仙台病毒F基因的表达与间接ELISA检测方法的建立和应用

仙台病毒F基因的达与间接ELISA检测方法的建立和应用 扬州大学 硕士学位论文仙台病毒F基因的表达与间接ELISA检测方法的建立和应用 姓名:王宗耀 申请学位级别:硕士 专业:动物学 指导教师:高诚 20070601 扬州大学硕士学位论文 , 符号说明,,, ,,,,, 分钟, ,,,, 小时, ,,, 天,,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,, 转每分钟,,, ,,,,,, ,,,,, 仙台病毒,;, ,;,,,,,,,, ,,,,, 鼠痘病毒,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,， 呼肠孤病毒，,型,,, ,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,, 小鼠肝炎病毒,,, ,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,;, 小鼠肺炎病毒,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,, 磷酸盐缓冲液，,,, ,,,,,,,,,—,—,,,,,,,,;,,,,,, 异丙基硫代一,—,一半乳糖苷,, ,,,,,,,,,, 千道尔顿,, ,,,,,,,, 碱基对,,, ,,,,,, ,,,,;,, ,,,,,,, 十二烷基硫酸钠,,, ,,,,;,,,,, 氨苄青霉素,,, ,,,,,,;,, 卡那霉素,, ,,,,,,,, 纳克,,， ,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,, 酶,, 联免疫吸附实验,,,,, ,,,,,—,,;,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, 脱氧核苷三磷酸, ,,,,,,,,,, 摩尔每升,, ,,,,,,,,,,,,,,, 毫摩尔每升,,(,,, ,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,, ;,,,, ,,,;,,,, 逆转录聚 ,,,,,,,,,, 微升,, ,,,,,,,合酶链反应, ,,,, 升, ,,, 毫升,, ,,,,;,, ,,,,,,, 光密度，,, ,,,,,,,,,,,,,, , 免疫球蛋白, 壬宗耀: 仙台病毒,基冈的表达与间接,,，,,榆测方法的建讧及戍用 仙台病毒,基因的表达与间接,,，,, 检测方法的建立及应用 研究生:王宗耀 导 师:高诚研究员 摘要 仙台病毒(,,,,,,,,,,,，,,,)属于副粘病毒科副粘病毒属，是一个单股负链,,,病毒，小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠等啮齿类实验动物均易感。仙台病毒传染性强、易扩散，一般呈隐性感染，是啮齿类实验动物最难控制的病毒之一，鼠群感染仙台病毒后会改变体内细胞免疫反应，干扰试验结果，因此建立快速诊断方法十分必要。 目前，检测仙台病毒主要用酶联免疫吸附法(,,，,,)检测仙台病毒抗体，,,,可以在,,,,,,和,,,,,细胞上生长，但很难获得高滴度的病毒，鸡胚培养虽然能获得高滴度的病毒，但纯化的病毒粒子保留有鸡胚蛋白，干扰检测的特异性。本研究利用大肠杆菌表达系统,,,,,表达仙台病毒,蛋白高抗原部分,,(,)，用纯化的融合蛋白作为包被抗原建立,,，,,方法，可用于仙台病毒血清抗体的快速检测。,仙台病毒,,(,)基因的克隆、表达及抗原制备 根据已发表的,,,(,,:,,,,,,,),基因序列设计特异性引物，以逆转录的仙台病毒;,,,为，用,,,,,,方法扩增出,基因高抗原性片段,,(,)，将其插入到,,,,,(,载体中测序鉴定后，测序正确的,,(,)基因片段克隆入,,,,,原核表达载体中，转化大肠杆菌,,,，，,,,诱导表达，纯化重组蛋白,,(,)。用,,,(,,,,和,,,,,,,,,,,,对表达产物进行验证，结果表明，表达的融合蛋白,,(,)分子量为,,,,，与预期大小相符，能与,,,阳性血清发生特异性反应，说明,,(,)有很高的抗原性，可以作为检测仙台病毒血清抗体的抗原。 扬州大学硕士学位论文 ,,检测仙台病 毒抗体的间接,,，,,检测方法的建立及应用 用,,,,,表达的仙台病毒融合蛋白,,(,)免疫,周龄,,,,,;小鼠，免疫,次后收集血清，以融合蛋白,,(,)为包被抗原，免疫鼠血清为阳性抗体，建立检测仙台病毒抗体的间接,,，,,方法，结果表明建立的间接,,，,,方法有很好的特异性、敏感性，可用于仙台病毒的抗体的快速检测。关键词:仙台病毒;,基因;,,,,,;克隆;原核表达;酶联免疫吸附实验 王宗耀: 仙台病毒,基因的表达与间接,,,,,检测方法的建立及应用 , ,,,,,,,,,, ,, ,,,—, ,, ,(;,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,;,,,,, ,, ,, ，,,,,,;, ,,，,, ,,, ,,,,;,,,, ,, 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,,,,年，首先在日本分离到了仙台病毒，继而世界各地都有报道【,,。本病一年四季均可发生，但以冬春季多发，加强日常监测，建立无仙台病毒的鼠群，是提高啮齿类实验动物质量的重要措施之一。,仙台病毒结构特征 仙台病毒粒子多呈圆形，直径,,,,,,,,,，病毒内部由直径为,,,,螺旋状结构的核蛋白组成,,】，外包有脂蛋白包膜，其上有放射状排列的纤突，纤突长,,,,,,,。典型的仙台病毒是单股负链,,,病毒,,,，基因组大小为,,,,,,,，从基因组,’一,’依次编码,,,,核壳蛋,叼，,,,,磷蛋白(,)，,,,,基质蛋白(,)，,,,,融合蛋白(,)，,,,,血凝素(神经氨酸酶 图，、仙台病毒颗粒模式图,,,,，,和,,,,,大蛋白(,)，其基因排列次序为,’(,,,,,,,,—,，,(,一,,,,(,,,,,,,卜,，，在,，端和,’端各有一段前导序列(,】。,分子生物学特征 在整个,,,的,,,,,个核苷酸中，分布着,个基因区和两个前导区，这,个基因 扬州大学硕十学位论文 图,、仙台病毒基因组结构区中存在着,个开放阅读结构，特别有趣的是,,,,(,(,，;)中的,,(,包含了另外一重叠的开放阅读结构,,(,，占,,,个核苷酸，编码,,,个氨基酸，,,(,的蛋氨酸密码子(,,,)定位在,,(,下游第,个核苷酸处，这种两个重叠的开放阅读结构也发生在流感病毒,和副流感病毒等，整个基因组,,,被,蛋白亚单位紧紧包裹起来，并结合于,和,蛋白亚单位组成的聚合酶,,,,，,〕。 病毒包膜含有两个糖蛋白,,和,，,,具有血凝活性【,,，可使病毒和细胞表面含唾液酸的受体结合，使病毒吸附于细胞表面，,,还具有神经氨酸酶活性，使细胞表面的受体失活，使病毒从细胞表面脱落【, ,,，同时,,还具有促进融合作用。,蛋白需要与细胞膜融合后，将基因物质介入到细胞浆中，包膜脂双层来源于细胞膜，最后组装并以出芽方式形成新的病毒…,，,蛋白还可以介导病毒与细胞融合或细胞与细胞融合，具有溶血活性,,,,。在包膜和,,,核糖核蛋白中间有一个,层，,蛋白在装配方面起到了非常重要的作用。,蛋白在转录和复制的起始、延伸、终止以及,,,,的甲基化，戴帽中发挥作用，,蛋白还具有蛋白激酶的作用。 仙台病毒,,, ,’端和,’端各有一个前导区，,’端前导区占前,,个核苷酸序列，富含,，它与第一个基因之间是一个保守的,,,,序列【,,】，这个连接前导区与第一基因的,,,,序列，也存在于,,,病毒中。,’端前导区占最后,,个核苷酸序列，,’端的一半富含,，,’端的一半富含,。 ,蛋白是高度疏水的，这个蛋白的最疏水区在邻近,末端的第,,,,,,,位上，紧跟其后的是一段,,个氨基酸的亲水区，,蛋白横穿病毒包膜，至少有,,,的蛋白暴露在包膜的内部【,,。邻近;端的疏水区可以使,蛋白固定在膜上，,端亲水区突出在膜的内表面并与,蛋白相互作用。,蛋白的,端,,个氨基酸被认为是一段信号 王宗耀: 仙台病毒,基因的表达与间接,,，,,检测方法的建立及应用 ,肽(,,,,,,, ,,,,,,,)，信号肽是,蛋白特有的性质，在,,,,,位上,,,,,,,—,,,—，,,的每个肽键都能是信号肽酶的切割点。,蛋白的结构为,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,一,,一,,,,，位于,,,位的, ,,残基是,,与,,的分割点。,蛋白有,,个半胱氨酸残基，其中,个在信号肽上，,个在,,蛋白上，,个在,,蛋白上，位于,,上,,位的,,,是,,与,,的二硫键形成位置。,,蛋白上,个半胱氨酸残基聚集在中部，从,,,位至,,,,位。,蛋,,,级结构上，有许多逆转发生在半胱氨酸聚集区，分子内的二硫链形成稳定的三级结构。,蛋白有,条,端连接的碳水化合物链，连接点为,,,,,(,,,或,,,,,(,,,，发生在氨基酸位置,,,,,,,，,,,,,,,，,,,,,,,，,,,,,,,。 与,蛋白形成对照的是，,,蛋白的最疏水区定位在邻近,端，,,,，从,,,,,位，位于,,个氨基酸组成的亲水区之后,,,,。这段邻近,端的最疏水区是作为膜转位的信号和,,蛋白固定于膜上的锚，之前的,,个氨基酸组成的亲水区暴露在病毒包膜之内‘坦,。,,蛋白也是横穿病毒包膜，暴露在包膜内的部分的分子量至少,,,〔,,,。,,蛋白存在,个,连接碳水化合物结合点，,,,,,，,,,,,,,，,,,,,,,，,,,,,,,，,,,,,,,,,,】, ,蛋白是非糖蛋白，位于囊膜内表面，一部分镶嵌在囊膜内，另一部分与核衣壳相临，共同构成囊膜支架,,,。,蛋白至少含有两个功能区〔,,，一个是蛋白质在脂质双层上的嵌合部位;另一个区域与病毒核心中的核衣壳结构相互作用有关。,蛋白有多种功能，其一是通过与细胞膜、病毒糖蛋白的胞质区以及核衣壳的相互作用而参与病毒的装配过程，从而对形成具有感染性的病毒粒子至关重要;其二是具有抑制宿主细胞，?,转录和蛋白质合成的作用而与病毒的致病性相关【,’,,】;另外,蛋白还有八对碱性氨基酸残基，他们对多肽与病毒核心的结合可能比较重要。,蛋白富含碱性氨基酸残基，不存在信号多肽链，,蛋白的合成是在自由多核糖体上，并不在膜连接的多核糖体上，而在邻近,端存在疏水区。 在,,蛋白二级结构中，随机螺旋(,,,,,, ;,,,)结构占残基的,,,，,一扭转(,?,,,,,)包含,,,的残基，小螺旋(,,,,,,,)和,一链(,,(,,,,,,)各占残基的,,,和, ,,【,】。尽管,,分子中残基呈现相等的正负极，但是它们作用却是不相等的，,,蛋白的氨 扬州大学硕十学位论文 ,,基末端是分子中紧接病毒,,,的部分，这些碱性氨基酸与,,,的负性的磷酸根相互作用,,,。,,蛋白羧基末端区包括许多磷酸化氨基酸，更增加了负电性，使整个分子具有轻微负的等电点，这个区域的负电性使得,,分子在病毒成熟时能与正电性的,蛋白分子相互作用【, ,,。在蛋白,,,,,,,位是一段相对无极性的疏水区，埋在核蛋白的三级结构中，或与邻近,,分子发生非共价联系。 ,蛋白具有二个蛋白激酶所拥有的,,,结合位点，,蛋白在连接和利用,,,时，至少具有以下三个关链的活性【,,,:,)在聚合酶作用中连接底物,,,,,;,)多,化;,)蛋白激酶活性负责,,和,蛋白的特殊磷酸化，这两个,,,结合点由一个富含,,,花边结构在,,,,,个残基的距离上连接一个,,,组成，位于,蛋白的,,,,位和,,,,位嘲。在,,,,,,,,,是,,？,,,个氨基酸组成的高度保守区，它是,蛋白的重要功能区，上述提到的,,,聚合酶花边和,,,结合点就位于这个区内;另外在,蛋白上还存在一个约,,,个氨基酸组成的亲水区，是酶的活性位点。,理化特性 仙台病毒对乙醚及热极其敏感，,,,(,条件下极易灭活。血凝素对温度的抵抗力决定于病毒溶液的组成，纯化病毒在盐溶液中或,,柠檬酸钠溶液中，,,。,,,,,,,失去血凝活性，但在肉汤中在上述条件下 不受破坏【,,,，,,。,,,,,,可灭活病毒的血溶活性。病毒血溶素对,射线的抵抗力大于毒粒的感染力，小于血凝素。 仙台病毒在,”,或室温条件下可凝集多种动物的红细胞，包括鸡、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠、绵羊、人、鸽、猴、兔、牛等动物的红细胞，但不凝集马红细胞，其中以鸡的红细胞凝集效价最高,,,〕。病毒与鸡、鸽、豚鼠、大鼠、猴、小鼠和人红细胞的血凝滴度在,,(,,”,反复振荡后可完全损失【引。仙台病毒可溶解多种动物红细胞，如小鼠、豚鼠、大鼠、人、绵羊、兔等红细胞，其中以小鼠、豚鼠红细胞最为敏感。感染仙台病毒的鸡胚尿囊液在蒸馏水中透析后或反复冻融后，其血融活性明显增高;血溶反应最适,,值为,—,;血溶反应可被,,,，所抑制，,,”,,,,,,可使血溶素完全灭活【,】,根据仙台病毒的血溶活性可以进行血溶抑制实验以毒株抗原性差异。 仙台病毒的血溶性和感染性，经乙醚、胰酶和福尔马林处理后可被破坏。 王宗耀: 仙台病毒,基因的表达与间接,,，,,检测方,老的建立及应用 图,、仙台病毒复制过程,转录和复制 仙台病毒基因组的转录和复制与副粘病毒科其他种属的病毒类似,?。病毒首先由其,,或者,与敏感细胞表面受体结合【, ,,，仙台病毒的, ,蛋白结合细胞表面的唾液酸脂质受体，即神经节菅脂，融合蛋白,构象发生变化，释放融合肽，病毒包膜与质膜发生融合，释放螺旋化的核衣壳到胞质中【,,】，再进一步产生脱壳和进行转录和复制开始，转录和复制的全部过程都是在胞质中完成〔,,,。 仙台病毒携带有病毒编码的聚合酶,,,】，当病毒包膜和细胞质膜融合时，多个拷贝的,(,聚合酶也随同核衣壳进入胞质中，聚合酶从基因组(,,,,,,’端先导序列开始,,,,转录或合成反义基因组，,,,,,，转录不需要特定的启动子，所合成的,,,,,’端有帽子结构，,’端有长约,,,个碱基的,,,,(,)尾巴。病毒通过初步转录和翻译成各种病毒蛋白后，开始合成反义基因组,,,，在由反义基因组,,,复制成子代病毒基因组(,,,,,，在反义基因组合成子代病毒基因组复制过程中需要,(,聚合酶和未组装的,,蛋白参与，同时也受到,,蛋白合成的调节【,,,。,,蛋白与病毒基因组相结合【,】，表面蛋白在向细胞表面运输的过程中，经过内质网和高尔基体被糖基化，到达细胞质表面时，形成病毒囊膜，进而从质膜表面出芽，形成完整的病毒粒子。 扬州大学硕,:学位论文 带衣壳的,,,,,,呈现转录模板的作用，(,,,,,合成病毒,,,,，核衣壳保护核酸不被核糖核酸酶降解【,,,，,,,,在核糖体上翻译病毒的各种多肽和蛋白质，只有在病毒,,,发生转录以及,,,,翻译为病毒多肽后才发生病毒,,,的复制。,流行病学 在自然条件下仙台病毒感染发生在小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠上,,，,,〕，不同品系小鼠对仙台病毒的易感性明显不同，较易感的小鼠品系有,，,、,,,、,,,,,,,、,,,,,裸鼠、,,,,,等，抵抗力较强的品系有,,,,,、,,,,、,,,,,,,、,,,,,、,,,,,、,,,,,;等〔,,,。实验条件下，雪貂可鼻内感染，引起发热、肺炎和死亡。仙台病毒对人有一定的致病性，日本、苏联及我国都有仙台病毒感染人的报道，特别是幼儿。空气和直接接触是病毒传播和扩散的方式，相对湿度高和空气流通慢可促进空气传染埘。本病一年四季都可发生，但以春季多发，环境因素的突变可加重发病和流行。,临床症状与病理变化 感染仙台病毒主要表现有两种不同的感染类型〔,,,: 慢性型:呈地方性流行，病毒在鼠群中长期存在。多见于断乳后不久的至,,,的小鼠，通常为 亚临床感染，病毒存活,,,左右。 急性型:常表现临床症状，在较短的时间内自愈或者转为地方流行。病鼠常表现为被毛粗乱，弓背，呼吸困难，眼角有分泌物，发育不良，消瘦等症状，怀孕母鼠妊娠期延长，新生乳鼠死亡率增加。 大体解剖观察:主要病变出现于呼吸道和局部淋巴结。肺呈杨梅色，切开时有泡沫状血样液体流出。病交多见于尖叶，膈叶和心叶。 组织病理学观察:分为三个阶段，急性阶段表现为炎症反应和靶细胞溶解;修复阶段表现为再生的靶细胞上皮增生;恢复阶段表现为实质癍痕化收缩。,诊断 对小鼠、大鼠仙台病毒的诊断最传统、最经典的方法是病毒分离。仙台病毒 王宗耀: 仙台病毒,基因的表达与间接,,，,,检测方法的建豇及应用主要存在于啮齿类动物呼吸系统中，从小鼠唾液和肺部,,,,、从大鼠鼻腔和肺部采取病料，接种,,,(,,或,,,,细胞，或是,日龄,,,鸡胚绒毛尿囊腔，进行病毒分离培养，该方法比较耗时、繁琐。仙台病毒具有凝集动物红细胞的特点，使血凝抑制试验(,)检测仙台病毒抗体得到了发展【,,】。此试验简便易操作，但要选择敏感性的红细胞，要严格控制试剂，以减少试验不稳定性和阅读结果主观性强的问。补体固定试验(;,)需要注意过夜温育，血清需要做系列稀释 峁 卸ㄖ鞴坌郧壳也固宓牡味戎苯佑跋旒觳獾淖既沸浴荆臁俊,商ú《镜乃 卸局昕乖 嗤 挥幸恢盅 逍停 攵钥固宓拿噶 庖呶 椒ǎǎ牛蹋桑樱粒?椒ǚ?购芸欤 牛蹋桑樱良觳庀商ú《究固逶玻 舾行愿撸 觳馐约烈妆曜蓟 乖 菀妆,妫 ü 怼?炕 霾《玖,永粗票缚乖 冉下榉扯 矣跋 龋眨恋瓤冢丁坑酶俗床《颈泶锵低潮泶锏南商ú《荆危械焓笛榈奶匾煨浴,茫龋稀 鞍鬃骺乖 ?牛酰樱粒 扔萌 《咀骺乖 模牛蹋桑樱练椒ㄓ懈 锰匾煨浴,庖哂 饪固宸ㄓ薪虾玫拿舾行裕 枰 庀晕?担 皇室嘶 愕ノ坏募觳庵 瑁 谴朔椒 梢越 卸 浚 商ǜ呙庋 逯票赋筛摺?小?腿 霰曜嫉味龋 芬煌 屑觳猓 老嘤Φ挠 庑藕沤 信卸ā,胱远 坑 馐匝橥 牛蹋桑樱料啾龋 且桓黾虻ァ?焖俸腿菀椎募觳庀商ú《究固宓姆椒ǎ保玻罚薄,嘀胤治鱿低车姆?垢 逖д锒洗 戳诵碌姆?梗 欤恚颍幔睿 鹊取荆玻浮坑茫蹋酰恚椋睿澹 径嘀卣锒舷低辰 ? 奔毂担簟常保爸中?蟛《炯觳夥椒ǎ 痛 车模牛蹋桑樱练椒ㄓ邢嗨频拿舾行院吞匾煨浴?免疫荧光法检测大、小鼠仙台病毒,,,,，将异硫氰酸盐荧光素标记仙台抗血清，检测隐性感染初期的仙台病毒，此方法也同样存在特异性的问题。亲和素(生.