人脐带间充质干细胞肌肉注射健康大鼠心肌组织微血管及胶原纤维的表达

人脐带间充质干细胞肌肉注射健康大鼠心肌组织微血管及胶原纤维的表达 人脐带间充质干细胞肌肉注射健康大鼠心肌组织微血管及 胶原纤维的表达 中国组织工程研究 第20卷 第28期 2016–07–01出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research July 1, 2016 Vol.20, No.28 www. CRTER.org ?研究原著? 人脐带间充质干细胞肌肉注射健康大鼠心肌组织微血管及 胶原纤维的表达 郭玉秀，王思平，张文祥，毛成刚，高 宏，李自普(青岛大学附属医院，山东省青岛市 266003;潍坊市妇幼保健 34 院，山东省潍坊市 261000;滕州市人民医院儿科，山东省滕州市 277500;青岛市妇女儿童医学中心，山东省青岛市 266000; 5 1，2 1，3 1，4 1 5 ——————————————————————————————————————————————— 11 2 青岛奥克生物开发有限公司，山东省青岛市 266000) DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.003 ORCID: 0000-0003-4067-5347(李自普) 文章快速阅读: 文题释义: CD34:是微血管内皮细胞特异性标记物，免疫组织化学染色阳性微血管呈棕黄色，与周围组织界限清晰，便于识别，并能较好地区分大血管与微血管。 脐带间充质干细胞:来源于脐带羊膜上皮和脐血管之间或脐血管之间的结缔组织基质，来源丰富，取材方便，无道德伦理问题，在不同诱导条件下向心肌细胞、成软骨细胞、成骨细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、神经细胞、骨骼肌细胞、血管内皮细胞等方向分化，具有增殖能力强、低免疫原性、免疫调节等优点。 摘要 背景:目前关于肌肉注射脐带间充质干细胞能否引起心脏异位病理性血管形成及是否增加胶原纤维合成促进心肌纤维化尚不明确。 目的:探讨肌肉注射人脐带间充质干细胞对健康Wistar大鼠心肌组织微血管及胶原纤维合成的影响。 方法:健康雄性Wistar大鼠60只，随机分为正常组、培养液组、上清液组、低剂量组、中剂量组、高剂量组6组，每组10只;各组于饲养第2周分别在大鼠四肢肌肉——————————————————————————————————————————————— 内注射PBS(人脐带间充质干细胞悬浮液)、DMEM液(人脐带间充质干细胞培养液)、人脐带间充质干细胞培养的上清液、人脐带间充质干 细胞0.25×105个、人脐带间充质干细胞1.0×105个和人脐带间充质干细胞4.0×105 个。肌肉注射4周后再次注射1次，剂量和部位同上。于第2次肌肉注射后4周处死大鼠，取左心室肌制作病理切片，免疫组织化学法检测大鼠心肌微血管密度，Masson染色法检测心肌组织胶原纤维的表达。 结果与结论:?实验期间大鼠反应灵敏，活动、饮食正常，尿便正常，体质量增长良好，毛发色泽正常，未出现懒动、姿势运动异常等改变，注射部位无脱毛、红肿、溃疡、硬结形成等，各组大鼠均未见死亡;?CD34染色显示各组心肌组织微血管均呈强阳性表达;?Masson染色显示各组心肌组织胶原纤维均呈阳性表达;?各组间微血管密度及胶原纤维表达差异无显著性意义(F=0.110和0.585，P > 0.05);?结果表明，肌肉注射人脐带间充质干细胞及其培养上清液对健康大鼠心肌组织微血管及胶原纤维表达无明显影响。 关键词: 干细胞;脐带脐血干细胞;脐带间充质干细胞;微血管;胶原纤维;肌肉注射;大鼠 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 郭玉秀，女，1986年生，山东省高密市人，汉族，2013年青岛大学医学院毕业，硕士，医师，主要从事儿童心血管疾病方面的研究。 通讯作者:李自普，博士，教授，博士生导师，青岛大学附属医——————————————————————————————————————————————— 院，山东省青岛市 266003 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2016)28-04123-07 稿件接受: 2016-05-10 4123 Guo Yu-xiu, Master, Physician, Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China; Weifang Maternity and Child Hospital, Weifang 261000, Shandong Province, China Corresponding author: Li Zi-pu, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China www. CRTER.org 主题词: 脐带;间质干细胞移植;注射, 肌肉内;微血管;组织工程 基金资助: 青岛市公共领域科技支撑项目[11-2-3-1-(4)-nsh] Effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells via intramuscular injection on the myocardial micrangium and collagen expression in normal rats Guo Yu-xiu1, 2, Wang Si-ping1, 3, Zhang Wen-xiang1, 4, Mao ——————————————————————————————————————————————— Cheng-gang1, Gao Hong5, Li Zi-pu1 (1Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China; 2Weifang Maternity and Child Hospital, Weifang 261000, Shandong Province, China; 3Department of Pediatrics, People’s Hospital of Tengzhou, Tengzhou 277500, Shandong Province, China; 4Qingdao Women and Children’s Medical Center, Qingdao 266000, Shandong Province, China; 5Qingdao Aoke Biological Development Co., Ltd., Qingdao 266000, Shandong Province, China) Abstract BACKGROUND: To date, it is still unclear whether the intramuscular injection of heterogeneous umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSC) can cause cardiac ectopic pathological angiogenesis as well as increase collagen synthesis to promote myocardial fibrosis. OBJECTIVE: To explore the effects of intramuscular injection of human UC-MSCs on myocardial micrangium and collagen expression in normal Wistar rats. METHODS: After 2 weeks of feeding, 60 male SPF Wistar rats were randomly assigned to receive intramuscular injection of PBS (normal group), DMEM (culture medium group), human UC-MSCs supernatant (supernatant group), 0.25×105, 1.0×105, 4.0×105 human UC-MSCs (low-, moderate- and high-dose groups), respectively (n=10 per group). All the rats were subjected to second injection (same dose) at 4 weeks after first ——————————————————————————————————————————————— intramuscular injection. Then, the rats were killed under anesthesia at 4 weeks after second injection, to take heart tissues from the left ventricle for pathological observation, immunohistochemical examination and Masson staining. RESULTS AND CONCLUSION: No alteration of the response, activity, victualage, faeces, weight growth, and fur was found, and there was no death in rats during the experiment. All the rats had no symptoms of molt, inflammation, skin ulcer, scleroma. Strong positive expression of CD34 for the micrangium in the myocardial tissue was observed, and positive expression of the collagen in the myocardial tissue observed by Masson staining. There were no significant differences in the microvessel density and collagen expression in the myocardium among the groups (F=0.110 and 0.585, P > 0.05). To conclude, hUC-MSCs or its supernatant via intramuscular injection has no effect on the micrangium and collagen expression in normal rats. Subject headings: Umbilical Cord; Mesenchymal Stem Cell Transplantation; Injections, Intramuscular; Microvessels; Tissue Engineering Funding: the Public Technology Support Program of Qingdao City, No. 11-2-3-1-(4)-nsh Cite this article: Guo YX, Wang SP, Zhang WX, Mao CG, Gao H, Li ZP. ——————————————————————————————————————————————— Effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells via intramuscular injection on the myocardial micrangium and collagen expression in normal rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(28):4123-4129. [5] [6] 0 引言 Introduction 脐带间充质干细胞是一类具有自我更新能力、多向分化潜能的干 细胞，已有实验研究表明，脐带间充质干细胞可存活并能诱导分化为 内皮细胞及心肌样细胞 [1-2] 疾病的有效性。Kim等将脐带间充质干细胞移植到猪梗死心肌中， 发现其可再生心肌细胞及新生血管，明显改善局部及整体心脏功能， 并且未发生心律失常、恶性肿瘤及排斥反应。研究发现肌肉注射不同 剂量人脐带间充质干细胞后，健康大鼠的脑、肺、肝、脾、肾、注射 部位肌肉组织结构和心肌超微组织结构未见异常病理变化，注射前后 肝功能、肾功能和心肌酶均在正常范围，且不会因诱发正常心肌组织 内源性心肌干细胞活化而导致心肌组织的过度增生，证明了人脐带间 充质干细胞 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org ， 明显改善心功能，并通过旁分泌途径参与血管新生、抑制心肌细 ——————————————————————————————————————————————— 胞凋亡及心肌内炎症反应、抑制纤维化、促进损伤心肌修复再生等 [3-4] 。 移植脐带间充质干细胞治疗心脏疾病尚处于起始阶段，大量的实验证明脐带间充质干细胞移植治疗心脏 4124 www. CRTER.org 移植的有效性及安全性[7-8] 。健康大鼠给予肌肉注射人脐带间充质干细胞后能否引起心脏异位病理性血管形成，尚需研究证实。另外局部微环境对干细胞的诱导分化具有重要作用，人脐带间充质干细胞移植到心肌是否会分化为成纤维样细胞，增加胶原纤维合成促进心肌纤维化。为此，实验通过肌肉注射不同浓度人脐带间充质干细胞，检测心肌组织中微血管数及胶原纤维含量，明确肌肉注射人脐带间充质干细胞对健康大鼠心肌组织的影响，为人脐带间充质干细胞临床治疗应用的安全性提供理论依据。 1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 随机对照动物实验。 1.2 时间及地点 实验于2011年9月至2012年9月在青岛大学医学院附属医院SPF级动物实验室和中心实验室完成。 1.3 材料 1.3.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠60只，SPF级，7周龄，体质量150-180 g，由山东鲁抗医药有限公司提供，批号SCXK2008002，——————————————————————————————————————————————— 于青岛大学附属医院动物房饲养，饲养环境符合SPF级。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。 1.3.2 细胞 人脐带间充质干细胞、培养上清液、DMEM培养液均由青岛大学附属医院干细胞中心提供。实验所用人脐带间充质干细胞经流式细胞仪检测显示CD90、CD73、CD105、HAL-ABC呈阳性表达，CD34、CD45、HLA-DR呈阴性表达，符合间充质干细胞表型特征。病原微生物检测示乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、支原体、巨细胞病毒、梅毒螺旋体、HIV、需氧菌及真菌培养均阴性。 1.3.3 主要试剂及仪器 Masson三色染色液试剂盒(北京罗基生物技术有限公司);CD34抗体(武汉博士德生物工程有限公司);PV-9001兔超敏二步法免疫组化检测试剂、DAB染色试剂盒(北京中杉金桥有限公司);苏木精染色试剂盒(北京博奥森生物有限公司);微量加样枪(德国Eppendorf公司);-20 ?冰箱(青岛海尔集团);恒温箱(上海和呈仪器制造有限公司);倒置显微镜(德国LEICA公司)。 1.4 实验方法 1.4.1 动物分组及干预 60只Wistar大鼠随机分为正常组、培养液组、上清液组、低剂量组、中剂量组、高剂量组6组，每组10只。各组于饲养第2周分别在大鼠四 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 肢肌肉内肌注PBS(人脐带间充质干细胞悬浮液)、DMEM(人脐带间充质干细胞培养液)、人脐带间充质干细胞培养上清液、人脐带间充质干细胞0.25×105 个、人脐带间充质干细胞1.0×105 ——————————————————————————————————————————————— 个和人脐带间充质干细胞 4.0×105 个。肌肉注射4周后再次注射1次，剂量和部位同上，每日观察大鼠生活习性[9] 。 1.4.2 组织标本制作 第2次肌肉注射后4周称质量，用10%水合氯醛3 mL/kg麻醉大鼠，取左心室进行固定、脱水、透明、浸蜡包埋，3 μm连续切片，制作病理切片。 1.4.3 CD34免疫组织化学染色及微血管计数 按CD34免疫组织化学试剂盒说明书进行。一抗为CD34单克隆抗体，二抗为通用型二抗，显色剂显色;CD34阳性示微血管呈棕黄色，着色鲜明，与周围组织界限清晰。采用倒置显微镜观察，光镜下每张组织切片随机选择10个高倍视野(×400)，进行微血管计数(棕黄色圆形、椭圆形或半椭圆形为1个微血管)，求其平均值，并采集图像。 1.4.4 Masson三色染色及胶原纤维半定量表达 石蜡切片脱蜡至水，分别用Weigerts铁苏木精、丽春红酸性品红、苯胺蓝液按标准的病理技术染色，染色结果胶原纤维呈蓝色，细胞核呈蓝色，胞浆、肌肉、红细胞呈红色。采用倒置显微镜观察，光镜下每张组织切片随机计数15个高倍视野(×100)，采集图像。应用Image-Pro Plus 6.0彩色图像分析系统半定量胶原纤维表达，测量蓝色区域的积分吸光度值、图像面积(S)，求每个视野积分吸光度与图像面积的比值，取其平均值。 1.5 主要观察指标 ?大鼠一般情况;?大鼠心肌组织微血管的表达;?大鼠心肌组织胶原纤维的表达。 1.6 统计学分析 采用——————————————————————————————————————————————— SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料采用x_ ?s表示，各组计量资料进行正态检测，符合正态分布、方差齐性。多组定量资料采用单因素方差分析，多组间定量资料两两比较采用LSD(least significant difference)-t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。 2 结果 Results 2.1 大鼠一般情况 肌肉注射前所有大鼠反应灵敏，活动、饮食正常，尿便正常，体质量增长良好，毛发色泽正常。肌肉注射后无懒动，无姿势运动异常，饮食、尿便正常，无体质量下降，注射局部无脱毛、红肿、硬结形成、溃疡等表现;实验过程中无大鼠死亡。 4125 CRTER.org 2.2 大鼠心肌组织微血管的表达 各组大鼠肌肉注射后8周，CD34染色显示各组心肌组织切片镜下均可见微血管强阳性表达，各组间微血管密度差异无显著性意义(F=0.110，P > 0.05)，见表1，图1。 2.3 大鼠心肌组织胶原纤维的表达 各组大鼠肌肉注射后8周，Masson染色显示心肌组织胶原纤维呈蓝色表达，各组均呈阳性，各组间胶原纤维积分吸光度与图像面积比值差异无显著性意义(F=0.585，P > 0.05)，见表2，图2。 3 讨论 Discussion 成熟心肌细胞属于终极分化细胞，无更新再生和分化能力，一旦——————————————————————————————————————————————— 受到不可逆损伤，将导致心肌细胞数量减少，损伤区由残存心肌细胞代偿性肥大及纤维组织增生来修复，导致心肌结构重建，影响心脏功能，最终可发展为心脏衰竭。随着再生医学的临床应用，发现刺激心肌细胞增殖，可进一步治疗心力衰竭 [10] ，其中包括细胞 移植促进再生修复治疗。目前多种类型细胞已于基础研究和临床应用中进行移植治疗心脏疾病，如胚胎干细胞、骨骼肌成肌细胞、间充质干细胞等 [11-14] 。 间充质干细胞容易分离，具有高扩增潜力、低免疫原性、可塑性的基因修饰及多向分化潜能 [15] ，在特 定微环境下可通过多种途径改善心肌供血及心功能:?分化为心肌样细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞整合到梗死心肌组织或梗死区新生血管[16] ;?旁分泌多 种因子，如血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因 子、前列腺素F等 [17] ——————————————————————————————————————————————— ，促进新生血管形成及受损器官 修复、抑制细胞凋亡、抑制纤维化和炎症反应等[18] ， 为血管新生提供基质支持作用。目前认为最主要的机 制是间充质干细胞旁分泌多种促血管生成因子[19] 。血管 再生所需的因子主要包括血管内皮细胞生长因子 [20-22] 、 血管紧张素?等生长因子，肝细胞生长因子[23] 、成纤 维细胞生长因子等细胞因子，巨细胞集落刺激因子、 干细胞生长因子[24] 、单核细胞趋化蛋白1等趋化因子， 白细胞介素1、白细胞介素6、胰岛素样生长因子1 等炎症因子 [23] ，其中血管内皮细胞生长因子在血管新 生中占主要地位。 在生理条件下，血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子等促血管生成因子在动物及成人体内仅有微量表达，不会引起新生血管广泛形成。组织缺血、缺氧时低氧诱导因子可激活血管内皮细胞生长——————————————————————————————————————————————— 因子等多种血管生成因子至缺血缺氧部位的能力提高 [25] 。干细胞4126 移植到缺血肌肉中，可转化为血管内皮祖细胞并诱导大量促血管生成因子的释放，同时内皮祖细胞在血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子等促血管生成因子的作用下可大量扩增，进而发育为血管内皮细胞形成血管。马群兴等 [26] 研究表明脐带间充质干细胞与脐血 CD34+ 细胞联合移植可改善心肌梗死后心功能，可能与梗死周边微血管和心肌细胞形成有关。正常人体或动物体内无缺血缺氧刺激及促血管因子过量表达，因此无新生血管过多生成。CD34是微血管内皮细胞特异性标记物，免疫组织化学染色阳性微血管呈棕黄色，与周围组织界限清晰，便于识别，并能较好地区分大血管与微血管 [27] 。实验采用免疫组织化学法检测各实验组心肌组织 微血管的表达，结果显示正常大鼠在肌肉注射不同剂量人脐带间充质干细胞或细胞培养上清液8周后，肌肉组织中微血管含量各组间差异无显著性意义，提示肌肉注射人脐带间充质干细胞或细胞培养上清液不会诱导正常心肌组织高表达微血管。 心肌缺血缺氧造成心肌细胞大量坏死，心肌及心室结构发生变化，——————————————————————————————————————————————— 心脏舒缩功能受损，引起血流动力学障碍，并激活神经内分泌系统，可引起炎性细胞 [28] 、 炎性因子白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、转化生长因子β等及氧自由基表达增多[29-30] ，肾 素-血管紧张素系统活化 [31] ，使细胞外基质合成与降解 失衡，胶原成分构成比例发生改变，胶原蛋白降解破坏，胶原纤维网络断裂，缺乏连接结构的胶原合成、沉积增加，可导致心肌基质纤维化 [32] 。肾素-血管紧张 素系统被激活，血管紧张素?的表达增加，促进胶原纤维的合成。同时血管紧张素?还使基质金属蛋白酶与基质金属蛋白酶组织抑制因子的表达失平衡，被认为是目前与胶原纤维代谢合成关系最密切的血管活性物质之一 [33] 。 间充质干细胞移植后能归巢于缺血后纤维化心肌，且基质金属蛋——————————————————————————————————————————————— 白酶能增强间充质干细胞迁徙归巢 能力 [34-35] ，归巢至缺血心肌的干细胞除分化为心肌细胞 与血管内皮细胞，抑制心肌细胞凋亡[36] ，还通过旁分泌 细胞因子抑制核转录因子κB的激活，减少炎性细胞因子的产生释放，干预基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶组织抑制因子的异常表达 [37] ，阻止胶原蛋白网的降解， 调节细胞外基质合成与降解的平衡，减少胶原的合成沉积和纤维化。此外间充质干细胞亦可分泌肝细胞生长因子等抑制心肌纤维母细胞自身分泌胶原纤维[38] 。 Wang等 [39-40] 研究发现，间充质干细胞移植至大鼠心肌 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org CRTER.org 梗死模型，基质金属蛋白酶9表达下调，心肌梗死区胶原沉积减少，且不同时间段胶原含量随时间呈减少趋势，这些结果提示间充质——————————————————————————————————————————————— 干细胞具有降低纤维化心肌纤维含量的作用，减少心室结构的重构，抗心力衰竭的保护作用。 实验结果显示，健康大鼠肌肉注射不同剂量间充质干细胞或培养上清液后，各组心肌组织胶原纤维含量未见明显差异，提示肌肉注射间充质干细胞或培养上清液对健康大鼠心肌胶原纤维含量无影响。 致谢:感谢青岛大学医学院附属医院中心实验室的帮助。 作者贡献:实验设计为通讯作者，实验具体实施者为第一、二作者，第三作者负责脐带间充质细胞的质量，评估为通讯作者，均经过正规培训。 利益冲突:所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。 伦理问题:实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethicalissues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。 文章查重:文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。 文章外审:文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。 作者声明:第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。 文章版权:文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关。 4 参考文献 References ——————————————————————————————————————————————— [1] Hsieh JY, Wang HW, Chang SJ, et al. Mesenchymal stem cells from human umbilical cord express preferentially secreted factors related to neuroprotection, neurogenesis, and angiogenesis. PLoS One. 2013;8(8):e72604. [2] Nartprayut K, U-Pratya Y, Kheolamai P, et al. 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Stem Cells. 2009;27(4):971- 979. 4127 CRTER .org 表 1 各组大鼠心肌组织微血管密度 (x_ ?s) Table 1 Microvessel densities of the myocardial tissue in rats 组别 n 微血管数(个/400倍视野) 正常组 10 59.312?2.166 人脐带间充质干细胞培养液组 10 59.300? 1.918 人脐带间充质干细胞上清液组 10 59.240?2.753 人脐带间充 ——————————————————————————————————————————————— 质干细胞低剂量组 10 59.100?1.700 人脐带间充质干细胞中剂量 组 10 59.640?2.087 人脐带间充质干细胞高剂量组 10 59.540?1.838 F 0.110 P 0.990 A B C D E F 图 1 大鼠心肌组织微血管表达(×400) Figure 1 Expression of the micrangium in the myocardial tissue of rats (× 400) 图注:A为正常组;B为DMEM组;C为人脐带间充质干细胞上 清液组; D为人脐带间充质干细胞低剂量组;E为人脐带间充质 干细胞中剂量组; F为人脐带间充质干细胞高剂量组。各组心肌组 织切片镜下均可见微血管强阳性表达。 [18] Gnecchi M, He H, Liang OD, et al. Paracrine action accounts for marked protection of ischemic heart by Akt-modified mesenchymal stem cells. Nat Med. 2005; 11(4):367-368. [19] Gnecchi M, Zhang Z, Ni A, et al. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. ——————————————————————————————————————————————— 2008;103(11):1204-1219. 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