SKF 83959对海马神经元钙离子信号通路的影响及其神经保护作用(可编辑)

SKF 83959对海马神经元钙离子信号通路的影响及其神经保护作用(可编辑) SKF 83959对海马神经元钙离子信号通路的影响及其神 经保护作用 华中科技大学 硕士学位 SKF 83959对海马神经元钙离子信号通路的影响及其神经保护作 用 姓名:明玉玲 申请学位级别:硕士 专业:药理学 指导教师:陈建国 20060401硕士论文 华中科技大学同济医学院 对海马神经元钙离子信号通路的影响及其神经保护作用 研究生:明玉玲 导师:陈建国教授 中文摘要 一种新型的多巴胺受体通过耦联于蛋白激活矿信号级联反应而 促进的水解被称为.耦联的新型多巴胺受体于最近被发现并广为报道。 作为多巴胺受体的特异性激动剂,与经典的多巴胺受体激动剂不同的 是它对/信号途径并不产生影响,我们以往的实验研究表明 在存在的条件下可以影响脑片,的表达,但其具体的作用机制 尚未完全阐明,对其与神经元细胞内钙离子及相关信号转导路径的尚未研究, 且 对相关神经退行性疾病的药效学研究也进行的很少。 对海马神经元细胞内及其相关信 本文拟在海马神经元上研究 号转导通路的影响,并对其在.所致的海马神经元损伤作用中是否具有保护 的作用机制,并为其在神经退行性疾病中 作用进行探讨,进一步阐明 的应用前景提供可靠的实验依据。 第一部分 对培养大鼠海马神经元细胞内钙信号通路的影响 . ? 对原代培养海马神经元【的影响 以/为荧光探针,细胞内荧光钙成像的检测 对培养 海马神经元【 的影响。 .. ./ 浓度依赖性地增加海马神经元【,给予 后,.即可引起【的增加,士.使【种升高达最大值, 。 其平均升高幅度约为.%.%.. . ? 引起海马神经元升高中来源的研究 通过改变细胞内外液中含量,并利用不同的离子通道拮抗剂,观察其对 升高培养海马神经元【的影响。 不再引起 给予 / /耗竭细胞内钙库后,堡:丝兰 堂型垫查堂塑堕堕兰堕 / 仍能引起增加, 】变化。给予无细胞外液时, 但升高幅度明显低于有钙细胞外液中的反应.%.%,. / ,重新加入到细胞外液后,进一步升高。 而预先给予 /和一型钙通道拮抗剂,仅分别升高.%士.% , 和.%士.%. 受体 / / 拮抗剂和/受体拮抗剂可部分拮抗【】的增加,仅 .%士.%和.%.%. , 分别升高 而 /’则不影响 升高】的反应。 ? 升高培养海马神经元【作用机制的探讨 升高原代培养海马神经 应用不同第二信使拮抗剂,探讨 / 元。的作用机制。 / 预先给予不同第二信使拮抗剂之后再给予 时, /多巴胺受体拮抗剂完全拮抗】的增加. / ,一一多巴胺受体拮抗剂则几乎不产生任何 影响,.受体拮抗剂和受体拮抗剂也表现出完全的拮 抗效应尸. ,一一无活性同构物和 // 拟似激动剂则不对 脯】的反应产生影响。而 受体拮抗剂,仅一肾上腺素受体拮抗剂和 / 所引起的【】 ?受体拮抗剂也未能阻止 升高。 第二部分 预处理对致海马神经元损伤的作用及机制研究 ? 预处理对致海马神经元细胞毒性的作用研究 培养原代海马神经元细胞,设置空白对照组正常培养海马神经元,模型组 预处理组和阳性药物对照 /,药物预处理组 组,分别检测海马神经元凋亡率。 和阳性药物预处理 后均显著降低老化 实验结果显示 兰型垫查堂旦塑堕兰堕 竺::堡兰 的?/造成的海马神经元损伤,增加海马神经元存活率,对其细胞培 养液上清中含量检测结果也与趋向~致。 /匹配染色流式细胞仪检测细胞凋亡率,发现 预处理组 和阳性对照药处理组均能降低 ./造成的神经元凋亡尸. / 荧光染色法计数原代培养海马神经元凋亡率, .。 .% 与对照组相比,发现.明显增加海马神经元的凋亡率.%士.% 和 / .%,.,而// 预处理 后可明显减少 所致神经元凋亡细胞数目的增加,分别降低至.%士.%和.%士.% ..。 ? 检测培养海马神经元细胞内%“的表达 免疫印迹法检测各组海马神经元细胞“蛋白的表达,发 现 / ’能显著降低”“的水平,而 和预处理 后与模型组相比明显增加“。的磷酸化水平,提示 可能通 过增加“的活性而发挥保护作用。 小结 通过激活?多巴胺受体而激活,信号转导通路,引发海 马神经元细胞内钙库中释放而增加】。,细胞内增加的钙离子可能通过激活 第二信使如等而磷酸化.型电压门控通道及受体门控通道,促进其 开放而介导细胞外钙离子内流维持【进一步升高。 在老化的 建立的海马神经元损伤模型中, / .作用 和预处理 均可显著减少口所造成的损伤,初步研究结果表明 可能通过增加磷酸化,抑制的活性而发挥保护作用。 关键词 】,海马神经元凋亡 硕士论文 华中科技大学同济医学院 一 . ?“’ 】 .一 ? , . .? 】 ,一/.?? / . 】 / 】 . . 淅 .%.% ?【? . , 【】 堡::::堡兰 兰型垫火兰旦鎏垦兰堕 / 【 , 】 ., ? 一 , 【】,?. ? ” / ;/ ,/ /, / 一一./ , // ? : .. 肛 . ? , / . , : ..? / 堡主堡苎 兰型垫查兰堕堕堕堂堕 ., . , , .? .”,?. . ,? .? : . . , , :, , ,硕一论文 华中科技大学同济医学院 缩略词 细胞内钙离子浓度 】 环磷腺苷三磷酸肌醇 磷脂酰肌醇 磷脂酶蛋白激酶 蛋白激酶 钙调蛋白激酶 一 多巴胺和环磷腺苷调节磷酸 /? 化蛋白 环磷腺苷反应元件结合蛋白 ? 鸟苷酸结合蛋白 ? 人工脑脊液 ’ 帕金森氏病 ’ 阿尔茨海默病 甲基噻唑基四氮唑盐 流式细胞计量术 乳酸脱氢酶碘化丙啶糖原合成酶激酶周期索依赖性蛋白 激酶 长时程增强 ?硕:卜论文 华中科技大学同济医学院 前言 多巴胺作为脑内重要的神经递质,通过激活蛋白耦联的多巴胺受体在脑内发 挥着重要的功能。钙离子在神经元的兴奋性和可塑性中扮演着重要的角色。多巴 胺受体对细胞内钙离子信号转导的调节作用虽已有研究?,但对其究竟是通过 依赖性或非依赖性的机制引起【升高尚有争议【,引。最近研究发现一种新型的 多巴胺受体通过耦联于蛋白而激活,信号通路,进而水解为和 ?,?。这种水解作用可被经典的多巴胺受体拮抗齐 特异性地阻 断,而多巴胺受体拮抗剂一两则不产生影响,被称为一耦联的多 巴胺受体。 是近年来发现的?多巴胺受体特异性激动剂,以往研究表明 在和存在条件下可以上调的表达,但其对在其中的作用 机制仍未阐明。因此本研究拟通过荧光钙成像方法,研究 对培养海 马神经元细胞内钙离子影响及其相关信号转导机制,为进一步阐明其药理作用提 供有力的实验依据。 海马是缺血缺氧反应最敏感的区域,同时对学习记忆的形成有着重要的作用, 在神经退行性疾病中的作用备受关注。神经元的缺失参与了许多疾病的病理生理 发生和发展,如缺血性脑损伤及阿尔茨海默病,帕金森病等神经退行性疾 病过程中均伴有神经元的坏死和丢失,但目前尚缺乏有效的治疗药物,因此 寻找 新的治疗靶点及治疗药物具有重要的临床意义。 动物实验表明 在引起的帕金森病模型中表现出良好的拮抗 效应。目前已有研究表明抗帕金森病药物,如培高利特等在动物实验中已 经取得较好的疗效,但对 对的作用尚无相关报道。因此本文通过 建立细胞模型,采用形态学、生化测定、分子生物学方法和流式细胞仪研究 对诱导的培养海马神经元损伤作用及机制,为探讨 在神经退行性疾病中的潜在应用价值,拓展其应用前景提供实验依据。兰型 垫查兰塑堕垦堂堕 一?????????型:塾 参考文献, . , ,? . .:? . : . . 一 ,, . .. ? . . . , . , , , :. . . ./ ,..: . . . , ,? .:. . , :?.. , . ?: ?. , , ., :?. 。 . . , , 。 :. . , , . .: .? , . . 。 , , , / ? ..?.硕:论文 华中科技大学同济医学院 第一部分 对培养大鼠海马神经元细胞内钙离子 信号通路的影响 材料与方法 .材料 .实验动物 ?天龄大鼠,由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。 .实验仪器 , 德国.. 公司产品 单色光源 德国.. 公司产品 控制单元,, 德国.. 公司产品 .软件, 德国... 公司产品 倒置荧光显微镜 日本公司产品 定时数显恒流泵, 上海沪西分析仪器厂产品 美国公司产品 培养箱, 超净工作台, 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司 .实验药品与主要试剂 ?多巴胺受体 一/购自,,; 激动剂,多巴胺受体拮抗剂,多巴胺受体拮 一受体拮抗剂,?受体拮抗剂, 抗剂, .肾上腺素受体拮抗剂均购自公司,;一 拮抗剂,.一无活性同构体, , 均为细胞内钙库的耗 受体拮抗剂,和 竭剂,.型钙通道拮抗剂,电压门控型钙通道拮抗剂,主 要以.型钙通道为主,...一 ,受体拮抗 堡:笙兰 兰型垫查兰型鲨墨兰堕 剂,一一一,一,受体拮抗剂, ,钠通道拮抗剂均购自公司,其他常用试剂均为国产分析纯。 .方法 .溶液的配制 人工脑脊液和无钙细胞外液的配制 试剂的溶解 以上试剂除,,一,一用溶解外其余均以超 纯水溶解配成或母液置.冰箱中保存,临用前稀释至使用浓度, 终浓度.%。 无钙无镁解剖液的配制.: 药品 质量/ . 。 . .. 待定容完毕后调值到.左右,高压灭菌后鼍?冰箱中保存备用。 完全培养基的配制硕士论文 华中科技大学同济医学院 ?基础培养基的配制: 药品 浓度 / // . /? 按说明书要求,配成含上述物质终浓度的溶液,定容后调值至.左右后 在超净工作台内用高压灭菌的滤器过滤分装于的酸处理,高压灭菌的盐水瓶 内,保存于.冰箱中保存备用。 ?胎牛血清的灭活:将凝固的胎牛血清置冰箱中过夜解冻,置水浴锅 中 ,灭活非特异性抗体后超净工作台内分装于 的酸处理、高压灭菌的 青霉素瓶内,冷却后保存于一冰箱中备用。 ?双抗的配制:青霉素万单位和链霉素万单位在超净工作台 内分别加入和 灭菌的超纯水,充分溶解后分装于高压灭菌的管内,保存 于一的冰箱中备用。 ?的分装:于超净工作台内避光分装于高压灭菌的管内,保存于一 冰箱中备用。 ?完全培养基的配制 ./荧光染料的配制 将装有/“的管从冰箱中取出,冷却至室温;取出 的储 备用;加入 垤装有/的管中,混悬溶解配成 备液置.冰箱中保存,于两个月内用完。 硕::论文 堂型塾查兰塑鲨垦兰堕 .海马神经元培养: 取健康一天龄的新生鼠,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供, 无菌条件下迅速断头取脑,于预冷的液中冰上分离出双侧海马,剔除毛细血 。完全培养基含体积 管,液洗涤三次后,加入.%胰酶消化 /终止消化后,抛光的巴士德吸 分数%胎牛血清,青霉素,链霉素各 ,弃上 管小心吹打,待组织分离后过滤,将收集的细胞悬液于 离心 收集细胞,完全 清,完全培养基重悬细胞洗涤残留的胰酶, 离心 培养皿中培养, 培养基重悬后以×/密度种于载玻片上,置 换液一次,选择培养 后换为维持培养液%完全培养基培养,此后每 后,选择分布均匀、结构清晰、透亮无空泡的锥体神经元用于实验。 海马神经元细胞内游离钙离子浓度】的测定: 于培养的 ,取出载有海马神经元的载玻片,洗涤三次以除去残留 ,混匀后 /的荧光探针/溶于 培养基,将 浓度为 加入培养皿中,避光孵育,使细胞内与/相结合。用 / 洗涤三次以去掉未结合的一/,置倒置荧光显微镜载物台上,以 ,定容细胞外液体积为 ,选取单个散在的海马神 速度灌流,平衡 经元置视野中央监测【。单个细胞【。测定在装有双激发波长的荧光钙离子 成像系统的倒置显微镜下进行。由氙灯的连续激发光源,经滤光片后产生 、 的激发光,由 采样系统动态采集 的发射 ,经 .软件转换为荧光强度值,荧光信号的强 波长,采样间隔为 弱和成正相关以结合有一/的钙离子荧光强度来反映,. 软件分析处理后得到细胞的动态/荧光比值即值间接反映【】 变化。 统计学处理: .软件进行方差分 实验数据以平均值?误又表示,用 析和检验,.表示有显著性统计学差异。华中科技大学同济医学院 硕士论文 结果 ? 对培养大鼠海马神经元【】的影响 .../ 剂量依赖性地增加【十】,. / 于给 可引起【】升高, /即可达最大效应培。 / 药后 达最大值,动态监测可见海马神经元 即可引起【】升高,.士. 细胞内荧光信号强度变化 ,与基础值相比,】升高.%士.% ,此反应可持续 .。 : /】./, 】/ . . . .,.硕::论文 华中科技大学同济医学院 鬻蓉芭 们 伽劝 ’ ? 鼬 % 挣 . .. / ..%.% . ,】 . / . .. . .... 【】。. ? 升高海马神经元【来源的研究 将换成无钙的细胞外液后, / 仍能升高【】,但升高 幅度.%士.%低于有钙细胞外液中的反应.,将无钙液重新换为 / / , 有钙液后】又进一步增加.。预先给予 :则不能引起【】增加.。 华中科技火学同济医学院 顾’】二论文 避 口? 帖:耋??性 ? ? ?? 竺 . 』 芝 . ? ? ? ? . .“ .. 一. / ..一 :. 一 : ;一:. . ..一 ./ .. 电压门控性钙通道拮抗剂 ./ .%士.%,和 .%.%,均显著降低 / 引起的升高../ ./ ,.。受体拮抗剂 也明显降低弓起的】升高.%.%,,受体拮抗 剂 / / 引起的【】升高.% 也略降低 .%,./ / ..,而 . 则对 起的【的升高幅度无明显影响,表明.型钙通道和受体门控 华中科技大学同济医学院 顾::论文 性钙通道介导 诱发的细胞内流。 巨萋嚣巨 ? 啪 撕? 晰 枷 .啊蝣 ?口’ 喜基掣?蒌箩 苍鬈 弧 ?。。 。:?一一一一 耋重步 十????????????????????一 . ? .. // . 】【】 / .%士.%,.../. // 尸. /.. “/. 】竺.:丝兰 兰型丝查兰堕鲨堕兰堕 ? 升高培养海马神经元【的机制 后,再给予 ,观 预先给予各种受体拮抗剂孵育细胞 ./ / 引起 察到多巴胺受体拮抗剂 .可拮抗 .%士.% ./ , 的】增加.%.% ./ .,,而多巴胺受体拮抗剂 一一则未明显影响, 起】升高的反应.,受体拮抗剂 .肾上腺素受体拮抗剂和.受体拮抗剂均不能拮抗 升高】的效应.。焉,一 一 州酣 麓一‖。/: : 自.? .. ./ “/ . ./ 一一.. 一. ,./ , 【十】 ../ . . 堡::堡兰 兰翌塾查兰型堕垦兰望 预先给予一拮抗剂和拮抗剂均可完全拮抗 引起的】增加.,,而给予上游分子的拟似物 对 引起的】增加无明显影响。 ”尸目疆窭.圈蓝筮珏目目 。.‘”田旺瞳田圈童盘星旺田跚 薹? ;;一 : . ?:. . . ?? 四 ./ 一 “ . .. ./ /一..、? .. 讨论 是新近发现的一种新型多巴胺受体激动剂,与 和 等其他几种相关的经典多巴胺受体激动剂相比, 对多巴胺 受体显示出较强的亲和力,它通过结合于.多巴胺受体,以刖非 依赖性的机制激活,信号转导】。我们已有研究表明, 在十 存在的条件下可以上调脑片中和的表达【引。 研究表明多巴胺和受体均可影响【】,但其确切机制尚不清楚。有报道 选择性的/受体激动剂 可增加海马和皮质神经元】,而多巴胺 受体激动剂则不能引起【 增加【。但也有报道激活海马神经元和多巴胺 受体均可引起受体的激活,继而引起细胞内钙库中释放【】。尽管对于多巴胺 受体激活时】.变化报道不一,但也不排除因细胞和实验仪器的不同而得出不 同 的结果。依赖性的机制被认为参与了经典的多巴胺受体介导的细胞内钙离 子信号级联反应,然而,已有研究表明 激活?多巴胺受体是由硕::论文 华中科技大学同济医学院 /依赖性机制所介导。 本实验通过荧光细胞内钙成像的实验方法,观察新型?多巴胺受体激动剂 齐 / 对培养大鼠海马神经元『的影响,发现.? 可吏升胄.% 量依赖性地增加培养海马神经元,】, ./ 士.%,并持续 襁起 。耗竭细胞钙库后, 升高,而当应用无钙细胞外液时仍轻度升高海马神经元】。,表明细胞内钙库 中 释放为: 起增加的始发因素,而细胞内钙释放所增加的细胞 内钙离子促进的细胞外钙内流则维持【】迸一步升高。为了阐明细胞夕内流 的通路,我们应用电压门控和受体门控通道拮抗剂,观察到当预先应用一型 钙通 日起】升高幅 道拮抗剂或孵育细胞后,均可明显降低 所引起的反应, 度,预先给予或受体通道拮抗剂也略降低 表明细胞外的钙离子内流主要由一型钙通道所介导,而维持【】的持续升高, 而 /受体受体门控通道也在其中发挥部分作用。多巴胺受体拮抗剂 可拮抗 所引起的【升高,但多巴胺受体拮抗剂 升高培养海 所引起的【气升高,表明 一则不影响 及 马神经元细胞内的反应是通过激活多巴胺受体而介导。与 一样, 升高海马神经元】的反应也可被拮抗剂 一.及受体拮抗剂所阻断【‘”,提示/信号级联反应为 不影响 引起升高的重要机制。此外,给予拟似物 引起的】升高反应,表明/并未参与该反应。以上结果说明 通.过激活,信号转导通路,诱发细胞内钙库中钙离子释放,启动】 的升高,进而通过激活等细胞内信号分子,磷酸化一型钙通道和受体 门控通道,介导细胞外钙离子内流而维持【】的持续升高。 有研究表明激活时可引起【神瞬时升高, 贝引起【缓慢而 持续的升高,该反应可能参与了细胞内蛋白质的合成及基因表达的调节。细 胞 内钙库中钙离子的释放与甲的形成,树突的生长及神经元可塑性有关【,因此 本实验为进一步研究 的药理作用提供新方向。毕中科技大学司济医学院 颂 二‘论义 参考文献 , , , . .:. .: . , , . ,一 : .: . ‘?’:. .., . . . 亿. . :? ., , , , . .? :. . . , , , , ,’ , , ?? .:一& .一 ., ./ ., . . 【 ..: . , , . ? .,.: . , , , . 颂::论文 华中科技大学同济医学院 一. . .:? . ? ” . :?. .. . , , . ...:?. . . , , , , , ? /? . ?.:. 小结 在培养的海马神经元中,. , 能剂量依赖性的增加 :可使海马神经元【增加.%.%,作用机制可 ??/ 能如下: . 通过激活耦联的多巴胺受体,进而激活/信号转导系 统,诱发受体介导的细胞内钙库中释放,此为【】增加的最初来源。 .细胞内增加的钙离子通过对细胞内相应信号分子的激活,继而磷酸化 .型钙通道和/受体门控通道,介导细胞外的钙离子内流而维持 】的进一步增加。 硕:二论文 华中科技大学同济医学院 第二部分 对所致海马神经元损伤的作用及机制 材料与方法 .材料 .实验动物 健康新生的天龄大鼠,由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。 .实验仪器 美国公司 培养箱 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司 超净工作台 ,,, 全自动酶标仪 上海棱光分析仪器有限公司 型紫外分光光度仪 一倒置荧光显微镜 日本, 美国?公司 流式细胞仪 , ? 电泳仪 .?, 转膜仪 中科院武汉仪器厂 恒温摇床 上海亚荣生化仪器厂 ?平衡脱色摇床 日本, .低温冰箱 台式高速冷冻离心机 长沙平凡仪器仪表厂 .型不锈钢电热鼓风干燥箱 南通沪南科学仪器有限公司 型洗片机 ?, 型电子天平 上海今迈仪器仪表有限公司 一型电子精密计 .实验药品与主要试剂 /:培养基,无血清培养基购自公司;胎牛血清, 公司,兰州明海生物生产;一抑制剂’,,,一坝:论立 华中科技火学同济医学院 二甲基噻唑,苯基四氮唑溴盐一,一一一一,一, , ,均购自公司;胰酶购自公 司: .多巴胺受体激动剂,多巴胺受体拮抗剂购 自公司,;兔抗.”购自, ., ,,;试剂盒为南京建成公司显示桌面。‘产品;内标 ,预染,购自肌公司:,,,,, ;辣根过氧化物酶标记二抗,显影试剂盒购自美国 嫩自公 ,?, 一, 公:,,,丙烯酰胺, 脱氧胆酸,甘氨酸,溴酚兰购公司。 .方法 .大鼠海马神经元的培养同上 .细胞模型制备 /母液后分 .的老化:用灭菌的超纯水将溶解配制成 装于灭菌处理的管中,临用前稀释至使用浓度置 培养箱中老 化 后用于实验。及的溶解:临用前称取药品,取约 超纯水溶解后, 用基础培养基配成母液,高压滤器过滤灭菌后分装于灭菌的管中置 .冰箱中,一周内用完。 ,撤去完全培养基,换为 细胞模型制备:培养海马神经元于接种后 后用于指标 无血清培养基,预先加入药品或直接加入作用 检测。 检测 将海马神经元以/密度种植于孔板,分别单独加入不同浓度。 和 ,观察其对海马神经元存活率的影响,选取 /建立细堡::丝兰 竺型垫盔兰型堕堕堂堕 胞损伤模型,分别设置如下组别下同:空白组不加细胞,仅加培养基,对 照组正常培养的海马神经元,模型组处理 ,药物干预组 ,阳性药物对照组.,每组设个复孔,实验至少重复三 ,于实验结束前 加入终浓度为 次,药物预处理 后给予。作用 ,继续培养 ,小心吸弃上清,每孔加入 充分溶解紫色 / 结晶物质,振摇 ,待其充分溶解后用酶标仪在 /测量波长, 参比波长处测量吸光度,仅活细胞的线粒体才能吸收,因此吸光度值 与活细胞的数量成正比,以此来反应活细胞的数量。实验结果计算如下: 细胞存活百分率女???自/?月?自 .乳酸脱氢酶漏出率测定 细胞受损后,从细胞内大量释放,因此细胞培养液中的含量和死亡 细胞的数量成正比,紫外检测其吸光度值来反映的含量,以间接反映死亡细 胞的数量。按试剂盒说明书检测各组含量,以一破膜后的细胞 培养液中的含量作为%,计算各实验组漏出率。 .流式细胞仪检测 , 样本处理:药物作用完全后,弃上清,洗涤三次,胰酶消化? 吹打收集细胞, 离心,弃上清,洗涤后再次离心,重复此步骤 三次,收集细胞。 检测: 和匹配染色细胞后,流式细胞仪氩离 绿色,, 子激光光源,激发波长 ,发射光滤镜? 红色,条件下检测细胞凋亡率。软件并分析数据。每个 样本收集,个细胞进行检测。 . 染色荧光显微镜计数死亡和凋亡细胞 : 药物作用完毕后,弃上清,洗涤三次,加入 / ,×倒置荧光显微 稀释避光反应 ,用洗去未结合的顼:论文 华中科技大学同济医学院 镜下随机选取个视野,统计?个细胞中凋亡细胞数目,重复三次实验,计数 凋亡或死亡细胞百分率,以细胞核改变、碎裂、溶解等形态学变化为判断细 胞死 亡或凋亡的标准以死亡及凋亡细胞占总细胞的百分表示凋亡率。 .免疫印迹法 法检测‘蛋白的表达 ..蛋白提取 取出处理好的细胞,在冰上弃掉培养基,洗涤三次晾干后加入蛋白裂解 , , 液/: , , ?/, , .。细胞刮小心刮取细胞,收集于 /, ,%, 管中,超声裂解细胞× ,充分裂解后收集细胞混合液。, 离心 收集上清即得蛋白。以牛血清白蛋白为标准检测蛋白做标准曲线,采用 法测定蛋白含量后分装,置一冰箱中保存备用。 .. .电泳 制备%分离胶,注入干净玻璃板间隙,顶层加入少量水使其压平并排出气泡, 待分离胶凝固后洗去。 制备%浓缩胶,注入分离胶上方,并立即在浓缩胶层插入干净的梳子, 待凝固后拔出梳子并冲洗干净。 。按预染和样品顺序, 样品与上样缓冲液混匀后加热 微量注射器上样,每孔加入 蛋白至泳道,空余泳道中加入等体 积上样缓冲液配平。 恒压电泳,待溴酚蓝达分离胶底部时关闭电源。 接通电源正极接下方, 取出凝胶,按预染的位置取下蛋白质所在位置的凝胶并做好标记。 。 . 蛋白质转膜和膜封闭 准备一张膜和六张吸附滤纸,其大小与凝胶相当,并做好标记。 用转移液浸泡膜和滤纸,待其活化后用于实验。 依次按负极.滤纸张?凝胶?.膜一吸附滤纸张一正极的顺序置于 支撑垫上,逐层叠放,并用玻璃棒赶出气泡,闭合支架,将其置入充满转移 。 转移 液的转移槽内,接通电源, 竺?丝;兰; 兰型垫人兰塑堕垦兰堕 以蓝色预染判断蛋白质是否转移完全,剪下蛋白质所在位置的膜。 ..免疫印迹 。 将膜置于%脱脂奶粉封闭液中封闭 取出膜,放入新的杂交袋,加上兔抗慨多克隆抗体:,。 过夜。 抗原抗体反应完全后取出膜,漂洗四次,每次 。 。 按:稀释二抗辣根过氧化物酶标记羊抗兔,恒温摇床振摇 取出膜,漂洗三次,每次。 ..化学发光增强法检测蛋白强度 试剂盒购于美国公司。按说明书加入/感光显色液于 膜上,室温避光反应 ,将光底片放于膜上曝光后定影、显影,扫描 记录分析结果。 .统计学处理: 统计数据以平均值士标准误叉士表示, .软件进行方差分析和 检验,.表示有统计学差异。 结果 ? 对所致海马神经元损伤的作用 .比色法检测细胞存活率 、、、 /.浓度和时间依赖性地减少海马神经元的存活率, 单独给予 对神经元的存活率并无明显影响 。将老化的 建立细胞损伤模型,药物组分 ./。在无血清的细胞培养液中作用 / 别加入.、.、、、、 ,阳性药物对照组加入 ./ 预孵育细胞后加入老化的 进行检测,结 /作用 果发现与模型组相比,.? 浓度依赖性地提高海马神经元存活 /率. / . / ,.,其效应在浓度为 时达最大,表明 在.. /范围内能浓度依赖性地拮抗.所华中科技人学同济医学院 硕:论文 致的海马神经元损伤,具神经保护作用。 加 ? ? ? 加 鬟一台盘》一一? 如 . 十 一 一 ?...、???..???? 埘 . .,.,,,肛/ // .. ?/ . ./ / .“. ..,. ,/.. .漏出率检测细胞凋亡率 采用比色法分别检测各组含量,发现当以.处理细胞后所测的 细胞上清中含量为%计时,正常组细胞中漏出率仅为.% : .%,而.建立的模型组中其漏出率达到.%.%, ./ 和/预处理则能分别将所致的漏出率 降为.%士.%署 .%士.%,提示 能显著减少所致的 细胞损伤,提高细胞存活率. /孓捣.。 硕::论文 华中科技火学同济医学院 ? 摹 ? 譬 ? 时 三 竹 ? ? 嵋’ . , / . ./ .. , %.堋. 一 .. . /. .流式细胞仪检测海马神经元凋亡率 , 采用标记的膜连蛋白 与碘化丙啶 与细胞膜上磷脂酰丝氨酸特 匹配使用,流式细胞仪检测神经元凋亡率。 异性结合,正常细胞的磷脂酰丝氨酸位于细胞膜内侧,早期凋亡时即发生外 翻, 与 结合染色呈阳性,标记为早期凋亡细胞。是一种特异性的细胞核 染料,不能透过活细胞胞膜,在正常细胞和早期凋亡细胞中呈阴性染色,而在 凋 亡晚期染色呈阳性。/匹配染色进行流式细胞仪检测,细胞可分为 /‘为早期凋 四种亚群:左上象限 。/‘为活细胞,右上象限 亡细胞,右下象限/为晚期凋亡细胞,左下象限为机 械损伤细胞。 经/匹配染色后流式细胞仪检测发现,正常培养的神经元本 身仅有少量凋亡发生.%.%,而.损伤 后,神经元凋亡率均明 显上升.%士.%.. ,表现为/和/’ 可使/ 染色细胞数目均增加,与模型组相比, /华中科技大学同济医学院 坝:论文 和/‘染色细胞数目明显减少.%.%,. / / 预处理可使 , / 引起的细胞凋亡率降低为.%.%. ./.,.。 . ? : ;辅 慧 ..。臻瓣 滋攀: 黛 ?, ? 黼 魏藕 :纛 ; “’ . ’ 。。。 寥 盛 黛 . 一暴~磐置?口《.. .:/ . . , //, / .洲. .. / . .. . 坝:论义 华中科技火学尉济医学院 . 染色计数凋亡和坏死细胞 为细胞膜通透性的荧光染料可与细胞核特异性结合,凋亡或坏死细 胞表现为细胞核碎裂、溶解、甚至形成凋亡小体。与对照组.%.%相比,彤 ,面 使培养海马神经元中凋亡细胞数目显著增加,%.%,. / .%.%,. 和 .%.%, / . 预处理 可明显减少.所致凋亡细胞数目的增加。 . . ? ? 卯 ? ? ? 爨【一。葛三面。乓苗? 帕 //曲 酣’ .. .:.. / . / .. .蝴. . ./. . .. 兰?型垫查兰堕塑堕兰堕 堡丝苎 ? 检测”表达/ 检测结果显示 和抑制物 / 均可显著逆转所致的‘下调,增加。表达,从而 抑制的活性,见.。.. .‰ .?‘ , “ .?” 艮. . 。‘ “.”. .尸. / .. 讨论 本研究通过和实验检测发现 能明显减轻所致海 马神经元细胞损伤,增加细胞存活率。流式细胞仪检测和 染色计数 凋亡细胞进一步观察到 可使.所致海马神经元凋亡率明显降低, 提示 对.所致海马神经元损伤具有一定的保护作用。 阿尔茨海默病以进行性痴呆,记忆力下降为主要临床特征,主要病理 表现为细胞外的老年斑形成,细胞内的神经元纤维缠结和神经元丢失【幢。 ?】。神经元纤维缠结主要由蛋白过度磷酸化所引起,而.淀粉样蛋白介导神 经 元氧化应激性损伤,进一步促进蛋白的过度磷酸化而加重神经元纤维缠结 【。”。 蛋白的丝氨酸和苏氨酸,即脯氨酸基序组成的片段常被作为磷酸化位点而受 攻兰主壁垫查兰旦堡垦兰堕 堡:笙兰 ’, 击【,某些激酶如糖原合成激酶与蛋白的磷酸化密切相关 在蛋白和其他微管相关蛋白如的稳定性中具有重要作用【。已有研究表 明抑带阻止蛋白过度磷酸化,促进蛋白与微管相关系统结合‘”‘】。 当第位丝氨酸被磷酸化后,即?”可抑制的活性。本实 验发现可显著抑制?”的活性, 则可逆转.”’的表 达,抑伟的活性而发挥保护作用。以往研究表明,本实验使用的阳性对照 药通过可逆性地抑制而正性调节信号通路【】,被用于治疗实验性神 经退行性疾病。本实验中 减轻’所造成的海马神经元损伤的作用强 对神经退行性疾病也具有一定的作用。 度和抑制剂相当,提示 目前抗帕金森病药物在动物实验中已取得较好的疗效,培高利特等药物 也试用于的临床治疗。本课组前期研究发现多巴胺受体特异性激动剂 在动物模型上表现出良好的抗帕金森病效应,结合本实验结果进一步提 示 可能在的治疗中具有一定的应用前景【。颂’论文 华中科技大学同济医学院 参考文献 . ...,..,...,.,. .,.一 ... ..,.,..,.,.,. ,..,. . .:. 一 .. ...,..,..,..,..,..,. ,..,.,.,.,.. ,... . ,..,.,..,.,.扎,.?:?. ...,..,..,.,...,. ? / ., .. 仁 . .,. , , ?, 一 . .? ,’ , .. , 一一 , .,.. .. : ....,..“乃. ..,..,..,.,..,. ’ .. .. ..’. ,.,..,. 华中科技大学同济医学院 硕:论文.. :. ...,..,.,.,.... .?. . ...,..,.,.., . ’ . .一. . , ’, ., , ., 一 .,..铅一. . ...,,..,,..,,..,. ’’ . ...,..,..,..一..,.一.,:. ...,.., .,..,...,. ? : . .?. ..?,., .,.,.,. 一 .,.? .., ??? .: . ,.,.,.,., .,.硕’:论文 华中科技大学刊济医学院? / . ? :? . . . . , , .,. ? 口...:. 小结 预处 本实验给予岬/建立海马神经元损伤模型,观察 理后介导的海马神经元损伤的作用,结果发现: 实验和培养液上清中含量检测海马神经元存活率,观察到 浓度依赖性地减轻.所致海马神经元损伤; 荧光染色计 数坏死及凋亡细胞和/匹配染色后流式细胞仪检测,发现 可明显减轻所造成的细胞凋亡。 检测”“磷酸化水平,发现 可逆转引起 通过升高?蜘表达,抑制 的船表达降低,提示 活性而拮抗.所致海马神经元凋亡。硎”论文 毕中科技火学同济医学院 全文总结 在生理条件下对细胞内钙离子及相关信号通路的影 本文通过研究 响及其机制,发现.. ./ 浓度依赖性地增加海马神经元【, 其机制可能是通过作用于耦联的多巴胺受体,激活信号级联反应, 诱发细胞内钙库中的释放,细胞内升高的通过激活相应信号分子, 继而磷酸化.型钙通道和受体门控钙通道,迸一步介导细胞外内流而维持 【】的进一步增加。 本实验进一步研究了 的神经保护作用及其机制。采用肛/ 建立细胞模型,给予不同浓度 预处理,观察其对所致海 马神经元损伤的影响,发现.. 可浓度依赖性地减弱. / 对海马神经元的毒性作用,保护其免受攻击而发挥保护作用,实验表明 可能通过抑制的活性而发挥保护作用。具有两个磷酸化调节 位点,当第九位丝氨酸被磷酸化后即‰可抑制的活性,而当第 位苏氨酸被磷酸化后即劬‘则可上调的活性。本实验通过检 可逆转对”的下调,增加 测”的表达发现 ‰‘的表达而抑制的活性。 研究表明锂盐和条件培养液均可通过依赖性的调节而减 轻所致培养海马神经元损伤,本实验中 通过激活耦联的多巴 胺受体,促进水解为和而增加敏感的钙库中钙离子释放,细胞内 增加的和激活,进而通过磷酸化第位丝氨酸即” 而抑制的活性,减少蛋白过度磷酸化而发挥抗所造成的海马神经 元损伤效应。 通过 综合本实验结果表明,新型的.多巴胺受体激动剂 口/通路增加【,激活,继而磷酸化,拮抗的神经毒性作 用,提示 对具有潜在的治疗效应,为拓宽其临床应用前景提供有 力的实验依据。 本文创新点:.阐明升高培养海马神经元【】的信号转导机制。 .首次报道对所致海马神经元损伤具有保护作用。硕:论文 华中科技大学剥济医学院 综述 多巴胺受体在神经退行性疾病中的作用研究进展 多巴胺是中枢和外周神经系统内的一种重要的神经递质,参与多种生理功能 的调节。在中枢神经系统中,多巴胺可以调节运动,感觉情绪的输入和处理,食 欲,呕吐反射及垂体前叶素的分泌,在外周神经系统中则主要调控心脏和肾脏的 血流量【。当体内的多巴胺递质含量失衡时,将会导致许多病理性疾病的出现, 如帕会森氏病、精神分裂症、肌萎缩侧索硬化症,以及是肥胖和酒精中毒的发生。 多巴胺受体是一种蛋白耦联受体,通过与蛋白结合而介导细胞内信号转导, 参与细胞内生理及病理功能的调节。本文通过对多巴胺受体在脑内的分布,信号 转导途径及其生物学特性,对学习记忆等生理功能的调节,以及在神经退行性疾 病的病理生理学功能进行综述,拟归纳多巴胺受体在脑内的生理和病理学意 义。 一多巴胺受体的分类: 脑内的多巴胺受体被分为五种亚型:、、、、多巴胺受体,根据 它们与不同蛋白之间的耦联关系,在中枢神经系统中的分布以及药理学特 性, 可以将其分为两类:类多巴胺受体和类多巴胺受体。其中类多巴胺受体 包括和,而又有两种亚型组成:和,目前通常说的即, 即其共同特性是激活腺甘酸环化酶,升高细胞内的水平。最近研究发 现一种新型的多巴胺受体:一耦联的多巴胺受体,因其不升高细胞内 的水平而区别于经典的多巴胺受体,但其可被多巴胺受体拮抗剂 所拮抗,因此亦被归于类多巴胺受体。而类多巴胺受体包括、和 受体,都可抑制的活性。 ‘ 二多巴胺受体在脑内的分布 类多巴胺受体的分布:。多巴胺受体是脑内分布最广泛和含量最高的受体 ,主要分布在纹状体,伏核,嗅球,大脑边缘系统,丘脑下部和丘脑。 仅局限在海马,外侧乳头状核和下丘脑束旁核表达‘即】。.耦联的新型多巴 胺 受体则较多分布于杏仁核,海马,皮层和纹状体。 类多巴胺受体的分布:在大部分脑区中,类多巴胺受体和类多巴胺受体