自分泌和旁分 泌的多种生长因子起着重要的调控作用.bFGF是其 中的一种,它可刺激成纤维细胞的增殖和胶原的合 成,还可促进内皮细胞的移行和增殖,或通过激发巨 噬细胞产生FGF和其他血管形成因子,促进血管生 成.可见bFGF通过多个环节影响创伤愈合. 神经肽在神经系统和损伤组织之间起着重要的 桥接作用,参与对修复细胞增殖,迁移,分化的调 控.神经肽SP是具有多种生物活性的小分子多 肽,主要在脊髓背根神经节合成,在受到伤害性刺激 时,sP主要作为疼痛递质向上传递至中枢神经系统, 也可逆向释放入损伤局部组织中,启动神经源性炎症 反应,还可诱导肺成纤维细胞以及血管内皮细胞增 殖.因而,sP被认为是周围神经参与局部伤口愈合 的重要介导因子.关于SP与不同生长因子在创伤修 复中的相互作用已有文献报道,但SP与这些因子表 达的关系鲜见报道.Ziche等的研究表明,sP在体 外能诱导内皮细胞的增殖和迁移,在体内也可促进新 生血管的形成.随后Marina等证实这一作用是通 过诱导内皮细胞分泌内源性bFGF实现的.本实验 结果表明,SP在体外可诱导肉芽组织成纤维细胞表 达bFGF,从而促进成纤维细胞增殖,加速肉芽组织的 形成,促进伤口愈合.诱导生长因子FGF的表达,可 能是sP促进伤口愈合的重要分子生物学机制之一. 我国在20世纪90年代中期,就应用基因工程技 术生产出国际上第一个应用于促进创面愈合的国家 一 类新药——重组牛bFGF,在临床上应用可使浅? 度,深?度烧伤创面,供皮区创面的愈合时间较常规治 疗提前2,4d,尤其是可使过去采用常规方法难以治 愈的慢性难愈性创面愈合.有研究表明,大鼠肩胛 中华烧伤杂志2003年6月第l9卷第3期ChinJBurns,June2003,Vo1.19,No.3 区皮肤烧伤时,伤区注射外源性sP可使创面愈合时 间缩短近1/2,提示应用外源性sP也将有助于伤 口的愈合.本实验结果显示,sP调控FGF的表达并 非”剂量依赖性”的,对于使用的剂量和时机尚需更进 一 步的研究.值得注意的是,sP在血浆中会迅速被 灭活,外源性sP的半衰期不到30S,因此,笔者认为 从改善和调控创伤后神经功能状态人手,促进伤口的 愈合,这将是今后一个新的研究思路和发展方向. 参考文献 1SchafferM,BeiterT,BeckerHD,etalNeuropeptidesPmediatorin- flammationandtissuerapair.ArchSurg,1998,13:1107—1116. 2朱旭东.张艳,陈荣德,等.肉芽组织修复细胞的简易培养方法.中 国修复重建外科杂志,1994,8:157. 3秦全红.王德文.成纤维细胞在皮肤创伤愈合中的作用及其调控. 国外医学?创伤与外科基本问题分册,2000,21:33—38. 4EvansAR,JungerH,SouthallMD,eta1.Isoprostamcesnoveleico- sanoidsthatproducenociceptionandsensitizeratsensoryneurons.J PharmacolExpTher,2000.293:912—920. 5ZicheM,MorbidelliL,MasiniE,eta1.Nitricoxidemediatesangiogen- esisinvivoandendothelialcellgrowthandmigrationinvitropromoted bysubstanceP.JclinInvest.1994.94:2036—2044. 6MarinaZ,AstridP,FabrizioL,eta1.Nitricoxidepromotesprolifera- lionandplasminogenactivatorproductionbycoronaryvenularendothe- liumthroughendogenousbFGF.CircRes,1997,80:845—852. 7付小兵,盛志勇,王正国.我国创伤修复基础应用研究lO年的主要 成就与展望.中华创伤杂志,2002,l8:389—390. 8AverloeckB.IzydozezykI.KressM.Inflammatorymediatorsrelease calcitoningene-relatedpeptidefromdorsalrootganglionneuronofrat. Neuroscience,2000.98:135—140. (收稿日期:2002—07—02) (本文编辑:赵云) 救治烫伤面积100%TBSA患者一例 王公升石富胜张会堂张明卿徐根贤 临床资料:患者男,45岁,因酒醉后两次跌入90?水池中 烫伤全身,伤后5h入院.查体:患者神志恍惚,烦躁不安,口 唇干裂,全身寒颤,四肢湿冷.体温36~C,心音弱,心率120 次/min,呼吸音粗,26次/min,血压107/80mmHg(1mmHg: 0.133kPa).全身皮肤,头皮皆被烫伤,大部分腐皮脱落,双 上肢,躯干创面基底红润或红白相间,双下肢,臀部创面基底 苍白,痛觉消失,头,面,颈部创面基底红润.导出酱油色尿 30ml.既往因肠梗阻,部分小肠坏死曾经手术3次.诊断: (1)100%热水烫伤,其中?度52%,深?度40%,浅?度8% TBSA;(2)低血容量性休克. 住院后立即行下肢静脉切开快速补液,伤后第1个24h 输入液体13000ml,电解质与胶体比例为1:1.5,尿量维持在 60,100ml/h.伤后2d,患者体温39.5~C,心率140,150次 /min,出现谵语,腹胀,创面加深.伤后4d,下肢创面出现散 在坏死斑,血小板20×10/L.伤后5d,行四肢,前躯干切削 痂自体微粒皮移植术,切削痂面积达60%TBSA,头皮削痂后 取二,三茬皮行双下肢微粒皮移植,其余手术创面用大张冷 冻异体皮覆盖.术后2d,患者呼吸急促30,45次/min,进行 性呼吸困难,SaO20.80,PaO27.2kPa(1kPa=7.5mmHg),确 诊为急性呼吸窘迫综合征(ARDS).术后5d左下肢异体皮 坏死,出现创面脓毒症,电解质及各脏器功能异常.术后9 d,患者出现应激性消化道出血,便血,呕血约1800ml/d,查 血红蛋白60g/L,伤后1个月各检测指标平均值见表1.给 予对症治疗:(1)早期大剂量应用地塞米松(320mg/d)及山 莨菪碱(250mg/d);(2)在局麻下取患者亲属的头皮刃厚皮 3人次覆盖创面,为自体皮植皮赢得了宝贵时间.患者住院 作者单位:037006大同,解放军第三二二医院烧伤整形科 ? 病例? 治疗109d,共取自体头皮10次.出院时能下地行走,生活基 本自理. 表1患者伤后1个月内各检测指标平均值(?s) 检测项目检测次数平均值正常值 讨论本病例为100%TBSA特重度烫伤,伤后5h内 未补液.治疗过程中先后出现创面侵袭性感染,创面脓毒 症,多脏器功能障碍,ARDS,应激性上消化道出血.因皮源 有限,首次以患者家属头皮作为异体皮来源覆盖一次性大 面积切削痂创面,缓解了创面脓毒症的进一步发生;利用患 者自身的二,三茬头皮进行微粒皮移植,有效地控制了病情 的发展.大剂量应用地塞米松及山莨菪碱,有效控制了创 面脓毒症及ARDS的恶化,对血管内皮细胞起到了一定的 保护作用”,但应激性上消化道大出血除与病情恶化有关 外,不能排除大剂量应用地塞米松带来的副作用. 参考文献 1石富胜,罗向东,杨宗城,等.蜕皮激素对LPS致培养HUVEC凋 亡的实验研究.中华烧伤杂志,2001,17:39—41. 2石富胜,狄桂萍,罗向东,等.五种中药对内毒素致体外VEC能 量代谢的保护作用.解放军医学杂志,2001,26:429—431. (收稿日期:2002—02—19) (本文编辑:王旭)