微生物作业指导书.doc

微生物作业指导书.doc 湖南临武舜华鸭业发展有限责任公司 微生物作业指导书 文件编号: 版本: 页数: 生效日期:2011年 编写:__________ 日期:__________ 审核:__________ 日期:__________ 批准:__________ 日期:__________ 分发日期: 目录 前言:微生物检验员工作流程…………………………………………1 第一部分:准备工作……………………………………………………..3 第二部分:微生物检验相关技术………………………………………..7 第三部分:相关仪器设备的使用…………………………………........10 第四部分:具体的检测……………………………………………13 1. 高清洁区空气沉降菌检测方法…………………………………….13 2. 食品直接接触面卫生微生物检验………………………………….15 3. 食品用水卫生微生物检验………………………………………….17 4. 菌落总数的测定……………………………………………………19 5. 大肠菌群的测定…………………………………………………….23 6. 商业无菌的检测出 …………………………………………..…….26 第五部分:相关表格……………………………………………………32 前言 微生物检验员工作流程 一、 目的 做好原料、成品的微生物实验，新品的保质期跟踪实验，检验生产过程中高清洁区的卫生情况，保证成品的微生物指标符合要求。 二、 工作职责 1(负责原辅料、半成品、成品、实验品、工器具、人员、自来水等微生物检测， 并做好相关检验记录。 2(负责成品采样、留样以及送检样品的采集、编号、登记、保管、更新，月底 与车间函接所采样品的归还以及相关数据的核实工作。 3(配合研发部做好新品的微生物跟踪检验工作。 4(负责相关记录的整理、归档、保管工作。 5(负责总结月度/年度微生物检测情况。 6(负责所使用仪器的保养及维护。 三、 主要工作流程 A、月初/年初做好工作计划 B、具体的检测工作 1(准备工作 ? 填写微生物检测台帐 ? 将剪刀、烧杯、垃圾袋、包装完好的非透明包装样品、酒精灯、75%酒精棉、镊子、电子称放入无菌室，工作服、工作帽、工作鞋、口罩放入缓冲间进行紫外线消毒30min，关闭紫外灯过一会才能进入无菌室进行无菌操作。 ? 将吸量管用报纸包好、培养皿码好，分别放入相应的金属筒内，在恒温鼓风干燥箱内进行干热灭菌，160?，2h，取出冷却至室温。 ? 准备相应数量的9ml及225ml生理盐水(0.85%);同时按操作说明配好所需培养基，烧开、冷却、分装。 1 ? 将准备好的生理盐水及培养基放入灭菌锅入进行湿热灭菌(121?，15min)，注意不可放得太过紧密，否则可能会灭菌不完全。灭完待压力降至0，取出冷却至室温，查看液体培养基内的小倒管是否有气泡，将有气泡的剔除;培养基应放在水浴锅内或放在灭菌锅内使之保持在45?左右。 2(无菌操作及培养 参考GB4789.2-2010、GB4789.3-2010 3(结果与报告 依据GB4789.2-2010、GB4789.3-2010中的相关内容出具微生物检测原始记录。 4(及时输入电脑，整理电子版的台帐。 C、每月对工器具、人员、自来水(直接加入到食品中去的)等进行微生物检测。 D、月底与车间函接所采样品的归还以及相关数据的核实、整理、归档相关记录、做好微生物检测情况的总结分析。 E、注意所使用仪器的保养及维护 主要包括以下几个方面:? 培养箱:保证培养箱内的湿度，方法是用一个小容器装一些水放入到培养箱内;定期对增养箱进行清洗消毒。 ? 灭菌锅内最好加蒸馏水，加热用水每个星期换一次，怕结起的水垢堵住排气管。 F、每天要对所使用的工器具进行清洗，接种了致病菌的移液管或是长了较多细菌、培养了致病菌的培养基及其它相关的用具均要进行灭菌之后方可清洗，保持整个工作环境的干净整洁，特别要注意窗户的卫生。 四、相关文件记录 《GB789》 《成品微生物检测记录》 《商业无菌原始记录》 《成品出厂检验台帐》 《高清洁区空气沉降菌原始记录》 《饮用水微生物检测原始记录》 《食品直接接触面的微生物检测原始记录》、 2 第一部分:准备工作 一、无菌室的准备 1. 无菌室的杀菌 (1)紫外线灯照射 在每次工作前后均应打开紫外线灯，分别照射30min，进行杀菌。 (2)熏蒸 先将室内打扫干净，打开无菌室的门通风干燥后，重新关闭好再进行熏蒸杀菌。常用的熏蒸药剂为福尔马林(含37%~40%甲醛的水溶液)。按 3的用量盛于铁制容器中，加半量高锰酸钾，通过氧化作用加热使福尔6-10ml/m 马林蒸发。熏蒸后应保持密闭12h以上，最好是隔夜。甲醛气体未散尽而要使用无菌室时，则在使用无菌室之前1-2h，按所用甲醛溶液量量取氨水，倒入搪瓷盘内，放入无菌室，使其挥发中和甲醛气体的刺激作用。除甲醛外也可用乳酸(细菌较多时)，硫酸等进行熏蒸杀菌。 (3) 石碳酸液喷雾 在进接种室操作前，用手持喷雾器喷5%石碳酸溶液，主要喷于台面和地面，以防空气微尘飞扬。 2. 无菌室操作的 (1)将所用的材料、用品先全部放入无菌室内，以避免在操作过程中进出无菌室或传递物品，使用前打开紫外线灯，照射半小时后，关闭紫外线灯，过一会儿才能使用。 (2)进入缓冲间，换好消过毒的工作服、鞋、帽，戴上口罩。 (3)操作前用酒精棉球擦手，然后严格按无菌操作进行工作。 (4)工作后应将台面、地面收拾干净，废物丢入废物桶内。 二、玻璃器皿的准备 微生物学实验常用的玻璃器皿，主要有试管、吸管、培养皿、三角瓶、载玻片、盖玻片等，都需要经过清洗，达到无灰尘，无油垢和无机盐等杂质后，才能保证获得正确的实验结果，有的器皿还需经包装、灭菌后方能使用。 1.洗涤剂的种类及应用 (1)水:水是最重要的洗涤剂，但只能洗去可溶解于水的沾污物。油、蜡等不 3 溶于水的沾污物则必须用其它方法处理后，再用水洗。对于要求无杂质颗粒或无机盐离子的玻璃器皿，在用清水洗过后，应再用蒸馏水进行漂洗。 (2)肥皂:肥皂是常用的很好的去污剂。有油污的器皿，通常用湿刷子涂抹一些肥皂后，刷洗器皿，再用水清洗。用5%热肥皂水去油污能力也很强。 (3)洗衣粉:洗衣粉有很强的去污、去油能力。用1%的洗衣粉溶液洗涤玻璃器皿，特别是洗涤带油的载玻片和盖玻片，如果加热煮沸，则有很好的清洁效果。 (4)洗涤液:重铬酸钾(或重铬酸钠)的硫酸溶液，是一种去污能力很强的强氧化剂，常用于玻璃或搪瓷器皿上污垢或有机物的清洗，但不能用于金属器皿。配好的洗涤液可多次使用，每次用完后倒回原瓶中保存，直至溶液变为青褐色时才失去效用。使用洗涤液应尽量避免混入水分稀释。将洗涤液加热至40?-50?后使用，可以加快作用速度，用洗涤液洗过的器皿，应立即用水冲洗干净。当器皿上带有大量有机物时，应先将器皿上的有机物尽量清除后，再用洗涤液洗涤，否则洗涤液很快失效。 洗涤液具有很强的腐蚀性，溅在桌椅上，应立即用水洗并用湿布擦拭，皮肤及衣服上沾有洗涤液时，应立即用水冲洗，然后用苏打水(碳酸钠)或氨水洗去洗涤液。 (5)浓硫酸与强碱液:器皿上如沾有煤膏、焦油及树脂类物质，可用浓硫酸或40%氢氧化钠溶液浸洗，处理所需时间随所沾物质的性质而定，一般只需5-10分钟，有的需数小时。 (6)有机溶剂:有时洗涤浓重的油脂物质及其他不溶于水也不溶于酸或碱的物质，需要用特定的有机溶剂。常用有机溶剂有汽油、丙酮、酒精、苯、二甲苯及松节油等可根据具体情况选用。 2.常用玻璃仪器的洗涤方法 (1)新玻璃器皿的洗涤:新购置的玻璃器皿应用2%盐酸溶液浸泡数小时后，再用水冲洗干净。 (2)用过的玻璃器皿的洗涤:盛过培养基的玻璃器皿，应先将培养物倒入或刮入废物缸中，另行处理。如对人有致病作用的培养物需经煮沸灭菌后再倒去及洗涤。 4 (3)吸管的洗涤:吸取过一般液体的吸管，用后浸没在盛有清水的容器内，切勿使管内物干燥以免增加洗涤的麻烦。吸过菌液的吸管，应先浸入5%石碳酸溶液内，经5分钟以上灭菌后，再浸入清水中;吸过油脂液体的吸管，应先浸入10%氢氧化钠溶液中，浸1小时以上，再进行清洗。无菌操作所用过的吸管，应先用钢针将棉塞取出后再洗涤。吸管洗涤后可倒立于垫有干净纱布的容器中，待水滤干后再用，如急用可放电烤箱内60-70?烤干备用。 (4)载玻片及盖玻片的洗涤:新载玻片和盖玻片，应先在2%的盐酸溶液中浸泡1小时，后用自来水冲洗，再用蒸馏水洗2-3次，也可用1%的洗衣粉洗涤。用洗衣粉洗涤时应先将洗衣粉液煮沸，后将载片散开放入煮沸液中，持续煮沸10-15分钟(勿使玻片露出液面以防钙化变质)。冷却后用自来水冲洗，再用蒸馏水换洗2-3次。如再用洗衣粉洗涤新盖玻片时则只能在煮沸的洗衣粉中保持1分钟，待泡沫平下后再煮沸1分钟，如些反复2-3次(煮沸时间过长，会使盖片钙化，易碎)，冷却后再用自来水冲洗，蒸馏水换洗。 用过的载玻片，洗涤方法同上，但应先擦去表面油垢后再用洗衣粉液煮，煮沸的时间以30分钟为好，其余处理方同上法。洗涤后的载、盖玻片，可以烘干或晒干后放在干净的容器内或用干净纱布包好备用。 3. 玻璃器皿的包装灭菌 在微生物学工作中需要无菌的玻璃器皿。如无菌吸管，无菌培养皿等，这些玻璃器皿在灭菌之前需要进行隔离包装，常用的包装方法有: (1)培养皿的包装:洗净干燥后的培养皿，可放在特制的金属容器中，或可按6-10套培养皿为一组，用旧报纸卷起来，将两端封严，放入恒温鼓风干燥箱内160?，2个小时进行灭菌。 (2)吸管的包装:无菌操作用的吸管洗净干燥后，首先在吸管上端的管口内塞棉花，作为隔离及过滤杂菌之用。棉柱长度不少于1cm，一般用脱脂棉为宜，用量根据吸管口径大小而定，以塞得不紧不松为宜，棉花不能弄湿，以免影响空气的流通和滤菌效果，吸管塞好棉塞后用旧报纸包好，也可用金属制成的专用圆筒，将塞好棉柱的吸管成批放入，经160?，2个小时灭菌后随时抽用。 5 三、棉塞的制作技术 1. 棉塞的作用和要求 一般情况下:培养微生物用的试管和三角瓶均需加棉塞(或中性海绵硅胶塞)。用是既要空气的流通，以保证供足微生物生长所需的氧气，又要滤除空气中的杂菌，避免污染。 制作棉塞的基本要求是:松紧适度，太紧影响通气，太松则影响过滤除菌的效果。插入的部分长度要恰当，一般为容器口径的1.5倍，过短则易脱落。外露部分应略为粗大些，且比较整齐硬实，便于手握取。 2. 棉塞的制作方法 制作棉塞应采用普通棉花，脱脂棉易吸水不宜用。 制作方法:根据所做棉塞的大小，选取一块棉花，铺成长方形，把长边的两头各叠进一段，使其叠齐加厚。按住短边把棉花卷起来，卷时两手紧捏中间部分，两头不要卷得太紧，卷成后，从中间折起并拢。插入试管或三角瓶中，深度为容器口径的1.5倍。新做的棉塞弹性比较大，不易定形。插在容器上经过一次加压蒸汽灭菌后形状和大小便基本可固定。为了便于无菌操作，减少棉塞的污染机率，延长棉塞的使用时间，可在棉塞外面包上1-2层纱布，并用棉线扎住纱布断口。 四、培养基的制备及灭菌 培养基煮沸分装后用牛皮纸包好，于121?，15min进行高压蒸汽灭菌。 6 第二部分:微生物检验相关技术 一、无菌操作技术 1.平板接种技术 a. 平板划线法(分离培养) 首先将琼脂培养基融化并冷却到45?-50?，在酒精灯火焰旁，以右手的无名指及小指夹持棉塞，左手打开无菌培养皿的盖的一边，右手持三角瓶向皿里注入 20ml培养基，将培养皿稍加旋转摇动后，置于水平桌面待其冷凝制成平板。15- 然后在酒精灯火焰上灼烧接种环，待其冷却后，以无菌操作法取1环菌液(试管斜面菌苔)伸入平板内划线。划线时，琼脂平板可放在台子上也可以持在手中。 左手握琼脂平板，在火焰旁稍抬起皿盖，右手持接种环伸入皿内，在平板上第一个区域沿S字形来回划线。划线时使接种环与平板表面成30-40?角轻轻接触，以腕力使接种环在琼脂表面作轻快地滑动，勿划破表面。灼烧接种环，待其冷却后，将手中培养皿旋转70?角，用接种环在划过线的第一区域接触一下，然后在第二区域划线，并依次对第三区域和第四区域进行划线。 划线完后，将整个培养皿反转倒置于恒温培养箱内，隔日观察结果。 b. 倾注平板法(菌落总数) 在无菌操作条件下将菌种制成一定稀释倍数的菌悬液，然后用无菌移液管吸取菌液入无菌皿中。以无菌操作法，将融化后冷却至45?左右(手握三角瓶不觉烫手为宜)的琼脂培养基，向加有菌悬液的培养皿内，倒入15-20ml，迅速旋转培养皿，使培养基和菌悬液充分混匀，水平旋转放置。待其凝固后，将平板反转倒置于恒温培养箱中培养，观察记录结果。 c.平板涂布法(接种霉菌) 同“平板划线法”先制备琼脂平板备用，在无菌操作条件下将菌种制成一定稀释倍数的菌悬液，以无菌操作法，将一定稀释倍数的菌悬液，用无菌移液管取一定量于琼脂平板表面，用无菌玻璃刮铲将菌液均匀涂布于整个平要表面即可。静置30分钟，将培养皿反转倒置于培养箱中，观察生长情况。 7 二、染色镜检 1. 细菌简单染色法 步骤:涂片?干燥?火焰固定?冷却?染色?水洗?干燥?镜检。 A. 涂片:在干净的载玻片中央加一小滴蒸馏水，用接种环以无菌操作法从斜面取出少量培养物，在载玻片上与水混合后，用接种环涂成均匀的薄层，自然晾干或微微加热使之干燥。 B.固定:手持载玻片的一端，标本面朝上，如钟摆的速度在酒精灯火焰上通过2-3次，通过高温处理，使菌体易着色，同时可使菌体牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲洗掉。 C. 染色:经火焰固定的涂片，待冷却后，滴加数滴石碳酸复红液于涂片上，并使其完全涂抹，染色1-2分钟。 D.水洗:倾去染料，将载玻片斜置，用细水从玻片的上端流下，洗去多余的染料，直至流水变清为止。冲洗时勿直接用水冲洗涂菌处。 E.干燥:用吸水纸吸干，或置空气中自然干燥，或微微加热，以加快干燥速度。 F.镜检 2.细菌革兰氏染色法 A.原理:由于细菌细胞质壁的化学组成及结构不同和通透性不同可将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。若菌体呈紫色则为革兰氏阳性菌，若菌体呈红色则称革兰氏阴性菌。 B.步骤:涂片?自然干燥?火焰固定?结晶紫染色(1分钟)?水洗?碘液媒染(1分钟)?水洗?95%酒精脱色(30秒)?立即水洗?蕃红复染(1分钟)?水洗?晾干(干燥)?镜检 ? 涂片固定:取被试菌体，按简单染色法涂片固定。 ? 染色:待玻片冷却后进行染色。先用结晶紫染色1分钟，水洗多余染料，再加碘液媒染固定1分钟，水洗。(每次水洗后均不需干燥) ? 脱色:手持载玻片的一端，斜置，用95%的酒精，一滴一滴地加于涂片的上部，直到流下的酒精不现紫色时，约30秒，立即用水冲洗。 ? 复染:用蕃红复染1分钟，水洗、自然干燥。 8 ? 先用低倍镜观察，待找到物象部位后，再用油镜观察。革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 ? 注意事项:涂片上的菌液不能太浓，而且涂抹均匀，否则影响脱色的均匀及观察效果。酒精脱色时间的长短，可以直接影响实验结果，脱色时间过长，阳性菌误染成阴性菌;反之，阴性菌误染成阳性菌;因些必须严格掌握酒精脱色程度的准确性。 相关染色液的配制见GB/T4789.28～现将常用的几种罗列如下: 1.齐氏石炭酸复红染色液 A液: 碱性复红 0.3g～酒精,95%,10ml,用玛瑙研钵研磨配制,。 B液:石炭酸 5g～蒸馏水95ml。 混合A、B二液即成。通常可将上述原液稀释5-10倍使用。稀释液易变质失效～一次不宜多配。 2.草酸铵结晶紫染色液 A液: 结晶紫2.5g～酒精,95%,25ml。 B液: 草酸铵10g～蒸馏水 100ml。 将结晶紫研细后～加入95%酒精使之溶解～配成A液,将草酸铵溶于蒸馏水配成B 液～混合A、B二液即成。 3.路戈氏碘液 碘 1g～碘化钾 2g～蒸馏水 300ml。 先将碘化钾溶于小部分的蒸馏水～然后加碘片并摇荡～使碘片完全溶解后～再加其余的蒸馏水至足量～即成。 4.沙黄,番红,染色液 沙黄 0.25g～95%乙醣 10ml～蒸馏水90ml。 将沙黄溶解于乙醇中～然后用蒸馏水稀释。 9 第三部分:相关仪器设备的使用 1. 高压蒸汽灭菌的使用方法(以手动式灭菌锅为例): (1)加水:首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜，加水不可过少，否则易将灭菌锅烧干，引起暴炸事故。 (2)装锅:放回灭菌桶，将待灭菌物品放入桶内。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角瓶与试管口端不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包扎纸而透入棉塞。 )加盖:将灭菌锅盖盖上，并将盖上的排气软管插入内层灭菌的排气槽内。(3 再以对角线的方式同时旋紧相对称的两个螺栓，并使螺栓松紧一致，勿使漏气。 (4)加热排气:接通电源对灭菌锅加热使水沸腾产生蒸汽，约105?时打开排气阀，以排除锅内冷空气，待冷空气完全排尽即直到放气阀门放出大量热蒸汽时，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。 (5)保温保压:当锅内压力升至所需压力时，控制热源，维持压力(温度)到所需时间。 (6)降温出锅:灭菌所需时间到后，关掉电源，让灭菌锅内温度自然下降。当灭无带倒管的培养基及其它物品时，当压力表的压力降至0时，就打开排气阀，旋松固定螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。注意，如果压力未降到0时打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而造成培养基猛烈沸腾冲出管口或瓶口，污染棉塞，以后培养时引起杂菌污染。当灭菌带倒管的培养基时，要注意等灭菌锅内气压和温度都降到与室温一致或相差不大时再打开灭菌锅。锅压力表示数为0而温度表示数还高于室温时，不要打开灭菌锅。因为打开锅盖瞬间，锅内大量热量散出，温度突然降低，试管内温度也随着降低，导致管内气体减小，沸点降低，部分水会汽化留在小导管内。 (7)保养:灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出，以保持内壁及搁架干燥。盖好锅盖(勿拧螺栓)。灭菌锅里的水若用自来水，每天一换;若用蒸馏水一周一换。 2. 使用恒温鼓风干燥箱的注意事项: (1)灭菌物品在箱内不能堆放太满，一般不要超过总容量的2/3，灭菌物之间应 10 留有一定空隙。 (2)灭菌物品不能直接放在烘箱的底板上，即使需要放得很低，也要用铁筐子架起。灭菌物品的包装物，如纸、棉花或纱布等，不能接触到烘箱的铁板，因为铁板温度一般高于箱内空气温度，容易烘焦着火。 (3)灭菌温度以控制在160?-170?保持1-2小时为宜。超过170?，包装纸就将变黄，超过180?，纸或棉花等就会烤焦至燃烧。如因不慎或其它原因烘箱内发生火花或棉花烤焦或燃烧的事故时，应立即先关闭电源，令其自行降温到60?以上时，才能打开箱门，切勿在未断电源前打开箱门，以免促进燃烧造成更大事故。 (4)正常情况下，灭菌完毕，让其自然降温到60?以下再打开箱门取出灭菌物品，以免骤然降温使玻璃器具爆破。 3. 显微镜的使用 (1)调节光照 正确的照明是获得良好观察效果的前提。调节光照步骤如下: A.将低倍镜旋转到镜筒下方，旋转粗调螺旋使镜头和载物台距离约0.5cm左右。 B.先将光圈完全开放，上升聚光器，使之与载物台表面相距1cm左右。 C.调节光照的大小，使得到最适宜的照明。 一般染色标本用油镜检查时，光度宜强，可将光圈开大，光源开到最大;观察未染色标本时，应适当地缩小光圈，调暗光源，否则光线过强不易观察。 (2)低倍镜观察 低倍镜(4?10?)视野广，焦点浓度较大易于发现目标确定检查位置。其操作步骤是: A.先将标本片置于载物台上，并将标本部位处于物镜的正下方，转动粗调焦螺旋，下降物镜至距标本约0.5cm处。 B.双眼看目镜，同时反时针方向慢慢旋转粗调焦螺旋，使镜筒缓缓上升，使物镜头与标本片的距离缓慢拉大，至视野内出现物象后，改用细调焦螺旋，上下缓缓转动，仔细调节焦距和照明，同时移动推动器，将所要观察的标本部位移至视野中心，直至视野内获得清晰的物及恰当的部位。 (3)高倍镜观察 11 将高倍镜(10?或45?)顺时针方向转至镜筒下方，(在转换物镜时，应从侧面注视，以防镜头与玻片相撞)。调节光圈和照明灯使光线亮度适中，再仔细反复转动微调焦螺旋，调节焦距以获得清晰物象，仔细观察染色标本并移动推动器，选择最满意的镜检标本部位，移至视野中央。待油镜观察。 (4)油镜观察 细菌或其他标本的微细结构，都需要用油镜观察。 油镜(90?或100?)，由于物镜放大倍数与其焦点距离长度相反，即物镜放大倍数越高，其工作距离越短，一般油镜的工作距离在0.19mm左右，故使用油镜必须特别小心，其操作步骤如下: A.用粗调焦螺旋提起镜筒(约1cm)，将油镜转至镜筒下方。在玻片标本的镜检部位，滴一滴香柏油，从侧面注视，用粗调焦螺旋将镜筒缓慢小心降下，使油镜的末端浸入香柏油内直到几乎接触载玻片，但切勿触及玻片，否则油镜头不仅压碎载坡片，而且还会碰损油镜头的前透镜。 B.观察，调节光圈和照明灯使光线亮度适中，再用粗调焦螺旋将镜筒及缓慢地上升，直至视野内出现物象为止(注意绝对不能将粗调焦往下扭，使镜筒下降，以免物镜与玻片相碰而损坏镜头)。然后用微调焦螺旋校准焦距，直到很清晰地看到目的物。 C.如果油镜头离开油滴，仍未见标本上的物象时，则可重新按上述步骤仔细操作，直到看清目的物为止。 (5)显微镜的保养 油镜使用完毕后，必须先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再换用擦镜纸沾少量二甲苯擦试镜头，然后立即换用干净擦镜纸将镜头上多余的二甲苯擦净。用专用的绒布将镜身擦干净，将显微镜的各部位归还原位，最后一手握持镜臂，一手托着镜座将显微镜放回镜箱中。 3. 生化培养箱 (1)保证培养箱内的湿度，方法是用一个小容器装一些水放入到培养箱内。 (2)定期对培养箱进行清洗消毒。 12 第四部分:具体的检测方法 1.高清洁区空气沉降菌检测方法 参照标准:GB/T 16294-2010，《医药工业洁净室沉降菌的测试方法》 一、样品采集: (1)取样频率: a)产品检验结果超内控标准时，应及时对车间进行采样，如有检验不合格点整改后再进行采样检验。 b)正常生产状态的采样，每月一次。 (2)采样方法 2在动态下进行(生产时)，室内面积不超过30 m，在对角线上设里、中、外三 2点，里、外点位置距墙1 m;室内面积超过30 m，设东、西、南、北、中五点，周围4点距墙1 m。采样时，将含平板计数琼脂培养基的平板(直径9 cm)置采样点(离地80-150mm)，并避开空调、门窗等空气流通处，打开平皿盖，使平板在空气中暴露5 min。采样后必须尽快对样品进行相应指标的检测，送检时间不得超过6h，若样品保存于0,4?条件时，送检时间不得超过24h。 (3)采样注意事项 ? 布置采样点时，至少应尽量避开尘粒较集中的回风口。 ? 采样时，测试人员应站在采样口的下风侧，并尽量少走动。 ? 培养皿在用于检测时，为避免培养皿运输或搬运过程造成的影响，宜同时进行对照试验，每次或每个区域取一个对照皿，与采样皿同法操作但不需暴露采样，然后与采样后的培养皿一起放入培养箱内培养，结果应无菌落生长。 二、菌落培养: (1)在采样前将准备好的平板计数琼脂培养基平板置37??1? 培养24 h，取出检查有无污染，将污染培养基剔除。 (2)将已采集样品的培养基在6 h内送实验室，细菌总数于37??1?培养48h观察结果，计数平板上细菌菌落数。 13 (3)菌落计算: a) 记录平均菌落数，用“个/皿”来报告结果。用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5,10倍放大镜检查，不可遗漏。 b) 若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2 个或2个以上菌落计数。 C) 计算公式: M=(M+M+…..M)/n 平12n M平均菌落数 平 ———— M1号培养皿菌落数 1 ———— M2号培养皿菌落数 2 ———— Mn号培养皿菌落数 n ———— n 培养皿的皿数 ———— 三、 结果评定 落下菌数 空气污染程度 30以下 清洁 安全 30-50 中等清洁 安全 50-70 低等清洁 应加注意 70-100 高度污染 对空气要进行消毒 100以上 严重污染 禁止加工 14 2.食品直接接触面卫生微生物检验 参考标准:GB15982-1995 一、样品采集: (1) 取样频率: a)产品检验结果超内控标准时，应及时对车间可疑处进行擦拭，如有检验不合格点，整改后再进行擦拭检验。 b)正常生产状态的擦拭，每月一次。 (2) 采样方法: a) 工作台(机械器具):用浸有灭菌生理盐水的棉签在被检物体表面(取与食品 2直接接触或有一定影响的表面)取25cm 的面积，在其内涂抹10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含100mL灭菌生理盐水的采样管内送检。 b) 工人手:被检人五指并拢，用浸湿生理盐水的棉签在双手手指曲面(采样面 2积约为30 cm)，从指尖到指端来回涂擦10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。 (3)采样注意事项: 擦拭时棉签要随时转动，保证擦拭的准确性。对每个擦拭点应详细记录所在分场的具体位置、擦拭时间及所擦拭环节的消毒时间 二、 细菌?大肠菌群的检测培养: 样液稀释:将放有棉棒的试管充分振摇。此液为1:100稀释液。如污染严重，可十倍递增稀释，吸取1ml 1:100样液加9ml无菌生理盐水中，混匀，此液为1:1000稀释液。 (一)、 细菌总数: (1)以无菌操作，选择1,2个稀释度各取1ml样液分别注入到无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿(平行样)，将已融化冷至45?左右的平板计数琼脂培养基倾入平皿，每皿约15ml，充分混合。 (2)待琼脂凝固后，将平皿翻转，置36??1? 培养48 h后计数。 (3)结果计算: 15 21.物体表面细菌菌落总数(cfu/cm)=(平皿上菌落的平均数×采样稀释倍数)/采样面积 22.手细菌菌落总数(cfu/cm)=(平皿上菌落的平均数×采样稀释倍数)/30×2 (二)大肠菌群: a) 以无菌操作，选择3个稀释度各取1ml样液分别接种到BGLB肉汤培养基中，每个稀释度接种三管。 b) 置BGLB肉汤管于36??1?培养48?2h。记录所有BGLB肉汤管的产气管数。 c) 结果报告:按BGLB肉汤管产气管数，查MPN表报告每平方厘米食品接触面中或每只手的大肠菌群值。 三、结果评定 2菌落总数(CFU/cm) 评价 0,10 可接受 10,100 轻度污染 ,100 不可接受 16 3.食品用水卫生微生物检验 一、样品采集: (1) 取样频率: a) 正常生产的情况下，每月一次，尽量采集不同的点。 (2) 采样方法及注意事项: a) 自来水采样:采样瓶必须预先灭菌，在采自来水时，先用酒精灯灼烧水笼头嘴后将水笼头完全打开1,3min,再以无菌操作采取水样。 b) 取其他水源的水样时，应选择有代表性的地点及水质可疑的地方，一般应距水面10,15cm深处取样。 C) 采取有余氯的水样时应按250ml的水样加入1.5%的硫代硫酸钠溶液1ml于水样瓶的空瓶中，然后121?，15min高压灭菌，以中和水样中的余氯，终止氯的杀菌作用。 d) 采样时所采的水量为容量的80%左右，以便在检验时可充分摇匀水样。 e) 采得水样后应立即记录水样名称、地点、时间等项目，并从速检验，一般从采样到检验不应超过2小时，如放在冰箱中保存也不应超过4小时。 二、 细菌?大肠菌群的检测培养: 样液稀释:将水要用力振摇20-25次，使可能存在的细菌团得以分散。此液为自来水原液;另吸取1ml原液加入到9ml无菌生理盐水中，混匀，此液为1:10稀释液;再取1ml1:10的稀释液于9ml无菌生理盐水，混匀制成1:100稀释液。 (一)菌落总数: (1)以无菌操作，选择1,2个稀释度各取1ml样液分别注入到无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿(平行样)，将已融化冷至45?左右的平板计数琼脂培养基 ，充分混合。 倾入平皿，每皿约15ml (2)待琼脂凝固后，将平皿翻转，置36??1? 培养48 h后计数。 (3)结果按GB4789.2-2010的计算方法计算和报告。 (二)大肠菌群: 012a) 以无菌操作，选择3个稀释度(10、10、10)各取1ml样液分别接种到BGLB 17 肉汤培养基中，每个稀释度接种三管。 b) 置BGLB肉汤管于36??1?培养48?2h。记录所有BGLB肉汤管的产气管数。 c) 结果报告:按BGLB肉汤管产气管数，查MPN表报告每ml自来水的大肠菌群值。 三、结果评定 菌落总数(cfu/ml) 大肠菌群(MPN/g) 水质清洁程度 10,100 ,0.3 极清洁水 2310,10 ,0.3 清洁水 3410,10 ,0.3 不太清洁水 4510,10 ,0.3 极不清洁水 18 4. 菌落总数的测定 1、 菌落总数介绍 1.1 菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。 、培养温度和时1.2 菌落总数就是指在一定条件下(如需氧情况、营养条件、pH间等)每克(每毫升)检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法，即在需氧情况下，37?培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 1.3 菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。 2 检验方法 菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后(一般为48小时)，记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克(或每ml)原始样品中所含细菌菌落总数。 基本操作一般包括:样品的稀释?接种?倾注平皿?培养48小时?计数报告。 3 说明 3.1 样品的处理和稀释: 3.1.1 操作方法:以无菌操作取检样25g(或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振荡制成1:10的均匀稀释液。用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入 19 含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1:100的稀释液。另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。 3.1.2 无菌操作:操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。 3.1.2.1 所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。 3.1.2.2 操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。 3.1.2.3 采样的代表性:如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。 3.1.2.4 样品稀释误差:为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。 在进行连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。 3.1.2.5 稀释液:样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液(或0.1,蛋白胨水)，后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品(如酱油)进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。 3.2 倾注培养 3.2.1 操作方法:根据标准要求或对污染情况的估计，选择2,3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。将凉至45?左右平板计数琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将平板计数琼脂培养基倾入加有1ml稀释液(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。 待琼脂凝固后，翻转平板，置36?1?温箱内培养48?2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克(每毫升)样品所含菌落总数。 3.2.2 倾注用培养基应在46?水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。倾注培养基的量规定不一，从15,20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚 20 可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。 3.2.3为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。 3.2.4 培养温度一般为37?(水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30?)，培养时间为48h?2h。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15,。 3.2.5 为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4?环境中放置，以便计数时作对照观察。在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑(TTC)，培养后菌落呈红色，易于分别。 3.3 计数和报告 3.3.1 操作方法:培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算出原始样品中每克(或每ml)中的菌落数，进行报告。 3.3.2 到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0,4?，但不得超过24h。 3.3.3 若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30-300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。 3.3.4不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比(同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近)，即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。 如出现逆反现象，则应视为检验中的差错(有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等)，不应作为检样计数报告的依据。 3.3.5 当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计 21 算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。 3.3.6 当计数平板内的菌落数过多(即所有稀释度均大于300时)，但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。 3.3.7 计算方法，参考GB4789.2-2010 3.3.8 菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1-100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克(g)为单位报告，液体检样以毫升(ml)为单位报告，表面涂擦则以平方 2厘米(cm)报告。 22 5.大肠菌群的测定 1.定 义 大肠菌群:一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌.该菌群主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能. 食品中大肠菌群系以1ml(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示. 2.细 则 2.1 设备和材料: 超净工作台 冰箱:0?,4?。 恒温培养箱:35?,37?。 电子天平:感量0.1g 恒温水浴锅、灭菌吸管、灭菌平皿、灭菌试管、灭菌导管、灭菌烧杯、剪刀 2.2 试剂: 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST)煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)、灭菌生理盐水 2.3 操作步骤 2.3.1 样品稀释 2.3.1.1固体和半固体样品:称取25g样品，放入盛有225ml生理盐水的无菌均质袋内，用拍击式均质器拍打1-2min，制成1:10的样品匀液。 2.3.1.2液体样品:以无菌吸管吸取25ml样品，置盛有225ml生理盐水的无菌锥形瓶中(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)，充分混匀，制成1:10的样品匀液。 2.3.1.3样品匀液的PH值应在6.5-7.5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节。用1ml的无菌吸管吸取1:10样品匀液1ml，沿管壁缓缓注入9ml生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液面)，振摇试管使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。 4.3.1.4根据对样品污染状况的估计，按上述操作依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1ml无菌吸管。从制备样品匀液到样品接种完毕，全过程不得超过15min。 23 2.3.2 初发酵试验 每个样品，选择3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液)，第个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤，每管接种1ml(如接种量超过1ml，则用双料LST肉汤)，36?1?培养24?h，观察倒管内是否有气泡产生，24?2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48?2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 2.3.3 复发酵试验 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中，36?1?培养48?2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 2.3.4 大肠菌群最可能数(MPN)的报告 按2.3.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表(见附录B)，报告每g(ml)样品中大肠菌群的MPN值。 2.4 注意事项 (1)每递增稀释一次，必须另换一支1ml灭菌吸管，以保证所得检样的稀释倍数准确。 (2)吸管在进出装有稀释液的玻璃瓶或试管时，不要触及瓶口及试管口的外侧部分(这些部位可能接触过手或其他污染物)，以防感染。 (3)在做10倍递增稀释时，吸管插入样液稀释液内的深度不能低于液面的2.5cm;吸入液体时应先使液面高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸管内液体调至所要求的刻度，以保证取样的准确，同时在吸管从稀释液内取出时不会有多余的液体黏附于管外。 (4)当用吸管将检样稀释液加至另一装有9ml空白稀释液的管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧部分黏附的检液也混入其中。 (5)检样进行稀释时，检样与稀释液必须混合均匀，以保证结果的准确性。在做10倍递增稀释时，要求也是如此。 (6)月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤和煌绿乳糖胆盐肉汤内小导管必须装满培养液 24 后口朝下放入，小导管内不能有气泡。 (7)整个检验过程必须做到无菌操作。 大肠菌群最大可能数(MPN)检索表 阳性管数 MPN 95%可信限 阳性管数 MPN 95%可信限 0.1 0.01 0.001 上限 下限 0.1 0.01 0.001 上限 下限 0 0 0 <3.0 —— 9.5 2 2 0 21 4.5 42 0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94 0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94 0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94 0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94 0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94 1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110 1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180 1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180 1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200 1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420 1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420 1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420 1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420 2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430 2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1000 2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1000 2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2000 2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4100 2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 —— 注1:本表采用3个稀释度【0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]，每个稀释度接种3管。 注2:表内所列检样量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍;如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)0.0001g(mL)时，则表内数字应相应提高10倍，其余类推。 25 6. 罐头食品商业无菌的检测 A. 罐头食品微生物污染的主要来源 ? 杀菌不彻底致罐头内残留有微生物。罐头内残留的一些非致病性微生物在一定的保存期限内，一般不会生长繁殖，但是如果罐内条件发生变化，贮存条件发生改变，这部分微生物就会生长繁殖，造成罐头变质。经高压蒸汽杀菌的罐头内残留的微生物大都是耐热性的芽孢，如果罐头贮存温度不超过43?，通常不会引起内容物变质。 ? 杀菌后发生漏罐。罐头经杀菌后，若封罐不严则容易造成漏罐致使微生物污染。 a. 重要污染源是冷却水，这是因为罐头经热处理后需经过冷却水进行冷却，冷却水中的微生物就有可能通过漏罐处而进入罐内。 b.空气也是造成漏罐污染的污染源，但较次要。 c.一些耐热菌、酵母菌和霉菌都从外界侵入。 d.罐内氧含量升高，导致各种微生物生长旺盛，从而内容物pH下降，严重的会呈现感官变化。 B. 污染罐头食品的微生物的种类 * 污染低酸性罐头的主要微生物: ? 嗜热性细菌。这类细菌抗热能力很强，易形成芽孢，罐头食品由于杀菌不彻底而导致的污染大多数由本类细菌引起。这类细菌通常有平酸腐败细菌(平酸菌)、嗜热性厌氧芽孢菌等。 a.平酸菌。在43?以上贮存的低酸性罐头食品，可因其内残留的对热有很强抵抗力的嗜热性需氧芽孢菌的生长，而导致内容物变质，因其能在43?以上的温度中生长而使罐头内容物变酸，使罐头失去食用价值。 由于这类细菌在罐头内活动时，罐头不发生膨胀，而内容物的pH显著偏低之故，因而这种变质通常称为平盖酸败，引起平盖酸败的原因菌统称为平酸菌，即能使某些低酸性罐头食品发生酸败而又能形成芽孢的一类需氧乃至兼性厌氧的细菌。 根据平酸菌嗜热程度不同，可分为专性嗜热菌和兼性嗜热菌两类。 26 (a)嗜热脂肪芽孢杆菌。属专性嗜热菌，该菌仅于嗜热温度(45,50?)下芽孢才发芽，在库存或销售期间，如果环境温度处于嗜热性菌生长范围(43 ?以上)，平盖酸败就可能发生。罐头食品在加工过程中，经热处理后，如果不进行充分的冷却，同样是造成平盖酸败发生的主要原因。 (b)另一种主要平酸菌是凝结芽孢杆菌。该菌为兼性嗜热菌，可以在37?和55?两种温度下生长繁殖。 b. 嗜热性厌氧芽孢菌。在43 ?以上贮存的低酸性罐头食品，也可因残留的嗜热性厌氧芽孢菌的生长而引起罐头食品变质，这种变质由于原因菌的不同可分为以下两种类型: (a)嗜热解糖梭菌。一种产气型变质，通常是指罐听发生膨胀的变质而言，这种变质系由专性嗜热的芽孢厌氧菌——嗜热解糖梭菌引起。该菌是专性厌氧菌，最适宜的生长温度为55?，其分解糖的能力很强，能分解葡萄糖、乳糖、蔗糖、水杨苷及淀粉，产生酸和大量的气体，不分解蛋白质，不能使硝酸盐还原，不产生毒素。 (b)致黑梭菌(硫化臭变质)。罐装食品遭受硫化物腐败细菌污染的情况较少见，这种变质的特征是罐听平坦，内容物发暗，有臭鸡蛋味，通常由专性嗜热的产芽孢厌氧菌——致黑梭菌引起，它分解糖的能力不强，但能分解蛋白质产生硫化氢，硫化氢与罐头的马口铁化合物生成黑色的硫化物，使食品变黑，罐头内产生的硫化氢因被罐内食品吸收，因而罐听不会发生膨胀。从腐败变质罐头中还分离到其他类型的嗜热性细菌，但为数不多。 ? 中温性厌氧细菌。其适宜生长温度约为37?，有的可能在50?生长。可分为两类: a.一类分解蛋白质的能力强，也能分解一些糖，其主要有肉毒梭菌、生孢梭菌、双酶梭菌、腐化梭菌等。 b.另一类分解糖类，如丁酸梭菌、巴氏芽孢梭菌、魏氏梭菌等。 中温性厌氧细菌引起腐败变质、罐听膨胀、内容物有腐败臭味。肉毒梭菌尤为重要，肉毒梭菌分解蛋白质产生硫化氢、氨、粪臭素等导致胖听，内容物呈现腐烂性败坏，并有毒素产生和恶臭气味放出，值得注意的是由于肉毒素毒性很强， 27 所以如果发现内容物中有带芽孢的杆菌，则不论罐头腐败程度如何，均必须用内容物接种小白鼠以检测肉毒毒素。 ? 中温性需氧菌。这类细菌属芽孢杆菌属，为能产生芽孢的中温性细菌，其耐热能力较差，许多细菌的芽孢在100?或更低一些的温度下，短时间内就能被杀死，常见的引起罐头腐败变质的中温性需氧芽孢菌有:枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌等。 罐头内几乎呈现真空状态，使它们的活动受到抑制，这类细菌可分解蛋白质和糖，糖分解后绝大多数产酸而不产气，因而也为平酸腐败，但多粘芽孢杆菌和浸麻芽孢杆菌能分解糖类，产酸产气，造成胖听。 ? 不产芽孢的细菌。罐头内污染的不产芽孢的细菌有两大类: a. 一类是肠道细菌:如大肠杆菌，它们在罐内生长可造成胖听。 b. 另一类不产芽孢的细菌主要是链球菌，特别是嗜热链球菌和粪链球菌等，这些细菌的抗热能力很强。多见于蔬菜、水果罐头中，产酸产气。火腿罐头中常可检出粪链球菌和尿链球菌。 ? 酵母菌及霉菌。酵母菌污染低酸性罐头的情况较少见，仅偶尔出现于甜炼乳罐头中。 C、检验方法: 1.定义 酸性食品:杀菌后平均,H值等于或小于4.6的罐头食品(,H值小于4.7的番茄、梨和菠萝以及由其制成的汁，以及,H值小于4.9的无花果都算酸性食品 罐头食品的商业无菌:罐头食品经过适度的热杀菌以后，不含有致病的微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物，这种状态称作商业无菌 2.细则 2.1设备和材料 超净工作台、恒温水浴锅46?1?、恒温培养箱36?1?、冰箱0-4?、均质器、天平、卫生开罐刀、菌落计数器、灭菌三角瓶、试管、吸管、平皿;酒精灯;灭 28 菌镊子、剪子、勺、酸度计、白瓷盘、显微镜。 2.2培养基和试剂 革兰氏染色液、溴甲酚紫葡萄糖肉汤、疱肉培养基、0.85%的生理盐水 2.3 检验方法 2.3.1审查生产操作记录 杀菌记录以及杀菌的冷却水有效氯含量测定的记录:记录内容符合要求，有杀菌操作者的签字和相应主管的审核。 2.3.2 称重 用电子称或天平称量，1kg及以下的罐头精确到1g，1kg以上的罐头精确到2g(各罐头的质量减去空罐的平均质量即为该罐头的净重(称量前对样品进行记录编号( 2.3.3 保温 将全部样罐按下述分类在规定时间进行保温见表1 表1 样品保温时间和温度 罐头种类 温度,? 时间,d 低酸性罐头 36?1 10 保温过程中应每天检查，如有胖听或泄漏等现象，立即剔出作开罐检查( 4.3.4 开罐 取保温过的全部罐头，冷却到常温后按无菌操作开罐检验( 将样罐用温水和洗涤剂洗刷干净，用自来水冲洗后擦干(放入无菌室，以紫外光杀菌灯照射30min. 将样罐移置于超净工作台上，用75,酒精棉球擦拭无代号端，并点燃灭菌(胖听罐不能烧)(用灭菌的卫生开罐刀或罐头打孔器开启(带汤汁的罐头开罐前适当振摇)，开罐时不能伤及卷边结构( 4.3.5 留样 开罐后，用灭菌吸管或其他适当工具以无菌操作取出内容物10ml(g)-20ml(g), 移入灭菌容器内，保存于冰箱中(待该批罐头检验得出结论后可弃去 4.3.6PH测定 取样测定PH值，与同批中正常罐相比，看是否有显著的差异 29 4.3.7感官检查 在光线充足、空气清洁无异味的检验室中将罐头内容物倾入白色搪瓷盘内，由有经验人员对产品的外观、色泽、状态、和气味等进行观察和嗅闻，用餐具按压食品或戴薄指套以手指进行触感，鉴别食品有无腐败变质的迹象( 4.4涂片染色镜检 4.4.1涂片 对感官或pH检查结果认为可疑的，以及腐败时pH反应不灵敏的罐头样品，均应进行涂片染色镜检(可以用接种环挑取罐头的汤汁涂于载玻片上(待干后用火焰固定( 4.4.2染色镜检 用革兰氏染色法染色，镜检，至少观察五个视野，记录细菌的染色反应、形态特征以及每个视野的菌数(与同批的正常样品进行对比，判断是否有明显的微生物增殖现象( 4.5接种培养 保温期间出现的胖听、泄漏，或开罐检查发现PH、感官质量异常、腐败变质，进一步镜检发现有异常数量细菌的样罐，均应及时进行微生物接种培养( 对需要接种培养的样罐(或留样)用灭菌的适当工具移出约1ml(g)内容物，分别接种培养(接种量约为培养基的十分之一(要求在55?水浴中预热至该温度，接种后立即放入55?温箱培养( 4.5.1酸性罐头食品(每罐)接种培养基、管数及培养条件见表2 表2罐头食品的检验 培养基 管数 培养条件,? 时间,h 溴甲酚紫葡萄糖肉汤(带倒管) 2 36?1(需氧) 96-120 溴甲酚紫葡萄糖肉汤(带倒管) 2 55?1(需氧) 24-72 疱肉培养基 2 36?1(厌氧) 96-120 疱肉培养基 2 55?1(厌氧) 24-72 注:葡萄糖肉汤培养基(检验金黄色葡萄球菌和溶血性溶球菌);疱肉培养基(检验肉毒梭菌及肉毒毒素及产气荚膜梭菌)。 30 4.6微生物培养检验判定 将表2接种的培养基管分别放入规定温度的恒温箱进行培养，每天观察培养生长情况:溴甲酚紫葡萄糖肉汤呈阳性，产酸产气的现象为:色泽变黄、小倒管内收集到有气泡;疱肉培养基呈阳性的现象为:牛肉粒间有气泡、色泽变浑浊、有异味。 4.6.1对微生物生长的溴甲酚紫葡萄糖肉汤和疱肉培养基进行观察，并涂片染色镜检(按所发现的微生物类型判定 4.6.2罐头密封性检验 对确定有微生物繁殖的样罐均应进行密封性检验以判定该罐是否泄漏(附录B)。 4.6.3动物试验:将检样用适量灭菌生理盐水在37?温箱内浸渍30分钟取出，以其浸出液注射于小白鼠的腹腔(0.5ml)或皮下(0.3ml)，共接种2只。同时用煮沸1小时的浸出液注射2只小白鼠作对照，观察72小时，若发现小白鼠有发病或死亡情况时，应再用原浸出液注射小白鼠5只，若仍为阳性，应进一步追索其原因。 4.7结果判定 4.7.1该批罐头食品经审查生产操作记录，属于正常;抽取样品经保温试验未胖听或泄漏;保温后开罐，经感官检查、PH测定或涂片镜检，或接种培养，确证无微生物增殖现象，则为商业无菌( 4.7.2该批罐头食品经审查生产操作记录，未发现问题;抽取样品经保温试验有一罐及一罐以上发生胖听或泄漏;或保温后开罐，经感官检查、pH测定或涂片镜检和接种培养，确认有微生物增殖现象，则为非商业无菌( 31 附 录 B 罐头密封性检验方法 将已洗净的空罐,经35?烘干,根据各单位的设备条件进行减压或加压试漏。 B1 减压试漏 将烘干的空罐内小心注入清水至八、九成满,将一带橡胶圈的有机玻璃板妥当 安放罐头开启端的卷边上,使能保持密封。启动真空汞,关闭放气阀,用手按隹盖 板,控制抽气,使真空表从0升到6.8×104 Pa(510mmHg)的时间在1min以上.并保持 此真空度1min以上。倾侧空罐仔细观察罐内底盖卷边及焊缝处有无气泡产生,凡 同一部位连续产生气泡,应判断为泄漏,记录漏气的时间和真空度,并在漏气部位 做上记号。 B2 加压试漏 用橡皮塞将空罐的开孔塞紧,开动空气压缩机,慢慢开启阀门,使罐内压力逐渐 加大,同时将空罐浸没在盛水玻璃缸中,仔细观察罐外底盖卷边及焊缝处有无气 泡产生,直至压力升至0.7kg/cm2 并保持2 min,凡同一部位连续产生气泡,应判断 为泄漏,记录漏气的时间和压力,并在漏气部位做上记号 32 湖南临武舜华鸭业发展有限责任公司 商业无菌检验原始记录表 编号:ZJ-04-5.3-004 ?: 产品名称 规 格 生产日期/批号 杀菌锅号 杀菌记录表审查 罐头密封性 冷却水有效氯含量 样品编号 测定起止日期 检测地点 无菌室 检测依据 《罐头食品商业无菌的检验》GB/T4789.26-2003 检测环境 温度(T): ? ;相对湿度(RH): % ???生化培养箱(SHP-150 ) ?电子天平(LT1000B) ??检测仪器 ?酸度(PH)计(ZD-2A) ?生物显微镜(XSP-8C) ???高压蒸气灭菌锅(ZDX-35B1) ?电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9076A) ???庖肉培养基 ?溴甲酚紫葡萄糖肉汤 ?酸性肉汤 ?卵黄琼脂平板 培养基 ?麦芽浸膏汤 ?锰盐营养琼脂平板 ?血平板 ?其他 ?样品属性 ?低酸性食品(鱼、禽、肉类) ?酸性食品 样 品 样品编号或批号: 对照样品 保温方式 ?,培养 天 ?,培养 天 胖听或泄漏 PH值 检查外观、色泽、状态、气味、触检查外观、色泽、状态、气味、触感官检查 感，异常和腐败变质现象 感，异常和腐败变质现象 商 个/视业 野 染色无 镜检 菌 判断 与对照样品对比, 明显的微生物增殖现象。 庖肉培养 溴甲酚紫葡萄糖肉汤(带倒管) 接种培养条件:36?培养条件:55?1?培养条件:36?1?培养条件:55?1?培养1?(厌氧)，(厌氧)，24~72h (需氧)，96~120h (需氧)，24~72h 情况 96~120h 鉴别培养 检验结果 样品状况:洁净、无胀/破袋 ? 感“?”表合格 色泽:正常 ? 官“?”表不合香味:具有本产品应有的香味，无异味 ? 检 格 滋味:具有本产品应有的滋味，咸甜适中，无不适感 ? 验 状态:具本品应有的质感，无腐败变质迹象 ? 33 备 注 检验员: 审批: 34 湖南临武舜华鸭业发展有限责任公司 食品感官、微生物检验原始记录表 编号ZJ-04-5.3-003 ?: 检测日期 20 年 月 日, 月 日 检测依据 ?GB 4789.2-2010 ?GB 4789.3-2010第一法 检测环境 温度: ?,相对湿度: % ?电子天平(LT1000B) ?电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9076A) ?超净工作台,SW-LJ-1ED, ?电热恒温水浴锅(HH〃S?-N12A) 检测仪器 ?生化培养箱(SHP-150) ?高压蒸汽灭菌锅(ZDX-35B1) ?菌落计数器,XK97-A, ?均质器( )转速( )r/min～时间( )分钟 培 养 基 ?平板计数琼脂 ?LST肉汤 ?BGLB肉汤 生产厂家/产地:广东环凯生物科技有限公司 生产日期/批号: 样品制备 ,固体样品,无菌称取25g置于盛有225ml生理盐水的无菌灭菌杯内～进行均质处理。 感官检验 菌落总数(cfu/g) 大肠菌群(MPN/g) 用“?”表示符合，“?”表示不符合。 样品 样品 初发酵温度 36?1 ?，时间 h 培养温度36?1 ?，培养时间 48 h 外观洁净，无肉眼可复发酵温度 ?，时间 h 报告 色泽 具产品应具产品应名称 编号 无胀/破袋见外来杂0-1正常 有的香味 有的滋味 1.0g?3 0.1g?3 0.01g?3 10 10空白 报告 接种量 稀释度 (罐) 质 平板1 初发酵 平板2 复发酵 平板1 初发酵 平板2 复发酵 平板1 初发酵 平板2 复发酵 平板1 初发酵 平板2 复发酵 平板1 初发酵 平板2 复发酵 平板1 初发酵 平板2 复发酵 平板1 初发酵 平板2 复发酵 平板1 初发酵 平板2 复发酵 检测者: 审核者: 34 食品用水卫生微生物检验原始记录 SH/ZJ-04-5.3-005 样 品 编 号 检测依据 采 样 地 点 检测起始时间 检 测 仪 器 电热恒温干燥箱、生化培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅 ?平板计数琼脂培养基 培 养 基 ?月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST) ?煌绿乳糖胆盐肉汤 (BGLG) 菌落总数[CFU/mL ](平板计数法) 大肠菌群[ MPN/mL ] 初发酵温度 ?，时间 h 培养温度 ?，培养时间 h 复发酵温度 ?，时间 h 接种量 0-1稀释度 10 10 空白 1×3 0.1×3 0.01×3 (mL×管数) 平板1 初发酵 平板2 复发酵 报告: 报告/日期: 审核/日期: 食品直接接触面卫生微生物检验原始记录 SH/ZJ-04-5.3-006 样 品 编 号 检测依据 采 样 地 点 检测起始时间 采样具体位置 检 测 仪 器 电热恒温干燥箱、生化培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅 ?平板计数琼脂培养基 培 养 基 ?月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST) ?煌绿乳糖胆盐肉汤 (BGLG) 菌落总数[CFU/mL ](平板计数法) 大肠菌群[ MPN/mL ] 初发酵温度 ?，时间 h 培养温度 ?，培养时间 h 复发酵温度 ?，时间 h 接种量 -2-3-410 10 10 1×3 0.1×3 0.01×3 稀释度 空白 (mL×管数) 平板1 初发酵 平板2 复发酵 报告: 报告/日期: 审核/日期: 35 高清洁区空气沉降菌检验原始记录 SH/ZJ-04-5.3-007 样 品 编 号 检测依据 采 样 地 点 检测起始时间 采样具体位置 检 测 仪 器 电热恒温干燥箱、生化培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅 培 养 基 ?平板计数琼脂培养基 菌落总数[CFU/mL ](沉降法) 培养温度 ?，培养时间 h 皿号 皿1 皿2 皿3 皿4 皿5 空白 CFU 报告: 结论 报告/日期: 审核/日期: 36