人头发角质蛋白制成的角质蛋白薄膜药物渗透性研究

人头发角质蛋白制成的角质蛋白薄膜药物渗透性研究 人头发角质蛋白制成的角质蛋白薄膜药物 渗透性研究 Lusiana, S. Reichl, C.C.Muller-Goymann Institut fur Pharmazeutische Technologie, TU Branunschweig, Mendelssohnostr. 1, D-38106 Braunschweig 简介 指甲作为人身体的一部分提供的不只是保护功能，也是药物对指甲疾病治疗的屏障。尽管人们研究对指甲疾病治疗的药品，但是，这些药品的来源是非常有限的。牛蹄到迄今为止，仍然是人类指甲可接受的替代品，但是在它们之间的明显不同已经有相关的报告【1】。这些不同可能与牛蹄保存更多的水分有关，这样使其有更大的渗透性，尽管人类指甲，头发和牛蹄是由相近的蛋白质(α型)组成的。因此一种新的指甲模式由人的头发制成被研发，并且，它的物理特性和牛蹄进行比较。 早期的研发显示类似于牛蹄渗透性的这种模式，有三个约束性条件的标识，例如荧光素钠(SF)，异硫氰酸荧光素葡聚糖分子量4000(FD4)和罗丹明B(RB)【2】。 基于这个发现，一个进一步全面的研究已经进行，观察三种渗透促进物质对这两种材料不同的作用(尿素，巯基酸木瓜蛋白酶和木瓜乳胶)，使用荧光素钠，异硫氰酸荧光素葡聚糖分子量4000和罗丹明B标识，它分别代表了水溶性，溶于脂质和大分子药剂模式。 实验准备 材料 头发(金黄色)从当地理发店收集，牛蹄从宠物店在线购买(Edinger)，从尿液准备的Shindai溶液，硫脲(Roth-Germany), 2-巯基乙醇和Trizma培养基(Sigma-USA)。一个Spectra/Por薄膜(MWCO:6-8,000 Spectrum实验室，INC. Rancho Dominiguez, Canada)被使用于透析管。荧光素钠购买于Fluka德国，异硫氰酸荧光素葡聚糖分子量4000购买于Sigma Steinheim, 罗丹明B购买于Fluka瑞士。尿素从Roth(Karlsruhe,德国)购买，巯基酸木瓜蛋白酶从Merch(Hohenbrunn德国)购买，木瓜乳胶从Sigma Aldrich(Steinheim德国)购买。PH为7.4磷酸盐缓冲液根据欧标PH6.0准备的，使用水是经过二次蒸馏的。 角质蛋白薄膜生产商 人头发角质蛋白的提取是根据一种叫Shindai的方法在还原条件下进行的【3】。这个过程示意图在图1中显示。 前面进行研究的120μm厚的角质蛋白薄膜在这个测试中继续被使用，基于它和100μm厚牛蹄的相似渗透性。【2】 牛蹄薄膜的准备 只有牛蹄唯一一部分在这个研究中使用。这个部分被切成(2cm?2cm)的正方形，经过一夜在水中浸泡，然后切成100μm厚的片。为了渗透性目的这些切片被打上(直径=15mm)的孔。 渗透性研究和渗透促进剂的使用(Pes) 渗透性测试的进行使用在32?下修改的Franz扩散细胞。先前处理的牛蹄膜和角质蛋白膜进行一小时水合在磷酸盐缓冲液中然后固定在隔离层中(捐助层和接受层)。接受层灌注磷酸盐缓冲液捐助层灌注渗透促进剂溶液。 在进行渗透使用中对每个渗透促进剂进行调整测试。所有的渗透促进剂被溶于水中(除了木瓜乳胶溶于磷酸盐缓冲剂中)，浓度为(所有单位w/w)40%用于尿素(3天)，浓度5%用于巯基酸木瓜蛋白酶(15小时)和浓度2%用于木瓜乳胶(15小时)。尿素和巯基酸木瓜蛋白酶混合液(15小时)并且连续性测试(尿素3天+巯基酸木瓜蛋白酶15小时)也同时进行。细胞在测试中保持室温;除了木瓜乳胶(32?)。在测试后，两个隔离层被冲洗两遍使用二次蒸馏的蒸馏水和磷酸盐缓冲液。 接收层灌注磷酸盐缓冲液捐助层灌注有标记液的磷酸盐缓冲液(SF500μg/ml, FD41000μg/ml和RB250μg/ml)。接收层提取100μm的液样进行7-30小时测试然后使用新鲜缓冲液替换。用λ激发荧光酶标仪对样品的荧光强度进行了分析(Tecan瑞士)，λ激发在485nm,λ发射射线在535nm,λ激发射线在590对于罗明丹。 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(电泳图) 电泳图是分离角化蛋白的蛋白质，根据它们的分子重量分析的图示。这种堆积和溶解的凝胶的准备分别是聚丙烯酰胺浓度12%到10%。电泳在180伏，80毫安和25瓦下运行。然后这些凝胶用考马斯亮蓝染色。 结果和讨论 在渗透促进剂作用下，三种标示剂渗透性参数对于角质蛋白薄膜来说很高(P<0.01),和牛蹄比较。例外的是使用40%UR(图2)促进剂的SF和5%TA促进剂的RB(图4)。 当牛蹄材料通过使用不同促进剂渗透性增加在SF的测试中，RB通过牛蹄材料的渗透性也在增加(P<0.01),这种情况只是在TA促进剂处理后才有。 对于大分子复合材料FD4，促进剂促进效果明显的提高，尤其在混合使用或连续使用上。这些对于促进剂不同的反应是根据薄膜材质不同的存水能力决定的(渗透性促进剂)。牛蹄薄膜比角质蛋白薄膜存水要高出自身重量的45%，而角质蛋白薄膜只有5%。 这种性质直接影响了薄膜的PH值和对渗透性标记液量的反应。例如，RB，一种碱性染料，应该可以给出一个高的通量在一个酸性环境中，例如在5%TA溶液(PH1.6)(P<0.01)替代40%的尿素溶液(PH9.2)。 结论 尽管角质蛋白薄膜中的蛋白质元素非常接近人的指甲(图5)，但是在使用角质蛋白薄膜替 代手指甲的模式还需要根据情况来选择基于现在的研究。结论必须很仔细的被定论，除非渗 透性促进剂被使用。 参考 【1】 Khengar R. H., et al., Pham. Res., 2007; 24(12): 2207-12 nd【2】 Lusiana, Reichl, S. And Muller-Goymann, C. C., 2 Pharm SciFair, 2009. 【3】 Nakamura A., et al., Biol. Pharm. Bull,. 2002; 25(5): 569-72.