国家自然基金标书用慢病毒RNA干扰系统研究精子发生相关基因znf230的功能

国家自然基金标书用慢病毒RNA干扰系统研究精子发生相关基因znf230的功能 摘要： （限400字） RNA干扰（RNA interference,RNAi）是由双链RNA介导的 序列特异性的mRNA降解所致的转录后基因沉默过程。RNAi技术可方便快捷地研究基因的功能，并用于功能基因的筛选。本课题拟采用RNAi及胚胎干细胞体外定向分化技术，将我室新克隆的精子发 生相关基因znf230的siRNA通过慢病毒（Lentivirus）系统引入小鼠胚胎干细胞，体外模拟精子发 生过程，而在细胞水平上研究znf230基因表达受抑后对生精的影响，同时结合基因表达谱芯片及蛋 白组二维电泳-质谱技术实现基因功能性及蛋白质表达筛查，以期全面研究该基因的功能。上述技术 平台的建立将提供一个精子发生相关基因功能研究的模型，亦为RNAi技术的应用研究拓展了新的思路。这一设想尚未见文献报道，如能证明其合理有效，将成为难于鉴定表型且异常表达的基因功能 研究的通用模型，并在后续蛋白组学及基因相关药物的研发中发挥重要作用。 （4000-8000字）： （） 人类基因图谱解码已经完成。进入功能基因组学时代后，疾病相关基因以及 重要功能基因的分离、定位、克隆表达已日益加速。而随着新基因的分离与鉴定， 对这些基因的功能进行系统的研究将成为这一时期的主要任务。因此，建立或开 发新的或实用的基因功能研究技术平台具有重要意义。 在功能基因组研究中，酵母杂交系统、DNA芯片、反义RNA、基因敲除(gene knock-out)等技术为解读基因功能提供了有效的手段。其中基因敲除虽是基因功 [1]能研究的经典技术，但由于外源及靶DNA发生同源重组的几率极低，重组体 的筛选及检测即成为该技术的瓶颈，难以适应大规模的基因功能研究。近年来发 展起来的RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术作为特异性抑制基因表达的方 法，已成为生命科学领域研究的热点。其优点是可以简便地制备特定基因缺失表 型的个体，较快捷地研究目的基因的功能，并使系统性、高通量功能基因筛选成 为可能。 RNAi现象首先在秀丽新小杆线虫(C.elegans)中被发现。它通过双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)介导的同源靶mRNA的特异性降解，在转录后水 [2,3]平使基因沉默(Post Transcriptional Gene Silencing, PTGS)。RNAi技术现已成功 [4,5]运用于线虫、果蝇、植物、真菌和脊椎动物等生物体的功能研究中，而在哺 [6]乳动物细胞内转染21-25 nt长度的siRNA也可以诱导特异性的基因沉默，虽然 [7-10]这种效应具有瞬时性。目前，多个研究小组已将靶向特异基因的shRNA表达质粒导入细胞，在聚合酶?依赖性H1或U6启动子控制下获得siRNAs的持续表达并导致了靶基因特异、持续的下调，这为RNAi用于长期功能缺失型研究 提供了新的思路。然而，目前在RNAi应用研究中仍存在如下一些问题亟待解决， 如： 1) shRNA表达载体对某些靶基因虽能取得较明显的RNAi效应，但多数仍呈 瞬时性，且受到转染效率、细胞类型等因素的限制，难以获得长期的 “knockdown”效应。 2）并非所有的组织或细胞的靶基因对RNAi敏感；某些基因的表型鉴定本身 就存 在困难，一定条件下需用特定的基因传递系统在模型中加以证实。 3）目的基因序列上siRNA模板的选择无统一。实际操作中往往是试探性 的，选 择不同序列RNAi效应差别大，抑制率可从0～90％不等。 因此，建立高效、稳定长期表达的RNAi传递系统正是该领域目前研究的关 [11]，但MMLV类病毒自键。虽然逆转录病毒的运用能有效地降低靶基因的表达 身特点及对细胞类型的选择性使其应用受到一定的限制。当前，新型第三代慢病 毒(Lentivirus)系统正以其高效、稳定的特性在RNAi研究中倍受关注。Lentivirus来源于HIV-1病毒，其宿主细胞范围广泛，包括分裂细胞、非分裂细胞、原始细 [12,13][14]胞等，且转基因在生殖系统中可稳定传递。Pfeifer等的研究结果表明， Lentivirus介导的转基因均可在鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem, ES)体内、外分化过程中表达，将Lentivirus感染的ES细胞注入胚泡期或桑椹期胚胎，发育的新 [15]生鼠及其子代的多种组织中均可检测到转基因。Tiscornia等将沉默GFP的Lentivirus感染GFP阳性转基因鼠卵细胞，发现新生鼠体内GFP荧光蛋白的表达 [16]明显降低。Rubison等运用CD8/CD25 siRNA 的Lentivirus载体转染鼠ES细胞，生成了 “knockdown”转基因鼠，其效应维持长达30天之久并可传递下一代， 充分显示了该方法的优越性。 精子发生是一个复杂的多阶段的细胞分化过程，涉及生精细胞的生长、分裂、 [17,18]分化和信号传递等，要求一系列基因表达的精确调控。这些基因的异常将导 致精子发生障碍，表现为寡精症或无精症。近年来我室分离克隆了一系列可能与 [19-22]精子发生相关的基因，目前已初步阐明了这些基因的结构与表达，如ZNF230在无精症患者睾丸组织中无表达，znf230在小鼠睾丸内特异表达且可能在精细胞 [22](spermatid)形成阶段起重要作用。由于生精过程极其复杂，这些基因的调控及 其生物学功能尚未明了。为探索此类问题，首先需建立供研究的模型系统。2003 [23]年末，Toshiaki Noce研究小组成功地将小鼠ES细胞在体外定向分化成精子。研究中，悬浮培养的ES细胞在BMP4刺激及拟胚体立体空间构型的影响下向原 始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)分化，具PGCs性质的ES细胞aggregation移植至裸鼠的睾丸囊中即可发育成成熟的精子。此外，Daley 及Geijsen等研究 [24]小组也报道了ES细胞体外分化成精子的新进展。 基于以上RNAi研究所取得的成果，结合鼠ES细胞体外定向分化新技术， 我们设想如能将Lentivirus系统引入小鼠ES细胞使之长期稳定表达、发挥RNAi效应，则可模拟兴趣基因在特定疾病中的异常表达情况，进而确定其功能。因此， 可将ES细胞在体外定向分化成精子，即体外模拟精子发生过程，在细胞水平上 研究某一精子发生相关基因表达受抑后对生精的影响，以期全面研究该基因的功 能。 鉴于此，本课题在前期研究工作的基础上，拟运用生物信息学及RNAi载体构建新技术对我室新克隆的基因znf230(GenBank ID:AF353167)进行有效siRNA 序列筛选、靶位证实，生成高效表达的Lentivirus载体系统并引入小鼠ES细胞， 阻断znf230的表达(6个有效的shRNA串联片段使RNAi抑制率至少达90％以 上)。在精子体外分化模型的细胞水平上，为了有效地获取精子发生过程中znf230 相关基因的表达、网络调控及其功能信息，将结合基因表达谱芯片技术的高通量、 快速、敏捷、平行性等特点，对照研究znf230表达被抑后表达谱的变化，以实现高通量的基因功能性筛查；同时运用经典的蛋白组学二维电泳-质谱技术来研究znf230被抑制后的蛋白表达变化，实现对蛋白质的表达进行原位筛查，以期 分离鉴定有功能意义的蛋白。 目前国内对RNAi的研究刚刚起步，我们利用Lentivirus RNAi系统建立的znf230基因功能研究方法，在理论与技术上均与国际上的有关研究位于同一 起点。上述技术平台的建立将提供一个精子发生相关基因功能研究的模型，亦为 RNAi技术的应用研究拓展了新的思路。这一设想尚未见文献报道，如能证明其 合理有效，将成为难于鉴定表型且异常表达的基因功能研究的通用模型，并在后 续蛋白组学及基因相关药物的研发中发挥重要作用。 参考文献 1. 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(1) 通过在ES细胞水平的功能研究，阐明znf230在精子发生过程中所起的作用； (2) 利用RNAi及ES细胞体外定向分化技术，明确znf230在精子发生何阶段起 作用； (3) 结合基因表达谱芯片及蛋白组二维电泳-质谱技术实现基因功能性及蛋白质 表达筛查，以期获得与znf230相关的基因网络调控信息并分离鉴定有功能意 义的蛋白； (4) 利用Lentivirus RNAi系统建立一种精子发生相关基因功能研究的模型。 (1) Lentivirus高效表达载体系统的构建； (2) Lentivirus病毒生产及感染小鼠ES细胞； (3) ES细胞体外定向分化模型的建立； (4) 宿主鼠精子细胞的收集、鉴定； (5) 体外培养FACS纯化的圆形精细胞，结合基因表达谱芯片及蛋白组二维电泳- 质谱技术实现基因功能性及蛋白质表达筛查。 （1） Lentivirus高效表达载体系统的构建是本课题的关键：运用生物信息学及 最新载体构建技术（Lentivirus载体携带6个串联shRNA），对有效的znf230 siRNA 片段进行筛选、靶位证实，以使RNAi抑制靶基因的效率至少达 90％以上。我们将同专业从事RNAi的研究机构合作，开发有效的靶向 znf230的Lentivirus载体系统。 （2） ES 细胞体外定向分化模型的建立是本课题的关键。操作中，我们将 Lentivirus载体自身携带的GFP基因用于ES细胞分化过程的鉴定， 代替了文献中GFP或Lacz knock-in载体的构建，而只需用FACS分选 即可达到同样的目的。这将大大降低实验技术性难度，增加了操作的可行 性。分化实验中的其他技术和方法基本上是成熟的实验方法或有相关文献 可以参照。因此，ES细胞体外分化模型的建立将不存在技术难题。 （3） 基因表达谱芯片技术及蛋白质二维电泳-质谱技术亦是本课题研究的关 键：基因芯片可以与专业从事芯片研究开发的公司合作；申请者所在的人 类疾病基因组学研究室是教育部人类疾病生物治疗重点实验室的一部分， 拥有先进的供蛋白组学研究用的设备及仪器，并有此方面丰富的经验，因 此经典蛋白组学研究方面将不存在技术及方法学方面的问题。 主要研究方法包括：RNAi、生物信息学、DNA分子克隆技术如表达载体的 构建、Lentivirus病毒的包装及生成、ES细胞培养技术、RT-PCR、细胞免疫组织化学技术、流式细胞检测及细胞分选技术、Aggregates移植技术、基因表达谱芯片技术、二维电泳-质谱技术等。 （用下列流程图表示） 运用生物信息学设计有效的21nt znf230 siRNAs，进行靶位筛选、证实， 设立阴性对照，合成shRNA oligos 运用最新RNAi载体构建技术将6个 shRNA串联插入Lentivirus表达载体（包 括阴性及空白对照） Lentivirus病毒生产、 滴度测定 Lentivirus病毒感染ES细胞、 FACS分选GFP阳性ES细胞 In-vitro GFP阳性ES细胞体外与表达BMP4的M15 孕鼠E13.5 雄性胚 细胞共培养至aggregation或EB形成，鉴 胎性腺细胞的准备 定Mvh阳性表达的EB，FACS 2次纯化1 天coaggregate培养的上述混合细胞 混合培养16h，生成的aggregates移 植入CD-1 (ICR)雄性裸鼠睾丸囊内 无精子产生 精子生成 收集精子、 进行鉴定 分离圆形spermatid，体 鉴定细胞发育阻滞在减外培养、扩增 数分裂何期？ 基因表达谱芯片及二初步确定znf230基 维电泳-质谱技术筛查因的生物学作用 基因及蛋白表达变化 znf230 (1) Lentivirus载体构建：运用计算机生物信息学，对znf230 siRNA 靶序列 进行筛选、靶位证实，将6条最佳的shRNAs串联构建入LentiLox3.7， 如下图所示。 . (2) Lentivirus病毒生产及感染ES细胞：利用重组LentiLox3.7及包装病毒 VSVG、RSV-REV、pMDLg/pRRE按Lentivirus生成程序生产高滴度 Lentivirus，感 染小鼠E14TG2a ES(XY)细胞，FACS分选GFP阳性克隆。 实验中包括阴性及空白对照Lentivirus感染组。 (3) ES细胞体外定向分化实验： A) 体外悬浮共培养表达BMP的M15滋养层细胞与GFP阳性ES克4 隆，以生成细胞集结（aggregation）及拟胚体（Embryoid body, EB）。 B) 运用RT-PCR 鉴定Oct4、Mvh、Gfp、Fragilis、Stella、BMP8b基 因的表达，运用免疫组织化学技术证实GCNA1 及SYCP3（原始 生殖细胞特异）的表达。 C) 运用FACS 2次纯化A)中共培养ES细胞及M15细胞1天后混合 物，使纯化率>95%。 D) 获取E13.5孕鼠(Slc:ICR) 雄胚胎性腺细胞，与C)细胞共培养16h， 生成的细胞集结移植入CD-1 (ICR)雄性裸鼠睾丸囊内。实验中设 立性腺细胞、未分化ES细胞、未纯化ES细胞移植对照组。 (4) 精子生成分析、鉴定：移植6-8周后，分离由ES细胞发育的曲精管，观 测精子 的形成。如无精子发生，制作曲精管切片，用细胞遗传学方法确 定精子发生阻滞的阶段；若有精子发生，收集精子，检测相关精子生物 学指标，并与对照组比较。 (5) 体外培养圆形精细胞：若有精子发生，分离圆形精细胞，FACS分选鉴 定并进行 体外培养、增殖。 (6) 基因及蛋白表达筛查：利用基因表达谱芯片技术，对照研究圆形精细胞 基因表达的变化，并在此基础上运用2D-PAGE-质谱技术对照研究圆形精 细胞蛋白表达的变化，并由此分离鉴定有功能意义的蛋白。 (7) 结合以上研究结果，综合分析znf230基因在小鼠精子发生过程中的作用。 1． 课题组成员参加过涉及基因敲除等转基因鼠生成的全过程工作(与上海转 基因动物实验中心合作，在863课题的资助下进行，目前已初步建立了该 技术平台)，熟练掌握了相关技术的关键步骤，如ES细胞培养、胚胎的移 植技术。这为本课题的实施提供了提供了良好的技术支持，完全可以完成 该课题的ES细胞操作部分。此外，申请人所在实验室与以色列Weizmann 科学研究所Groner 教授实验室具有稳定合作关系，在本课题实施过程中 可能派人员在该研究所进行部分实验。因此，本课题的实施将不存在技术 难题。 2． ES 细胞体外定向分化模型的建立是本课题的关键。操作中，我们采用 相对简便、易行的技术，增加了操作的可行性（见拟解决的关键问题部分）。 因此，ES细胞体外分化模型的建立亦不存在技术难题。 3． 在Lentivirus载体构建技术上，我们将同武汉专业从事RNAi研究开发的 Genesil公司取得商业上的合作，以实施最佳siRNA片段的筛选、靶位证 实及载体构建。 4． 目前我们已经开展了RNAi研究工作。在前期研究工作中，已经成功地运 用了Lentivirus及PAVU6+27载体，并构建了靶向EGFP、c-myc、Dsred2、 hTERT、hTR等基因在内的15条shRNA片段，初步的细胞转染/感染取 得了较好的干扰效应，其他研究工作正在进展中。因此，我们在载体构建、 细胞转染、筛选、病毒生产等技术操作上拥有丰富的积累。这是实施该课 题成功所具备的可贵经验。 5． 本实验室是“人类疾病生物治疗教育部重点实验室”和“四川省疾病基因 组学和法医学重点实验室”的主要组成单位。具备完成课题所需的一切先 进设备和条件，且各种硬件均处于工作状态。 综上所述，本课题的设施具有可行性。 1) 结合RNAi研究的新进展，探索一种同时能高效表达6个siRNAs的RNAi 载体构建新方法； 2) 将在生殖系统中高效、长期、稳定表达的Lentivirus RNAi载体用于精子 发生相关基因的功能研究，可望获得长期的基因”knock-down”效应。 3) 将RNAi这一强有力的基因功能研究工具与胚胎干细胞体外定向分化技 术相结合，在精子发生的细胞水平上研究znf230基因的功能。该技术平 台的建立将提供一个精子发生相关基因功能研究的模型，亦为RNAi技 术的应用研究拓展了新的思路。这一设想尚未见文献报道，如能证明其 合理有效，将成为难于鉴定表型且异常表达的基因功能研究的通用模 型，并在后续蛋白组学及基因相关药物的研发中发挥重要作用。 4) 将蛋白组学技术与基因功能研究结合起来，这在理论上可直接导致生物 学的新发现。 ：鉴于本领域面临的国际竞争，部分实验内容已开始进行， 经费拟先自筹预支。 2003. 3－2003.12 实验准备和前期实验。实现shRNA表达载体的构建， 如ZNF463、 ZNF313、znf313、EGFP、c-myc、Dsred2等PAVU6+27 或Lentivirus重组载体，初步转染/感染哺乳动物细胞，寻 求最佳实验（目前载体构建已完成）； 2004.1－2004.12 与Genesil公司合作，运用生物信息学及最新载体 构建技术实现 有效靶序列的筛选、靶位证实，构建znf230等在内的 Lentivirus 相关载体，生产病毒； 2005.1－2005.12 ES细胞的体外培养；Lentivirus病毒感染ES细胞； ES细胞体外定向分化模型的建立（可能与Weizmann 研 究所合作研究）； 2006.1－2007.6 圆形精细胞的分离、纯化，体外培养扩增，基因 表达谱芯片及二维电泳-质谱技术筛查基因及蛋白表达变 化；精子细胞的收集、分析鉴定； 2007.6－2007.12 总结分析实验结果，补充部分实验，撰写论文，申 请成果鉴定等。 1） 通过对znf230基因功能的研究，阐明其在精子发生中的作用及其作 用的阶段性。 2） 获得精子发生过程中znf230相关基因的表达、网络调控及其功能信 息，可望分离鉴定出有功能意义的蛋白。 3） 建立Lentivirus RNAi系统的精子发生相关基因功能研究技术平台， 为无精症病因学研究提供理论依据。 4） 出席国内外重要学术会议交流2-3次，在国外较高影响因子的SCI 杂志上发表相关研究论文2-4篇，可能申请专利1-2项。 1) 已具备本实验所需的包括HEK293、Cos、MCF-7、Hela、HepG2、k562等哺乳动物细胞株，具备RNAi研究用PAVU6＋27，Lentivirus及其包装载体(VSVG、RSV-REV、pMDLg/pRRE)，已获得供研究用的ES细胞株。RNAi实验工作已从2003年3月开始，目前已构建了靶向znf230、ZNF463、ZNF313、znf313等约15个PAVU6+27或Lentivirus重组载体，初步转染/感染哺乳动物细胞，取得了较好的实验效果，为本课题的进 一步深入开展积累了丰富的技术及方法学经验。 2) 申请人所在的人类疾病基因组学研究室是教育部人类疾病生物治疗重 点实验室及四川省疾病基因组学和法医学重点实验室的主要组成单位， 是全国几个医学遗传学博士点和博士后流动站之一。自90年代以来，在国家自然科学基金的资助下，从事多年的人类疾病基因组学，开展了 无精症相关基因的突变筛查与新基因的克隆，包括对人精蛋白基因的表 达和突变分析，DAZ基因的突变筛查，Y染色体微缺分析，并有多篇 相关论文发表。1999年以来，进行了深入的精子发生相关基因的克隆和 功能研究，已克隆4条人类基因、2条小鼠精子发生相关基因，初步研 究表明它们在精子发生的特定阶段起作用，发表论文数篇，包括在 Biochim Biophys Acta、Biochem J、Human Mol Reprod、Biochem Biophys Res Commun、Acta Biochimica et Biophysica Sinica等6篇SCI收录的论文，并申请了专利2项－新的人原发无精症相关锌指蛋白编码序列及制 法和用途；人受精促进肽基因TCP11编码序列及制法和用途。 3) 申请人所在实验室与以色列Weizmann科学研究所Groner 教授实验室 具有稳定合作关系，在本课题实施过程中可能派人员在该研究所进行部 分实验。此外，本课题组中多数成员参与了本室国家级课题的研究并已 获得医学遗传学硕士学位，有较扎实的理论和实验操作技能，并发表了 相应的科研论文（见参加人员简历），因此有能力完成本课题的研究。 4) 本室还与国外多个从事RNAi研究的实验室，包括美国哈佛大学麻省总 医院、美国MIT癌症研究中心Van Parijs实验室、瑞士Genev大学Didier TRONO实验室、加拿大密歇根大学David R. Englke实验室、美国哈佛 医学院神经疾病研究中心Anna M. Krichevsky实验室均有交流与稳定的 合作关系。此外在国内与人类基因组南北中心、上海第二医科大学、上 海与北京转基因实验动物基地、武汉Genesil公司均有稳定的合作关系。 1) 将利用所在“人类疾病生物治疗教育部重点实验室”的所有条件进行 研究。该实验室拥有精良、配套的设备，如DNA自动测序仪、荧光定 量PCR仪、流式细胞仪、哺乳动物细胞荧光显微注射系统、DHPLC WAVE系统、MALDI-TOF、2D-PAGE凝胶电泳系统、Confocal激光共 聚焦显微镜、Zeiss荧光显微镜、基因转移仪、多肽和DNA合成仪、病 毒生产3P实验室等在内的各种硬件均处于良好的工作状态。 2） 所在单位数十台计算机都通过局域网与Internet连接，都随时跟踪本课 题相关领域的国际发展动态。