BMP7缓释微球的制备及其对人牙周膜干细胞和根尖牙乳头干细胞增值

BMP7缓释微球的制备及其对人牙周膜干细胞和根尖牙乳头干细胞增值 分类号 密级 公开 国际十进分类号(UDC) 第四军医大学 学位论文BMP-7 缓释微球的制备及其对人牙周膜干细胞和 根尖牙乳头干细胞增值分化的影响 (题名和副题名) 李 帅 (作者姓名) 指导教师姓名 倪龙兴 教授 (主任医师) 指导教师单位 第四军医大学口腔医院牙体牙髓科 申请学位级别 硕士 专业名称 口腔临床医学口内 论文提交日期 2010.04 答辩日期 2010.05 论文起止时间 2008 年 12 月至 2010 年 04 月 学位授予单位 第四军医大学 论 文 论 文 独 创 性 声 明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名: 日期: 保 护 知 识 产 权 声 明 本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即:研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容(含电子版，保密内容除外)，可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。同意学校将论文加入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》和编入《中国知识资源总库》，同意按 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。论文作者签名: 导师签名: 日期: 论 文 论 文BMP-7 缓释微球的制备及其对人牙周膜干细胞和 根尖牙乳头干细胞增值分化的影响 研 究 生:李 帅 学科专业:口腔临床医学口内 所在单位:第四军医大学口腔医院牙体科 导 师:倪龙兴 教授(主任医师) 辅导老师:吴 红 教授关键词:rhBMP-7;3-羟基丁酸酯与 3-羟基戊酸酯共聚物(PHBV); 缓释微球;牙周膜干细胞;根尖牙乳头干细胞;增殖;分化 中国人民解放军第四军医大学 2010 年 5 月 论 文 论 文 第四军医大学硕士学位论文 目 录缩略语 表 .............................................................................................................. 1中文摘要 .............................................................................................................. 3英文摘要 .............................................................................................................. 5前 言 .............................................................................................................. 8文献回顾 ............................................................................................................ 10正 文 ............................................................................................................ 21 实验一 人牙周膜干细胞和根尖牙乳头干细胞的分离、培养和鉴定..... 21 1 材 料 ......................................................................................................... 21 2 方法 ......................................................................................................... 22 3 结果 ......................................................................................................... 24 4 讨论 ......................................................................................................... 25 实验二 PHBV-BMP-7 微球的制备及相关检测 ........................................ 29 1 材料 ......................................................................................................... 29 2 方法 ......................................................................................................... 30 3 结果 ......................................................................................................... 32 4 讨 论 ......................................................................................................... 36 实验三 PHBV-BMP-7 缓释微球对人 PDLSCs 和 SCAP 增殖分化的影响... 38 1 材料 ......................................................................................................... 38 2 方法 ......................................................................................................... 38 3 结果 ......................................................................................................... 40 4 讨论 ......................................................................................................... 43小 结 ............................................................................................................ 45参考文献 ............................................................................................................ 46个人简历和研究成果 ........................................................................................ 53致 谢 ............................................................................................................ 54临床病例 ............................................................................................................ 55 论 文 论 文 第四军医大学硕士学位论文 缩略语表缩略词 英文全称 中文全称α-MEM α- modified eagle’s medium α-MEM 培养基ALP alkaline phosphatase 碱性磷酸酶BMP BMSC bone marrow derived stroma cell 骨髓bone morphogenetic protein 骨形成蛋白 间充质干细胞CFU colony forming unit 克隆形成单位DPSC dental pulp stem cell 牙髓干细胞DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜DMEM dulbeccos modified eagles medium DMEN培养基DSPP dentin sialophosphoprotein 牙本质涎磷蛋白DOPC determined osteoprogenitor cell 定向性成骨细胞IOPC inducible osteoprogenitor cell 诱导性成骨细胞HA-TCP hydroxyapatite-tricalcium phosphate 羟基磷灰石-磷酸三钙OD optical density 吸光度PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液PDLSC periodontal ligament stem cell 牙周膜干细胞PHB poly3-hydroxybutyrate 聚羟基丁酸PHBV poly3-hydroxybutyric 3-羟基丁酸酯与3-羟基戊 acid-co-3-hydroxyvaleric acid 酸酯的共聚物 -1- 论 文 论 文 第四军医大学硕士学位论文缩略词 英文全称 中文全称PHV poly3-hydroxyvalerate 聚羟基戊酸PLA polylactic acid 聚乳酸PVA polyvinyl alcohol 聚乙烯醇TGF-β transforming growth factor-β 转化生长因子-β -2- 论 文 论 文 第四军医大学硕士学位论文BMP-7 缓释微球的制备及其对人牙周膜干细胞和 根尖牙乳头干细胞增值分化的影响 硕士研究生 :李 帅 导 师 :倪龙兴 教授 第四军医大学口腔医院牙体牙髓科，西安 710032 中文摘要 骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic proteins-7BMP-7) 又称 OP-7， ，属于 TGF-β 家族，在调控牙根发育及修复性牙本质形成方面具有重要的作用，但其半衰期短特异性差，体内易被稀释代谢而失活。本课题通过体外分离、培养和鉴定人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)和根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla，SCAP)，采用复乳-溶剂蒸发技术制备 PHBV-BMP-7 缓释微球，分析微球的缓释作用及对两种细胞增殖分化的影响，从而为探讨 BMP-7 缓释微球与干细胞相结合在牙根闭合，牙根损伤修复及牙根再生中的可能作用和应用，提供参考依据，结果如下。一、牙周膜干细胞和根尖牙乳头干细胞的分离、培养和鉴定 收集临床上健康的根尖未发育完成的阻生齿、前磨牙或多生牙，采用酶消化培养法分离得到人 PDLSCs 和 SCAP，克隆化分离培养;观察两种细胞的生长状态，抗体标记检测细胞表型，进行细胞鉴定。结果:细胞生长 -3- 论 文 论 文 第四军医大学硕士学位论文状态良好，增殖快，SCAP 原代细胞的生长速度较 PDLSCs 慢，呈集落样生长;免疫组化染色显示两种细胞 STRO-1 和波形丝蛋白阳性表达，角蛋 白阴性表达，茜素红矿化结节染色阳性。二、PHBV-BM-7 缓释微球的制备及相关 检测 采用复乳-溶剂蒸发技术制备 PHBV-BMP-7 载药微球，电镜下观察微球的形 态粒径，通过 ELISA 法检测微球的释药率及体外 56 天内的释药百分数，并收集 1d，3d，7d，14d，28d，56d 微球释放液;结果:微球形态圆整均匀 ， 粒 径 范 围 较 窄 ， 平 均 粒 径 为 50μm?12μm ， 跨 距 0.7 ， 载 药 率 为0.67?0.27， 微球中的 BMP-7 释放符合双相动力学释药规律，1d 内的释放百分数为 17.22?0.94，呈突释性释放，累计释放量不断增加，至 56天时达到 52.75?4.67。三、 PHBV-rhBMP-7 微球对 PDLSCs 和 SCAP 增殖和分化的影响 选择第 46 代生长 良好的 PDLSCs 和 SCAP，分别用 PHBV-BMP-7 微球和 PHBV 空载微球不同时 期的释放液培养，用 MTT 法测定缓释的rhBMP-7 对细胞增殖的影响，通过检测细 胞碱性磷酸酶活性观察其对细胞分化的影响。结果:各时间点的 PHBV-BMP-7 微 球释放液均可促进 PDLSCs和 SCAP 的增值和分化，促进作用随释放时间延长而 增强，且 14d 后的各时间点均与 7d 内各时间点有显著差异(P,0.05)，与 PHBV 0.05);空载微球各相应时间点释放液和空白对照组相比，差异有统计学意义(P, 空载微球与对照组相比，细胞增殖和 ALP 活性无显著性差异(P, 0.05)。 PHBV-BMP-7 缓释微球释放的 BMP-7 对 PDLSCs 细胞增殖影响稍大于SCAP，但 差异不明显(P,0.05)，但对 SCAP 的 ALP 活性影响要明显强于对 PDLSCs 的 作用(P,0.05)。关键词:rhBMP-7;3-羟基丁酸酯与3-羟基戊酸酯共聚物(PHBV); - 论 文 论 文 第缓释微球;牙周膜干细胞;根尖牙乳头干细胞;增殖;分化。 -4 四军医大学硕士学位论文 Preparation of the nanosized and release-controlled rhBMP-7 microsphere and its effect on proliferation and differentiation of PDLSCs and SCAP. Candidate for master: Li Shuai Supervisor: Ni Longxing Department of Operative Dentistry amp Endodontics School of Stomatology Fourth Military Medical University Xi′an 710032 China Abstract BMP-7 also known as osteogenic protein-1 ， is a member of thetransforming growth factor-β superfamily.BMP-7 plays an important role inregulating root and reparative dentin formation. With a short half-life and lowspecificity it is prone to deactivation because of deliquation and metabolism ifthe growth factor is used directly in vivo. Microsphere encapsulating growthfactors which can slow-release factors were prepared by the double emulsionsolvent evaporation technique. By means of isolation culture and identificationof human PDLSCs periodontal ligament stem cells and SCAP stem cells fromthe apical papilla the present study prepares the nanosized and controlledrhBMP-7 microsphere and explores its effects on the proliferation and -5- 论 文 论 文 第四军医大学硕士学位论文differentiation of PDLSCs and SCAP. The results of the study providedexperimental evidences for further research on continuous formation of the rootto its completion and bioroot engineering. This study includes three parts: 1. Cell culture and identification: Normal human impacted third molarswith immature roots or premolares were collected from healthy patients. Theroot apical papilla and periodontium were digested in a solution of collagenaseand dispase and the stem cells were isolated by limited dilution of cultured cellfor single cell clone. Their morphology and growth condition were observedunder inverted light microscope. Immunohistochemistry procedure wasemployed to detect surface marker of the cloning cell. Results: PDLSCs andSCAP exhibited self-renewal and clonogenic cell population. The growthvelocity of SCAP was slower than PDLSCs. Immunohistochemical analysisshowed that cultured cells expressed vimentin and STRO-1 while keratin wereabsent in PDLSCs and SCAP. 2. Preparation of the nanosized and controlled rhBMP-7 microsphereand its relative determine: The rhBMP-7 loaded microspheres withbiodegradable poly 3-hydroxybutyrate- co-3-hydroxyvalerate PHBV wereprepared by a double-emulsion solvent-extraction water-in-oil-in-watertechnique and assess the microspheres’ morphology size and size distribution byelectron microscope. Determine the encapsulated ratio of the microsphere byusing Elisa kit and collect the releasing liquid from the microsphere after 1d 3d7d 14d 28d and 56d. Results: The diameter of PHBV microsphere was50μm?12μmthe load density of rhBMP-7 was 0.67?0.27In the first daythe microsphere release 17.22?0.94 and raise to 52.75?4.67 in the 56thday. -6- 论 文 论 文 第四军医大学硕士学位论文 3. Effects of the rhBMP-7 loaded microspheres with PHBV onproliferation and differentiation of PDLSCs and SCAP: Cells between thefourth and sixth passages were used in this study. The optical density wasobtained by MTT assay in cells stimulated by microspheres controlling andreleasing BMP-7 in different date. Effect of microsphere on differentiation ofPDLSCs and SCAP was indirectly measured by the activity of alkalinephosphatase of the cells. Result: When compared with control group thereleasing liquid from the microsphere stimulated the cell proliferationsignificantly and the ALP activities P,0.05.Moreoverthe cell stimulated bythe releasing liquid14d28d56d proliferation and ALP activities increasedgradually. Group of the microspheres without BMP-7 had no significantdifference comparing with control groupP,0.05. When comparing the groupof PDLSCs and SCAP the effect on proliferation of PDLSCs was slightlygreater than SCAP but the difference is not very significant. However the ALPactivity of SCAP was greater than PDLSCsP,0.05.It is concluded that withgood osteogenetic activity the biodegradable PHBV microphere system can beserved as carrier for sustained release of rhBMP-7.Key words: poly 3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate PHBV ALP Microsphere rhBMP-7 PDLSCs SCAP proliferation differentiation -7- 论 文 论 文 第 四军医大学硕士学位论文 前 言 根尖牙乳头干细胞(SCAP)是在牙根未完全发育 完成的牙齿根尖部位发现和分离出来的，它属于间充质干细胞的一个新的种群，该 细胞的发现或许可以解释已感染的未发育完成的恒牙根尖为何可以自身形成12。已 有实验证明，以羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)材料作为 SCAP 的载体植入免疫 缺陷型小鼠皮下，SCAP 可分化成为类成牙本质细胞，并形成牙本质1。尽管 SCAP 某些特性与早期发现的牙髓干细胞(DPSCs)相似3，但在组织学，免疫组织化学及 细胞学评估上仍有很多差异。Sonoyama 等人2已指出一种可能性:应用 SCAP 和 其.