抗体纯化大全

抗体的纯化 第一节硫酸铵沉淀法 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 试剂及仪器 ·组织培养上清液、血清样品或腹水等 ·硫酸铵(NH4)SO4 ·饱和硫酸铵溶液(SAS) ·蒸馏水 · PBS(含0.2g/L叠氮钠) (见附录一) ·透析袋 ·超速离心机 · pH计 ·磁力搅拌器 实验步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。 一、配制饱和硫酸铵溶液(SAS) 将767g(NH4)2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液(4.1 mol/L, 25°C); 其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表1; 二、沉淀 1、样品(如腹水)20 000′g 离心30 min,除去细胞碎片; 2、保留上清液并测量体积; 3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中,终浓度为1:1(v/v); 4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜(4°C),使蛋白质充分沉淀。 三、透析 1、蛋白质溶液10 000′g 离心30 min(4°C)。弃上清保留沉淀; 2、将沉淀溶于少量(10-20ml)PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L 叠氮钠透析24-48小时(4°C),每隔3-6 小时换透析缓冲液一次,以彻底除去硫酸氨; 3、透析液离心,测定上清液中蛋白质含量。 应用提示 一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀,除去样品中的杂蛋白。 1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中,使浓度为0.5:1 (v/v); 2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜(4°C); 3、3000′g 离心30 min(4°C),保留上清液; 4、上清液再加SAS到0.5:1 (v/v),再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS,同前透析,除去硫酸氨; 5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时,用预沉淀除杂蛋白是非常有效的; 二、为避免体积过大,可用固体硫酸氨进行盐析(硫酸氨用量参考表1); 三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用,可得到更进一步纯化的抗体。 参考文献 1、Burd, R.S., Raymond, C.S., Ratz, C. A and Dunn, D.L (1993) A rapid procedure for purifying IgM monoclonal antibodies from murine ascites using a DEAE – disk. Hybridoma 12, 135. 2、T.G.库珀着,徐晓利主译《生物化学工具》人民卫生出版社出版(1980),353。(夏泉) 表1.室温下硫酸氨饱和度由起始浓度(S1)提高到终浓度(S2)时需加硫酸氨的量(g/L) 0% 10% 20% 25% 30% 33% 35% 40% 45% 50% 55% 60% 65% 70% 75% 80% 90% 56 114 144 176 196 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 662 767 57 86 118 137 150 183 216 251 288 326 365 406 449 494 592 649 29 59 78 91 123 155 189 225 262 300 340 382 424 520 619 30 49 61 93 125 158 193 230 267 307 348 390 485 583 19 30 62 94 127 162 198 235 273 314 356 449 546 12 43 74 107 142 177 214 252 292 333 426 522 31 63 94 129 164 200 238 278 319 411 506 31 63 97 132 168 205 245 285 375 469 32 65 99 134 171 210 250 339 431 33 66 101 137 176 214 302 392 33 67 103 141 179 264 353 34 69 105 143 227 314 34 70 107 190 275 35 72 153 237 36 115 198 77 157 79 第二节DEAE离子交换层析法 基本原理 离子交换层析是蛋白质纯化的常规方法,与硫酸氨沈淀法联合使用可以非常有效地纯化抗体。 DEAE是一种阴离子交换剂,当蛋白质溶液通过DEAE柱时,带负电荷的蛋白质可以被DEAE 吸 附,带正电荷的蛋白质则不被吸附而随溶液流出。纯化抗体时可选择pH值大于待纯化抗体等电 点的缓冲液,此时抗体带负电荷可以通过电价键吸附于DEAE离子交换剂上,然后用增加盐浓度 的方法将抗体洗脱。可以用连续梯度法洗脱,也可以用不连续梯度(分段洗脱)法洗脱。本文以 腹水中mAb的纯化为例来介绍此方法。 试剂及仪器 ·抗体样品(小鼠腹水或经硫酸氨沉淀的抗体) · DEAE离子交换剂(阴离子交换剂) ·层析柱(2.5cm? ′ 20 cm) ·缓冲液A:25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +35 mmol /L NaCl ·缓冲液B:25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +70mmol /L NaCl ·缓冲液C:25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +500 mmol /L NaCl ·缓冲液D:25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 · PBS (见附录一) ·透析袋(MW CO 10 000) ·磁力搅拌器 ·蠕动泵和部分收集器 ·紫外检测仪 ·梯度发生器 ·电导仪 · pH计 ·离心机 实验步骤 整个层析过程最好在4°C 进行,可在冷室操作; 1、抗体样品对缓冲液B 透析过夜(4°C); 2、按说明处理DEAE离子交换剂。然后用缓冲液A 平衡。用20倍体积缓冲液A洗交换剂,可用过滤或离心法反复洗到流出液的电导率等于缓冲液A; 3、将处理好的DEAE离子交换剂悬浮在缓冲液A 中,装入层析柱。 4、用等体积的缓冲液D 稀释透析过的抗体样品,使之与缓冲液A 的离子强度一致; 5、稀释后的样品10 000′g 离心10 min(4°C),除去沉淀变性的蛋白质; 6、层析柱与蠕动泵、部分收集器及紫外检测仪连接; 7、抗体样品以1ml/min 流速上柱,然后用缓冲液A 洗柱1ml/min,将未吸附的蛋白质洗出。直到流出液在280 nm 的吸光度小于0.05; 8、吸附的蛋白质,用连续增加NaCl的浓度来洗脱。用线性梯度缓冲液(35-500 mmol/L NaCl)或分段缓冲液(35、70、140、280、500 mmol/L NaCl)洗脱。流速1ml/min ,分部收集洗脱液2ml / 管(图2-4-1); 9、椐紫外检测结果,将抗体峰部分合并。装入透析袋对PBS(含0.2g/L叠氮钠)4°C 透析或冷冻(视抗体的稳定性而定); 10、DEAE离子交换剂可按照商品说明再生使用。 图2-4-1 DEAE离子交换柱层析纯化小鼠IgG 流速:1ml/min 样品:0.5ml腹水 检测方法 1、大部分小鼠的单克隆抗体IgG可在50—200mmol/L NaCl浓度之间洗脱。 2、可用SDS-PAGE 或定量免疫学方法(RIA、ELISA)检测各部分洗脱液的抗体存在及效价。实验要点及说明 1、要得到满意的分离结果,每ml DEAE 离子交换剂所加样品中蛋白质总量最好不超过10mg。 2、用经硫酸铵沉淀初步纯化的抗体代替小鼠腹水作为样品,可得到更好的纯化结果。 3、如抗体与DEAE离子交换剂不能有效的结合,可将起始缓冲液的pH提高0.1个单位,直到可以有效结合为止。 4、如果没有合用的蠕动泵和部分收集器,可用手工上样和收集。洗脱液每管收集0.5-2ml ,然后用分光光度计测定各管280nm波长的吸光度值。 5、该方法可按比例扩大。用适合于高流速的大柱和相应的交换剂来纯化大量的蛋白质样品。参考文献 1. Corthier, G., Boschetti, E. and Charley-Poulain, J. (1984) Improved method for IgG purification from various animal species by ion exchange chromatography J. Immunol. Meth . 66, 75-79. 2、张保真编译西安医科大学出版(1986)《免疫组织化学理论与技术》69-71。 (夏泉) 第三节羟磷灰石层析纯化抗体 基本原理 羟磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2]吸附蛋白质的机理,通常认为与其晶体表面的Ca2+ 和PO43- 两种基团相关。因为带电基团紧密排列于晶体表面,可能通过偶极子之间的相互作用来吸附蛋白质。样品被吸附剂吸附后,用适当的洗脱液(较高浓度的盐溶液)冲洗,可使之解析。解析下来的物质在流经层析柱的过程中向前移动,遇到前面新的吸附剂可再被吸附。在反复的吸附—解析—再吸附—再解析的过程中,由于待分离物质与吸附剂之间的吸附能力不同,它们沿洗脱液流动方向移动的速度也不相同,所以在洗脱过程中各组分便会由于移动速度不同而被分离。抗体与其它蛋白质一样可以用羟磷灰石吸附柱层析进行纯化。 试剂及仪器 ·抗体样品(腹水或培养上清液) ·羟磷灰石(Hydroxylapatite 有售) ·层析柱(2.5cm? ′ 20 cm) ·吸附缓冲液:20mmol/L 磷酸钾缓冲液pH6.8 含30mmol /L NaCl ·洗脱缓冲液:500mmol/L 磷酸钾缓冲液pH6.8 含30mmol /L NaCl · PBS (见附录1) ·透析袋(MW CO 10 000) ·磁力搅拌器 ·蠕动泵和部分收集器 ·紫外检测仪 ·梯度发生器 ·离心机 实验步骤 1、羟磷灰石柱的准备:将羟磷灰石悬浮于吸附缓冲液中,使之充分水合后装柱。用10′ 柱体积的吸附缓冲液洗柱; 2、样品的预处理:含抗体的样品先在4°C对吸附缓冲液透析过夜或用该缓冲液10倍稀释,再将透析或稀释后的样品4 000′g 离心15min(4°C); 3、仪器安装:将蠕动泵、紫外检测仪和部分收集器与层析柱连接; 4、上样:将样品上清液以1ml/min的流速加到柱上,然后用20′ 柱体积的吸附缓冲液洗柱; 5、抗体的洗脱:提高磷酸盐的浓度可以将抗体洗脱。常用的方法有两种:一种是用梯度发生器进行线性浓度梯度洗脱,浓度为20—500 mmol/L的磷酸钾缓冲液;另一种方法是用不连续浓度梯度洗脱,例如可以用35、70、140、280和500 mmol/L的磷酸钾缓冲液依次分段洗脱。收集洗脱液2ml / 管(图2-4-2); 6、合并洗脱液中含抗体的部分(见下面检测)对PBS透析。根据抗体的稳定性4°C或冷冻 防腐(0.2g/L 叠氮钠)保存; 图2-4-2 羟磷灰石柱层析纯化单克隆抗体IgG 流速:1ml/min 样品:腹水1ml 检测方法 1、单克隆抗体IgG通常在200—400mmol/L磷酸钾浓度之间洗脱。 2、可用SDS-PAGE 或定量免疫学方法(RIA、ELISA),检测各部分洗脱液的抗体。 应用提示 1、每100ml 羟磷灰石可吸附大约500 ml细胞培养上清液或3 ml 的腹水或血清中所含的抗体。 2、使用羟磷灰石柱较适合的柱长/直径可以在5/1—15/1之间(典型尺寸:2.5cm ?′20 cm 柱长)。 3、在吸附过程中应避免有对钙的亲和力大于磷酸盐的物质(如EDTA和柠檬酸等)的存在,以免减少羟磷灰石的吸附容量。 4、用过的羟磷灰石柱可以用吸附缓冲液平衡再生后重复使用。或加入甲苯(0.03%,v/v)或叠氮钠(0.2g/L)储存。 5、如果没有合适的蠕动泵和部分收集器,可手工加样和收集洗脱液2ml / 管,并用分光光度计 测定各管在280nm 波长的吸光度。 6、与本方法类似的吸附和洗脱过程也可用来纯化其它蛋白质。 参考文献 Bukovsky, J. and Kennett, R.H. (1987) Simple and rapid purification of monoclonal antibodies from cell culture supernatant and ascites fluids by hydroxylapatite chromatography on analytical and preparative scales. Hybridoma 6 ,219-228. (夏泉) 第四节抗体的辛酸纯化法 基本原理 在人、羊或兔血清或含有IgG的培养上清中及小鼠的腹水中加入辛酸, 可与其中大部分蛋白质形成沉淀,而对IgG的性质没有影响,因此是纯化IgG的有效途径。沉淀后经离心即可获得IgG。辛酸沉淀法与硫酸铵沉淀法比较其主要优点为可减少聚合物的形成,但与其相同,所得的抗体纯度不够,还需用其它方法以进一步提高其纯度。 试剂及仪器 s 腹水或细胞培养上清 s 0.06 mol/L醋酸钠缓冲液(pH4.0)(见附录1) s 1N HCl s 辛酸(正-八碳酸,n-octanoic acid) s 1N NaOH s PBS(见附录) s 透析袋(MWCO 10,000) s 电磁搅拌器 s 离心机 操作步骤 1.用烧杯加20ml 0.06 mol/L醋酸钠缓冲液(pH4.0)到10ml腹水或细胞培养上清中; 2.用1N HCl调节pH到4.8,后滴加辛酸同时用力搅拌,具体用量参见表1; 3.在室温下继续搅拌30分; 4.5,000 ×g 室温离心30分,保留上清; 5.用1N NaOH 调节pH到5.7; 6.含有IgG的上清对PBS透析,然后分装、置-20℃保存。 表1 沉淀不同来源IgG的辛酸参考用量 IgG来源辛酸用量(每10ml腹水或上清) 小鼠400μl 人700μl 羊700μl 兔750μl 质量检察 上清中IgG的纯度可用SDS-PAGE分析及合适的酶标免疫测试法测定其免疫活性来确定。 上清中可能存在少量杂质,可通过DEAE离子交换层析除去。 参考文献 1. Russo,C., Callegaro,L.,Lanza,E., and Ferrone,S. (1983) Purification of IgG monoclonal antibody by caprylic acid precipitation. J. Immunol. Meth. 65,269-271 2. Steianbuch,M. and Audran,R. (1969) The isolation of IgG from mammalian sera with the aid of caprylic acid. Arch.Biochem.Biophys. 134, 279-284 (朱正美) 第五节Sephadex凝胶过滤纯化抗体 基本原理 凝胶过滤又称分子筛层析。是一种借助分子筛效应将分子大小不同的混合物进行分离的方法。交联葡聚糖凝胶Sephadex是常用的层析介质。它是一种含有许多网眼的球形小颗粒,网眼大小分布均一。当分子大小不同的混合物通过凝胶柱时,其中较大的分子不能进入凝胶网眼,将毫无阻力或阻力很小地随洗脱液流出,而小分子物则能扩散进入网眼,被阻滞在层析柱上,分子量越小,扩散出来所耗时间就越长。因此分子大小不同的MoAb可以借助分子筛效应进行分离提纯。本文以IgM的纯化为例介绍此方法。IgM因分子特别大(900 kd)而不能进入凝胶颗粒的网孔,可首先被洗脱达到初步纯化的目的。 试剂和器材 · Sephadex G 100 或G 200 ·粗制IgM-MoAb培养物或抗血清,腹水等 ·洗脱缓冲液:0.01mol/L Tris-HCl缓冲液pH 8.0 含0 .5mol /L NaCl ·层析柱(1.0 cm? ′ 30 cm或1.5cm? ′ 40 cm) ·透析袋(MW CO 10 000) ·磁力搅拌器 ·部分收集器 ·紫外检测仪 ·离心机 步骤 1、样品处理:将腹水、抗血清或培养上清液离心4000′g 20分钟,以除去细胞碎片。较稠的腹水和血清需适当稀释; 2、装柱:根据样品量选择合适的层析柱,将0.01mol/L pH 8.0 含0 .5mol /L NaCl的Tris-HCl 缓冲液加到柱长的1/4处,然后将漂洗溶涨的Sephadex G 100 或G 200 倾入柱中,自然沉降30分钟,再用同样的缓冲液平衡柱1小时,流速0.5ml/min; 3、仪器连接:将紫外检测仪和部分收集器与层析柱连接; 4、上样和洗脱:待柱上平衡缓冲溶液接近凝胶上表面时,缓慢加入样品溶液0.5ml/min。当样品液面接近凝胶上表面时,加少量缓冲液清洗柱壁,然后接上缓冲液洗脱并收集1-2 ml/管。280nm 检测的第一蛋白峰即为IgM-MoAb。 5、浓缩与保存:将280nm检测的第一蛋白峰合并,移入透析袋在磁力搅拌器上4°C对PBS 流动透析过夜。透析后的溶液可经聚乙二醇或五氧化二磷真空干燥浓缩后,分装封管,-20°C 保存备用。 检测 1、可用SDS-PAGE 或定量免疫学方法(RIA、ELISA)检测各部分洗脱液的抗体。 2、IgM-MoAb一般在外水体积洗脱。 应用提示 1、凝胶过滤不变换洗脱液,一次装柱后可反复使用多次。操作简单,快速经济。 2、实验可重复性高,样品回收几乎可达100%,且方法温和,不易引起生物样品变性失活,可进行大量样品的分离纯化。 3、用于小分子物(如无机盐)从大分子物(MW>20 000)分离的层析柱,柱体积应大于样品体积4-10倍,其高与直径的比例应为5:1-15:1;用于大分子物之间的分离(如免疫球蛋白之间的分离),则柱体积应大于样品体积25-100倍,高与直径的比例应为20:1-100:1。 4、Sephadex凝胶装柱时,应灌制均匀无断层和气泡。在整个操作过程中,凝胶应始终保持在液面以下。 5、提取的IgM浓度过低或反复冻融会引起变性,应分装后在-70°C或-20°C冻存,或者加0.2g/L叠氮钠在4°C可保存数月。 6、如无合用的部分收集器,可手工收集1-2ml/管,用分光光度计测定各管吸光度值。 参考文献 1、周本正编着《层析技术及其应用》湖北科学技术出版社(1992)28-30 2、M.Z.阿塔西, C.J.范奥斯, D.R.阿勃索洛姆主编郑昌学,吴安然等译《分子免疫学》科学出版社(1988) 212-214 第六节免疫球蛋白G的亲和层析纯化法(蛋白A或蛋白G法) 基本原理 蛋白A是金黄色葡萄球菌的细胞壁(cell wall)(cell wall)成分。蛋白G是G组链球菌的细胞壁(cell wall)(cell wall)成分。这两种蛋白质分子可通过免疫球蛋白的FC区和大多数哺乳动物(mammal;mammalian)(mammal;mammalian)的IgG结合(见表1)。利用基因工程(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)技术,将蛋白A和蛋白G分子中与Fc区结合的结构域部分的基因融合,所产生的融合蛋白,则具有更广泛的IgG结合特异性。蛋白A、蛋白G或融合蛋白A/G与免疫球蛋白Fc段的结合性能使它成为可用于IgG分离的、天然的亲和配基。将这些配基蛋白结合到固体支持物上,提供了应用亲和层析纯化抗体的一步法的基础。 试剂及仪器 l 含IgG的样品 l PBS(见附录) l 装有2ml固相化的蛋白A、蛋白G或蛋白A/G的小型层析柱(有商品供应) l 透析袋(MWCO 10,000) l 结合缓冲液:0.1mol/L Tris-HCl pH7.5 + 0.15mol/L NaCl l 分步收集器(可按需要选用) l 洗脱缓冲液:0.1mol/L Gly-HCl pH2.8+0.15mol/L NaCl l 中和缓冲液:1mol/L Tris-HCl pH 8.0 l 蠕动泵(可按需要选用) l UV监测器 l pH计 操作步骤 * 样品(可为血清、腹水、含有IgG的单克隆和多克隆抗体的细胞上清液)。 1.样品在4℃,对结合缓冲液透析过夜,或将其与至少1:1稀释的结合缓冲液混合; 2.如果条件充许,将层析柱与蠕动泵、分步收集器和UV监测器相连; 3.至少用10ml结合缓冲液, 以1ml/min速度, 洗涤柱中的2ml亲和层析介质; 4.上样; 5.一旦样品进入凝胶,用结合缓冲液洗柱(至少10个柱体积),直至A280nm 小于0.03; 6.用洗脱缓冲液洗脱所结合的IgG,分布收集2ml/管; 7.收集过程中,每管立即加入0.1ml中和缓冲液,以中和洗脱所得的IgG液。 8.含IgG的各管对PBS透析,其后根据抗体的稳定性,加入防腐剂(0.020g/L叠氮钠),置4℃或冷冻保存。 实验要点及说明 通常可通过SDS-PAGE分析或通过适当的免疫方法 (如Western blot, ELISA等),对洗脱组分进行纯度鉴定和免疫活性测定。 1. 上样量由层析柱的对特定免疫球蛋白的容量确定,2ml柱对于小鼠IgG 的容量约10mg,对于人IgG的容量约为18mg; 2. 柱上结合的抗体被洗脱的速度很快, 通常在第一洗脱流份中; 3. 下列缓冲液也可用为结合缓冲液:含0.15mol/L NaCl的50mmol/L硼酸钠pH8.0,或含0.15mol/L NaCl的0.1 mol/L 磷酸盐液pH7.5。高盐结合缓冲液(>1 mol/L NaCl)可能增加总的柱结合容量约50%; 4. 应用pH8.0-9.5的缓冲液作为结合缓冲液,通常能增加蛋白A对小鼠IgG的结合力; 5. 对于蛋白G的层析柱,可用低pH的结合缓冲液,如pH5.0含0.15 mol/L NaCl的50mmol/L 醋酸缓冲液; 6. 对pH敏感的抗体,需用比较温和的洗脱液, 如:含0.2mol/L NaCl的0.1mol/LTris-醋酸pH 7.7或3mol/L KCl或5.0mol/L KI或3.5mol/L MgCl2; 7. 蛋白G也能与IgG的CH1区结合,所以不能用于F(ab’)2与Fc的分离; 8. 如果无蠕动泵和部分收集器可用,也可利用重力进行上样及洗脱,手动收集2ml / 管,用分光光度计测定280nm的吸光度。 参考文献 1. Bjorck,L, And Kronvall,G. (1984) Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG binding reagent. J. Immunol. 133,969-974 2. Eliasson,M.,Olsson,A.,Palmcramtz,E.,Wiberg,k.,Inganas,M.,Guss,B.,Lindberg,M., and Ulldh,M.(1988)Chimeric IgG-binding receptor engineered from staphylococcal protin A and streptococcal protein G.J.Biol.Chem.263,4323-4327. (张文利、朱正美) 第七节应用酶解从IgG 制备F( ab’)2的方法 基本原理 本文介绍应用胃蛋白酶及菠萝蛋白酶从IgG 制备F( ab’)2的方法。这两种酶均在免疫球蛋白的绞链区双硫键的下方分解IgG(见图1),裂解产物为三个片段,即两个相同的Fab段和一个Fc段,Fab段即抗原结合片段,含有一条完整的轻链和半条重链,分子量约50000。首选的酶是胃蛋白酶,它在IgG的绞链区二硫键的近C末端切断重链,生成大、小两个片段,大片段为Fab双体,称为F( ab’) 2,其功能与Fab相同。胃蛋白酶可用于大多数的小鼠的IgG1及IgG2a以及大鼠、人和兔的IgG抗体制备F( ab’)2,但不能用于小鼠的IgG2b 抗体。应用本法,可通过HPLC测定组分的大小来判定水解的程度。F( ab’) 2组分在分子量100000部分洗脱,而IgG则在分子量150000的流分中。 由于小鼠IgG1抗体抗胃蛋白酶,或使酶水解为较小的肽段,因此可采用菠萝蛋白酶,或经 过预试来选择确定合适的蛋白酶。 图2-7-1 IgG不同蛋白酶水解部位示意图 试剂及仪器 l 0.2mol/L TE8: 0.2mol/L Tris-HCl pH8.0 + 10mmol/L EDTA,按要求稀释到20mmol/L TE8 l 2mol/L 醋酸, pH3.7:103ml冰醋酸+ 17.2 克醋酸钠用蒸馏水配至1L l 70mmol/L 醋酸/ NaCl ,pH4.0:70m mol/L ,50m mol/L ,pH4.0 (22ml 冰醋酸, 1.15克醋酸钠,2.29克NaCl,用蒸馏水配至1L l 胃蛋白酶:10mg/ml 胃蛋白酶溶于70m mol/L 醋酸/ NaCl液pH4.0,现用现配 l 1 mol/L Tris pH9.2 (121克Tris碱溶于1L蒸馏水,以HCl 调至pH9.2) l 50m mol/L TE7:50m mol/L Tris-HCl pH7.0 + 2 mol/L EDTA l 2-巯基乙醇 l 碘乙酰胺储存液:50 mmol / L碘乙酰胺液 l 50m mol/L TE7碘乙酰胺应用液:(加1%体积的碘乙酰胺储存液到50m mol/L TE7中,现用现配 l 菠萝蛋白酶:10mg/ml 的50m mol/L TE7液,在临水解前配制。加入2-巯基乙醇至终浓度为0.5μmol/L ,在37℃保温15分钟,以使酶活化 l 10,000 MWCO滤膜的浓缩装置 l 分级范围1的分子排阻层析HPLC 系统 l 可分离150000蛋白质的凝胶过滤(分子排阻)柱。可用两根直径2.5cm、凝胶床高80cm 的柱子***,以30ml/小时的流速,来分离10-100mg的IgG l 水浴 l 透析带(10000 MWCO)。用前在含0.1mmol/L EDTA的蒸馏水中煮沸、清洗 操作步骤 (一)酶解IgG样品的用量 通常酶解50-200mg IgG ,可生成20-100mg F(ab’)2。对于新抗体,可先用5-15 mg 试做,以确定所用酶对抗体的水解能力; (二)IgG的浓度及予处理 将IgG浓缩到10-15 mg/ml ,为进行胃蛋白酶水解,IgG要先对0.02 mol/L TE8 透析,为进行菠萝蛋白酶水解,IgG要先对50mmol/LTE7 透析; (三)胃蛋白酶水解法 1.用2 mol/L醋酸(pH 3.7)将抗体液的pH 调到4.0-4.2,将胃蛋白酶终浓度稀释到30g/L (W/W); 2.在37℃水浴中保温酶解。每次取样10μl 通过HPLC测定水解组分的分子大小。在水解过程中,HPLC测定的洗脱峰应从IgG的单峰变成两个峰,分子量小的组分是F(ab’) 2。水解通常需要6-12小时; 3.当水解到IgG浓度〈100g/L,或F(ab’) 2峰的大小不再增加时,加入1 mol/L Tris (pH 9.0),调节反应液到pH 8.0,以终止反应。 (四)菠萝蛋白酶水解法 1.向抗体溶液中加入已活化的菠萝蛋白酶液,达到需要的浓度。对不同抗体,所需的酶浓度要先用预实验来确定,一般的酶浓度在5-40g/L (W/W)之间; 2.反应过程中,同胃蛋白酶水解法一样,用HPLC来监测水解的程度; 3.当水解到IgG浓度〈100g/L ,或F(ab’)峰的大小不再增加时,加入碘乙酸至终浓度0.5m mol/L ,终止反应。 (五)产物F(ab’) 2的分离 1.用经过0.2 mol/L TE8 平衡的凝胶过滤柱,按分子量大小来分离水解组分; 2.分离后,将分子量100000的F(ab’) 2 峰合并、浓缩. 图2-7-2 产物F(ab’) 2 与IgG的分离 实验要点及说明 1.胃蛋白酶的活性对pH高度敏感,在最适pH范围外,pH下降其活性会明显增加,pH 上升,其活性则会明显下降; 2.大多数的IgG1的水解需6-12小时。也可将水解液置4℃水解过夜。小鼠IgG3 很难被 酶解消化成F(ab’) 2; 3.当需要完全不含IgG 或Fc段的F(ab’) 2时,水解产物还需通过抗- Fcγ免疫吸附柱纯化(请参阅参考文献1),或通过蛋白A-琼脂糖柱纯化; 4.水解的程度也可通过非还原性的7.5%SDS-PAGE与考马氏蓝染色来测定。 参考文献 1.Glennie, MJ., Tutt, AL. And Greenman, J. (1993) Preparation of multispecific F(ab’)2 and F(ab’)3 antibody derivatives. In Tumor Immuology. A Pratical Approch (eds. Gallagher, G., Rees, RC. And Reynolds, CW.). pp.225-244. Oxoford University Press. 2. Lamoyi, E. And Nisonoff, A. (1983) Preparation of F(ab’)2 fragments From mouse IgG of various subclasses. J. Immunol. Meth. 56, 235-243. (朱正美) 第八节从F(ab’)2制备Fab’ 基本原理 在F(ab’)2绞链区的双硫键可用巯基乙醇使之还原,得到具有游离SH基的Fab’,随后可用碘乙酸使Fab的游离SH基烷基化,从而防止其再氧化生成F(ab’)2。 试剂与设备 l 0.2 mol/L TE8: 0.2 mol/L Tris-HCl, pH 8.0 + 10m mol/L EDTA l 2-ME 还原溶液:220mmol/L 2-巯基乙醇+1mmol/L EDTA (在通风橱中配置此溶液) l 250mmol/L 碘乙酸: 250mmol/L 碘乙酸储存液 l HPLC系统及凝胶过滤柱(同前) l 透析袋。经过在含0.1mmol/L EDTA水中煮沸及冲洗 操作步骤 1. F(ab’)2的浓缩:将所得的F(ab’)2液浓缩到0.5-15mg/ml 范围; 2. 还原: (1)向F(ab’)2液中加入1/10 体积的2-巯基乙醇还原液(终浓度为20m mol/L 2-巯基乙醇); (2)在25℃水浴中保温30分钟; (3)加入1/10 体积的250m mol/L 碘乙酸,以封闭游离的SH基; (4)在25℃水浴中保温10分钟; (5)用HPLC分析法,通过比较F(ab’)2原液与还原生成的Fab’的量,来检测还原度。Fab’在F(ab’)2之后被洗脱,使得洗脱的峰形改变(见图1)。Fab’的分子量为50000; (6)在大多数的情况下,大于950g/L的F(ab’)2被还原为Fab’。 3. Fab’产物的分离: (1)如果在制备液中仅存在少量的未还原的F(ab’)2,是符合实验需要的,残余的2-巯基乙醇和碘乙酸可通过对缓冲液透析以除去; (2)如果还原不够充分,或需要Fab’完全与未还原的F(ab’)2分离,则可在0.2 mol/L TE8液中通过凝胶过滤法进行分离,合并、浓缩分子量为50000的Fab’峰。 图2-7-4 Fab’产物与F(ab’)2的分离(图240) 实验要点及说明 1. 上述操作也会使IgG的部分重链双硫键还原,但因非共价相互作用还可维持重链与轻链的连系,故不影响Fab段与重链的结合性能。然而,在非还原性SDS-PAGE分析图谱中,则可看到完整的Fab’(分子量大约50000Da)及轻链(大约25000Da)两条条带; 2. 可用100g/L的非还原性SDS-PAGE,来检测反应液中F(ab’)2的还原程度。F(ab’)2条带约分子量100000Da,Fab’在50000 Da,而已还原的重链及轻链分子量为25000 Da ,条带容易分辨。 参考读物 Glennie, MJ., McBride, HW,. Worth, AT. And Stevenson, GT. (1987) Preparation and performance of bispecific F(ab’γ)2 antibody contain ing thioether-linked Fab’ fragments. J. Immunol. 139, 2367-2375. 第九节免疫球蛋白A 纯化 基本原理 免疫球蛋白A(IgA)可由多种组织和器官产生,如粘膜,骨髓,淋巴结等。血中IgA以单 体或聚合体形式存在,含量约为210±80mg,骨髓瘤病人血清中IgA水平增加。IgA分IgA1和IgA2两种亚型,其中IgA1亚型占总IgA的90%以上,并在铰链区结合有特征性的O—连接寡糖链。(见第六篇,第二章)。实验中常需对总IgA及IgA1亚型进行分离、纯化和鉴定。IgA纯品价格昂贵,如能自己制备,则可节省资金。 一、IgA的抗体亲和层析分离 原理 利用IgA抗体对IgA抗原的特异结合特性。溴化氰活化的Sepharose-4B凝胶与多克隆抗IgA 抗体,或抗IgA1亚型单抗共价交联制备亲和层析柱。经亲和柱分离,即可得到总IgA或IgA1亚型纯品。 试剂和仪器 l 多克隆抗IgA抗体,或抗IgA1亚型单抗 l 抗体—Sepharose-4B偶联胶:制备过程参见(第二篇,第一章),或购买成品胶 l 0.22μM微孔滤膜 l 层析柱 l 0.01mol/L硼酸钠,pH 8.0 l 0.25mol/L甘氨酸—盐酸缓冲液,pH 2.7 l Tris-HCl缓冲液,pH 8.0 l PBS缓冲液 l 保存液:含0.02% NaN3 的0.01mol/L硼酸钠,pH 8.0 l 试管 l 紫外分光光度仪 l 离心机 操作步骤 1. 收集5ml血清,27,000g,4℃离心30min。上清经0.22μM微孔滤膜过滤,-20℃保存,或直接应用。 2. 20ml交联好的抗体—Sepharose-4B偶联胶装柱,并用0.01mol/L硼酸钠缓冲液(pH 8.0)平衡柱子,约5-10个柱体积。 3. 上样。 4. 用上述硼酸钠缓冲液洗柱,流速为0.5~1ml/min, 每管收集1ml。测定各管的A280吸光值,直至A280吸光值为零。 5. 用0.25mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.7)洗脱,收集流出液,每管1ml,于各管中即刻加入200ul Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。 6. 合并各管,并用PBS 4℃透析,过夜。 7. 用20~30倍柱体积的0.01mol/L硼酸钠(pH 8.0)平衡柱子。 8. 用10倍柱体积的保存液洗涤柱子,并于2~4℃保存。 技术要点 1. 采用SDS-PAGE 电泳方法鉴定IgA分离样品的纯度。 2. 血清中IgA的含量低,因此上样前最好将血清经硫酸铵沉淀处理。 3. 确保层析柱内没有气泡。 二、Jacalin 亲和层析柱分离纯化IgA1 原理 利用凝集素Jacalin对IgA1的糖链末端特异结合的特性,经Jacalin亲和层析柱分离,制备IgA1亚型纯品。 试剂和仪器 l 葡聚糖凝胶G-25 l 0.175mol/L Tris-HCl , pH 7 l 纳氏试剂 l Jacalin层析柱 l Ca2+-TBS缓冲液:含1mmol/L CaCl2 l PBS l 半乳糖-Ca2+-TBS缓冲液:含0.8mol/L半乳糖 l 1.2mol/L NaCl溶液 l 保存缓冲液:含0.05nmol/L CaCl2和0.15mol/L NaCl的0.01mol/L PBS缓冲液 l 层析柱(内径1.1X长度12cm) l 尼龙布 l 白瓷凹板 l 试管 l 胶管 l 紫外分光光度仪 l 离心机 操作步骤 (一)血清样品的处理 1.血清的过硫酸胺沉淀 1) 5ml血清加等体积的PBS缓冲液5ml,缓慢加入2.8g过硫酸胺, 边加边搅拌,静置30分钟。 2) 3000转/分钟离心10 分钟。 3) 沉淀重悬于0.175mol/L Tris-HCl (pH 7.5)的缓冲液中, 待上样。 2.脱盐 1) 装柱:称取葡聚糖凝胶G-25 1g, 加蒸馏水50ml,微火煮沸1小时(注意随时补充蒸馏水以免蒸干)。静置冷却后倾弃上清液,加入10ml PBS,并轻轻搅拌,将凝胶倾入层析柱内。用PBS洗5~10个柱体积当液面恰好与凝胶面重合时,立即拧紧夹子,准备上样。 2) 脱盐:将步骤1处理后的血清样品上样。待样品全部流入凝胶内时,再沿管壁加入少量PBS冲洗。 3) 收集样品:流速为8-10滴/分,每管1ml,连续用PBS洗涤至用纳氏试剂检测无NH4+为止。 4) 检测各样品管的A280吸光值,合并峰值管备用。 (二)过柱 1. 将Jacalin凝胶(约2ml)加到层析柱中。 2. 用Ca2+-TBS缓冲液洗柱,约10倍柱体积。 3. 上样。 4. 用Ca2+-TBS缓冲液洗柱,流速控制在0.5ml/min以下。 5. 收集流出液,重复上样三次。 6. 用Ca2+-TBS缓冲液洗柱,收集流出液,每管0.5ml。测定各管A280吸光值,洗脱至吸光值低于0.03。 7. 用半乳糖-Ca2+-TBS缓冲液洗脱,收集洗脱液,每管0.5ml。测定各管A280吸光值。 8. 合并各管液体,用PBS在4℃透析样品。 9. 用10倍柱体积的1.2mol/L NaCl洗柱。 10. 用50倍柱体积的保存缓冲液平衡柱子。 11. 用10倍柱体积的含0.02% NaN3的保存缓冲液洗涤柱子,并于2~4℃保存。 技术要点 1.采用SDS-PAGE 电泳方法鉴定IgA1分离样品的纯度。 2.重复上样,或上样后将柱放于4℃过夜,可增加IgA1的结合量。 3.上样后不要过度洗涤柱子,以免损失IgA1。