莱克多巴胺检测方法分析

莱克多巴胺检测方法分析 莱克多巴胺检测方法分析 饲料检测 摘要莱克多巴胺作为瘦肉精克伦特罗的替代产品出现较晚,目前尚没有统一的检测方 法.由于其具有不同于克伦特罗的代谢方式,在实际检测中经常出现假阳性及假阴性等问题,而 且导致不同检测方法间结果不匹配.文章结合莱克多巴胺的代谢特点,对目前的分析检测方法进 行,探讨不同检测方法的优缺点,并初步分析符合率低的原因,提出解决方法和建议. 关键词莱克多巴胺检测技术兴奋剂 中图分类号:S816.17文献标志码:B文章编号:1002—2813(2009}08—0047—03 动物源性食品中克伦特罗和莱克多巴胺(Rac. topamine,RAG)等违禁药物的滥用已成为世界性的 难题,世界各国也通过相关的法律法规进行控制 (Thompson等,2008).但此类违禁药物带来的经济 收益仍让一些养殖企业和养殖户不惜挺而走险.在 我国,畜禽产品药物残留不仅影响这些产品的出口 贸易,威胁消费者的健康,而且成为许多国家阻止我 国畜产品出口的技术壁垒. 由于"瘦肉精"克伦特罗的监控检测方法已趋成 熟,在饲料中添加克伦特罗提高动物性食品的肉质 品质已得到较好监管(张慧嫦等,2008).但作为瘦 肉精的二代产品,莱克多巴胺的监控仍比较薄弱,主 要原因是莱克多巴胺具有较特殊的代谢特点,以及 目前的检测和筛查方法较难相互印证,导致相同样 品在不同检测情况下可能出现不同的阳性或阴性结 果,从而造成漏检(于洪侠,2oo6). 目前我国还没有统一检测莱克多巴胺方法,因 此,建立莱克多巴胺快速准确的测定方法以适合市 场监测十分必要. 1莱克多巴胺的性质和特点 莱克多巴胺是苯酚胺类激素,属于G2一类肾上 :2009—04—13 收稿Et期 腺素激动剂,其与支气管平滑肌细胞面的8—2受 体相结合,可用于治疗支气管哮喘.在动物试验中, 当使用量达到治疗剂量的5,10倍时,会表现出营 养再分配效应,促进脂肪分解,提高瘦肉率和蛋白合 成,表现为快速增质量和饲料转化率提高(Yang等, 1989).这种现象在猪体内尤为明显,因此被作为克 伦特罗的替代品,用作新型促生长添加剂(Wemer, 1989).但由于莱克多巴胺在猪等动物体内具有残 留并可通过生物链方式进入人体,当累积超过一定 量时便表现出毒副反应,出现心动过速,心率失常及 肌肉疼痛等症状(MartlnezNavarro,1990).因此,除 了美国批准其作为猪饲料添加剂外,欧洲和中国等 都禁止使用(Muirhead,2000). 2分析检测方法 用于莱克多巴胺检测的方法有气相色谱法 (GC),高效液相色谱法(HPLC),气质联用法,毛细管 电泳法,酶联免疫法(EusA),免疫层析法(胶体金 法)和免疫传感器法等.其中,GC,HPLC,GC—MS 和毛细管电泳等方法属于色谱分析方法,可用于定 量;而ELISA等方法属于免疫分析方法,可用于筛 查. 2.1色谱分析方法 根据检测器的不同,气相色谱法可实现通用性 饲料研究47 饲料检测 或专一性检查.可供选择的检测器包括,氢焰离子 化检测器(FID),电子捕获检测器(ECD)和氮磷检测 器(NPD)等.气相色谱法灵敏度较高,检测限可达 微克每千克级.莱克多巴胺极性偏高,而且前期处 理也需要繁琐的衍生化步骤,因此,单独的GC应用 有限. HPLC采用C18分析柱,通常用乙腈配置流动相, 通过等溶剂或梯度洗脱进行样品预处理,结果重复 性较好,并且分析速度较快,可分离许多难以分离的 待测物,是莱克多巴胺分析常用的方法,定量限可达 0.5ng/mE,回收率达75%,100%,变异系数为 2%,18%(Hassan等,2001;Antignac等,2002). 气相色谱一质谱法属于气质联用技术,兼具分 离,定量和定性等特点,因此,非常适合于莱克多巴 胺的确证分析.其灵敏度较荧光检测器高1个数量 级,可达到纳克每千克.气质联用除了GC—MS,还 有LC—MS和TLC—MS等多种方式,如:美国FDA 推荐使用LC—MS来检测水产品中的药物残留 (Fesser等,2005). 毛细管电泳法也属于色谱分析技术中的一种, 它可将莱克多巴胺的4种立体构型(RR,RS,SR和 ss)进行分离.其检测限可达0.2%0.5%,并可 进行定量分析,回收率约为92.6%(Shelver等, 2003;马健等,2006). 色谱法具有专属性好,选择性强,检测精确度高 和假阳性率低等特点,但色谱法检测仪器价格昂贵, 样品处理过程繁琐,对操作者技术要求较高,而且不 能实现现场检测. 2.2免疫分析方法 免疫分析法是近几年发展起来,以抗原与抗体 的特异性和可逆性结合反应为基础的新型分析技 术.可用于莱克多巴胺的免疫分析方法包括,酶联 免疫吸附法(ELISA),免疫胶体金法(层析法)和免疫 传感器法等. 酶联免疫吸附法通常采用竞争法,主要原理是 包被在96孔板孔内的莱克多巴胺抗原与或样 品中的莱克多巴胺竞争性地与莱克多巴胺抗体相结 合,经洗涤后,与抗体结合的莱克多巴胺样品被去 除,只剩下孔内与包被抗原结合的抗体.在此基础 上加入酶标记的二抗和显色底物,可显示蓝色反应, 通过OD值的测定及标准曲线就可确定莱克多巴胺 48饲|BI研究 的含量.ELISA方法是目前使用较普遍的方法,其 特点是灵敏度高,操作简便,检测迅速且价格便宜, 但假阳性率偏高而且不能实现现场检测.目前市场 上莱克多巴胺检测试剂盒主要是利用ELISA原理建 立的,其变异系数低于10%,回收率95%,浓度高 于1mL时都有很好的回收率和准确度(Beier等, 1996;Shelver等,20O0).ELISA与色谱法的相关性良 好,相关系数r在0.73,0.96(Shelver等,2002)之 间. 免疫胶体金层析快速检测法是随着人们对食品 安全日益重视及进出口贸易高速增长需求而出现的 一 种检测农兽药残留方法,在最近几年发展尤为迅 速(吴刚等,2oo7).目前市场上检测盐酸克伦特罗 的试剂盒或测试卡非常多,但由于莱克多巴胺出现 时间较晚,市场上莱克多巴胺胶体金测试卡测试结 果尚不太理想.免疫胶体金层析检测法主要原理 是:首先制备单抗(Ab),然后与胶体金(Au)结合,形 成单克隆抗体与胶体金的复合物(Ab—Au)并包被 在胶体金结合垫上,然后用人工合成的抗原包被硝 酸纤维素膜作为检测线(T线),检测线处的抗原与 样品中的抗原竞争Ab—Au复合物,并以颜色变化 进行直观显示.这种方法最大的特点是方便快速, 通常在5,10min内即可获得检测结果,并可做现 场检测.其次,由于这种检测方法是建立在抗原抗 体反应基础上的,其灵敏度及特异性都非常好.其 缺点是假阳性率较高,部分原因是与跟抗原结构类 似的物质出现交叉反应.因此,免疫胶体金层析快 速检测方法作为初筛非常合适,但对待阳性情况还 需谨慎,可通过色谱法等进行确证. 免疫传感器法亦称免疫电极,依据信号转换技 术的不同,免疫传感器可分为光纤免疫传感器,压电 免疫传感器,电化学免疫传感器和表面等离子免疫 传感器等(Khomutov等,2004;Minunni等,1994),主 要原理是利用抗原抗体识别功能作为分子识别元件 的生物传感器,将抗体(或抗原)结合在膜表面作为 受体,测定抗原抗体结合后的膜电位变化,利用传感 元件将抗原抗体反应的生物学信号转化为可定量的 电信号,从而进行定性和定量分析.这种方法的特 点是稳定,灵敏且重复性良好,与HPLC相关性也很 好,相关系数r可达到0.95,回收率接近100% (Shelver等,2003).不过,此类方法由于吸附常数较 大,免疫传感器的主要缺陷是抗原抗体反应不具有 良好的可逆性. 基于抗原抗体反应建立起来的免疫检测方法在材 料的预处理方面比色谱法简单很多,而且分析时间短, 使用方便.由于免疫胶体金技术在快速检测能力和现 场检测能力方面的优秀表现,在农药兽药残留的大规 模筛选检测中具有其他方法不可替代的优势,市场应 用前景非常广阔.不过,目前国际上公认的定量认定 方法仍是HPIE和气质联用等方法.国内在食品和饲 料检测中规定ELISA方法,HPLE方法及GC—MS方法 都可用于莱克多巴胺的检测,不过也规定GC—MS方 法为仲裁法(浙江省农业厅标准,2O08). 3莱克多巴胺假阳性及假阴性问题 目前采用试剂盒或测试卡进行莱克多巴胺检测 的筛查方法中,假阳性率的问题不可忽视.同样, HPLC等经典方法却往往存在阳性证据不足而无法 做出最终判断,使结果呈阴性,从而导致漏检的问 题.另一方面,试剂盒筛查与经典方法筛查存在符 合率低的问题,目前二者的符合率仅为20%, 50%(于洪侠,2006).出现上述检测结果的原因主 要包括,1)交叉反应问题,如:多巴酚丁胺,利妥特 灵,福莫特若和莱克多巴胺代谢物类似物等,由于结 构特点跟莱克多巴胺相近而在检测中出现假阳性; 2)莱克多巴胺快速代谢.莱克多巴胺在体内可快速 代谢,在某些动物(如牛和鸭等)体内3d后就以代 谢物存在,因此,通过试剂盒方法可检测而通过 HPLC法就无法精确检测,从而导致结果的不匹配; 3)莱克多巴胺代谢位点不同.莱克多巴胺可从不同 的酚羟基偶联的糖苷键代谢,形成不同的代谢产物, 如莱克多巴胺葡萄糖苷酸A,B和C等3种类型,其 出峰时间和性质与莱克多巴胺不同,因此,用色谱法 也较难确认.另一方面,3种不同代谢产物与抗体 的交叉反应性能也不相同,如:葡萄烯糖B与莱克 多巴胺交叉反应率可达到384,而葡萄烯糖A与莱 克多巴胺交叉反应率只有大约1(Smit等,2002). 因此,莱克多巴胺的检测与第一代瘦肉精盐酸 克伦特罗的检测有很大的不同,在实际检测过程中 除了应考虑试验操作方法标准化及前期处理方法的 可靠性和重复性,还要考虑莱克多巴胺的特殊代谢 特点,使用试剂盒方法进行筛查时应注意假阳性现 象的存在,对于阳性结果应予以慎重考虑,可结合色 饲料检测 谱法进行确证.而使用色谱法进行检查的过程中应 考虑到莱克多巴胺代谢产物的变化,建立合适的莱 克多巴胺代谢物色谱检测方法,确定最佳检测条件 (Shelver等,2003). 4结语 目前,国内虽然在莱克多巴胺检测方法方面建 立了GC—MS检测标准,但由于仪器昂贵,检测方法 繁琐及报告周期长等特点,在日常大量的生产流通 环节和国际出口贸易等方面显然不能满足要求.另 外,国内目前的检测灵敏度尚无法达到国际标准,而 国际上现在实行越来越严格的残留标准体系,对我 国农产品生产形成了很高的技术壁垒.因此,应积 极探讨各种先进的检测方法和检测技术,并进行相 关的试验论证. 在各种检测方法中,免疫胶体金法是最简单快捷 的检测方式,但与盐酸克伦特罗不同,目前市场上真正 能应用的莱克多巴胺免疫胶体金试剂盒很少,多数仍 是EHSA原理的检测试剂盒,因此仍需加大研发力度. ELISA检测方法是目前莱克多巴胺检测的主流方法,同 样具有快速,灵敏和高通量等特点,也适合于活体检 测,在日常大量的生产流通环节中做大规模筛查尤为 灵敏.而HPLC和GC—MS虽然都需要昂贵的仪器,并 且不适合于大批样品的检测,但其准确性和敏感性仍 是ELISA方法无法取代的.因此,进行检测时要注意 EHSA方法和色谱法的有效结合. 参考文献 [1]ThompsonCS,HaugheysA,TraynorIM,eta1.Ef- fectivemonitoringforractopamineresiduesinsamples ofanimaloriginbySPRbiosensorandmassspectrom? etry[JJ.Ana1.Chim.Acta.,2008,608(2):217— 225. [2]WinterhollerSJ,ParsonsGL,WalkerDK,eta1. Effectoffeedlotmanagementsystemonresponseto ractopamine—HC1inyearlingsteers【JJ.J.Anita. Sei.,2008,86(9):2401—2414. [3]张慧嫦,张少恩,吴忠华,等.胶体金免疫层析 法快速检测盐酸克伦特罗残留[J].中国国境卫 生检疫杂志,2008,3(1):39—42. 通信地址:广东广州市天河区五山路483号华 南农业大学动科院510642 饲料研究49