肠致病性大肠杆菌和魏氏梭菌PCR诊断方法的建立

肠致病性大肠杆菌和魏氏梭菌PCR诊断的建立 肠致病性大肠杆菌和魏氏梭菌PCR诊断方 法的建立 第27卷第2期 2006年3月 家畜生态 ActaEcologiaeAnimalisDomastici Vol_27NO.2 Mar2OO6 肠致病性大肠杆菌和魏氏梭菌PCR诊断方法的建立 杨少华,王洪梅,高运东,柴同杰,仲跻峰 (1.山东省农业科学院奶牛研究中心,山东济南250100;2.山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018) [摘要]本研究建立了一种同时检测大肠杆菌和魏氏梭茵的二重PCR方法,根据兔肠致病 性大肠杆菌(REPEC)的eae毒力基因和魏氏梭茵的a—toxin毒力基因的基因文库,了两 对分别与eae基因和a,toxin基因互补的引物,用这两对引物对同一样品中的REPEC和魏 氏梭菌模板进行二重PCR扩增.结果均得到了两条特异性大小与试验设计相符的833bp (REPEC)和324bp(魏氏梭茵)的扩增条带,而对其它3种病原茵的PCR扩增结果均为阴性; 敏感性试验结果明,该二重PCR技术能检出1Ocfu的REPEC,10cfu的魏氏梭茵. [关键词]兔肠致病性大肠杆菌;魏氏梭茵;多重PCR [中图分类号]$811.5[文献标识码]A[文章编号]1004—5228(2006)02—0048—03 魏氏梭菌和肠致病性大肠杆菌是引起家兔特别 是幼兔腹泻的最主要的病原菌],目前对兔腹泻 病的诊断主要是依靠传统的细菌学诊断方法,即分 离培养和生化鉴定,再对疑似菌进行血清学检测,繁 琐费时,且阳性率低.而且由于各种细菌培养和鉴 定条件不同,分别检测的工作量很大,而分子杂交不 使用于临床应用,PCR技术提供了一种理想的检测 方法.目前已有各种腹泻病原菌PCR诊断的报道, 大多数单纯扩增的,繁琐浪费试剂,且增加了交叉污 染的机会L3].本研究建立了二重PCR方法,以同时 扩增导致兔腹泻的主要致病菌大肠杆菌和魏氏梭菌 两个标志性毒力基因,为快速准确诊断奠定了基础. 1材料和方法 1.1菌种 魏氏梭菌,大肠杆菌,沙门氏菌,葡萄球菌,肠球 菌菌株购自中国兽药监察所,魏氏梭菌LW 株,兔肠致病性大肠杆菌YT株由本室分离保存. 1.2引物设计 运用计算机DNAstar软件自行设计引物,兔肠 致病性大肠杆菌(REPEC)引物在LEE毒力岛eaeA 基因上],魏氏梭菌引物在a一毒素基因上],扩 [收稿日期] [基金项目] [作者简介] *[通讯作者] 增片段分别为833bp,324bp,由上海博亚生物技术 有限公司合成,引物序列见表1: 1.3模板DNA的制备 将细菌过夜振荡培养,取1mL细菌的过夜培 ,去上清,加 养物至离心管,12000r/min离心30秒 入i00L灭菌去离子水(或三蒸水或PCR缓冲液) 混匀,煮沸10min.12000r/min离心3O秒后,取上 清直接用于PCR扩增L7]. 1.4多重PCR扩增反应 本试验对二重PCR反应条件进行了优化,主要 包括引物浓度,dNTP的用量以及各循环参数等,反 应总体积为5OL. 1.5敏感性试验 将各参考菌株37?,18h振荡培养菌液进行倍 比稀释,分别对1CFU/mL,10CFU/mL到106 CFU/mL的不同稀释度的菌液按以上条件进行 PCR扩增,测定PCR反应的敏感性. 1.6特异性试验 把含有eae,a—toxin核酸模板的样品与其它对 照的沙门氏菌,肠球菌,金黄色葡萄球菌核酸样品分 别加到多重PCR反应体系中扩增,以检测其特 异性. 2005-05-08 山东省2001年重点攻关项目"集约化养兔腹泻症病因学研究"(Ol2010116)1. 杨少华(1979一),女,硕士,山东烟台人,从事动物疫病防治研究. 柴同杰,教授,博士生导师. 第2期杨少华等:肠致病性大肠杆菌和魏氏梭菌PCR诊断方法的建立49 1.7PCR产物的: 1.7.11的琼脂糖凝胶电泳取5L二重PCR 产物和1L加样缓冲液混合,在1.0的琼脂糖凝 胶上以90V恒压进行电泳,置数字图像分析仪上观 察拍照,以DL2000DNAMarker作分子量参照物, 分析记录结果. 1.7.2PCR扩增产物回收测序取大肠杆菌和魏 氏梭菌的二重PCR扩增产物进行双脱氧测序(由上 海博亚生物工程技术公司完成). 2结果 2.1二重PCR反应条件的优化结果 通过对eae和a—toxin两种引物浓度,及二重 PCR扩增的温度,时间,循环次数的优化,最后确定二 重PCR反应体系50L,反应条件的优化结果见下表 表2Multi—PCR反应条件的优化结果 Table2ReactionconditionofMulti—PCR 10uL 5uL 5uL eae1.4L Taq酶5U/~L 1× 0.25mmol/L eae0,7umol/L a--toxin2.0L 0.3L 二重PCR的最佳反应模式为:94?预变性 5rain,然后94?变性30sec,57?退火30sec,72?延 伸1min,30个循环后于72?反应10rain. 2.2二重PCR扩增结果 PCR扩增后针对REPECeae基因的扩增产物 为833bp,针对魏氏梭菌d—toxin基因的扩增产物 为324bp.eae阳性,a—toxin阳性,eae与a—toxin 同时阳性的检测结果见图1. 2.3敏感性试验结果 在引物浓度分别为eae0.7p.mol,a—toxin1 0~mol时,该多重PCR能同时检测到10cfu的RE PEC,lOcfu的魏氏梭菌的核酸模板结果见图2. 2.4二重PCR特异性扩增结果 将REPEC和魏氏梭菌的DNA分别进行PCR 扩增,结果含有REPEC,魏氏梭菌的核酸样品均能 扩增出与试验设计大小相符的833bp,234bp两条 明亮条带,而对沙门氏菌,肠球菌,金黄色葡萄球菌 对照株的DNA却扩增不出任何条带,结果见图3. l234567 图1二重PCR扩增结果 Figure,1Amplificationresultofmulti,PCR 1.DL2000Marker(uptOdown1O0,250,500, 750,1000,2000);2.eaegeneandq—toxingene positive;3,6.onlya—toxingenepositive;4,5.eae genepositive:7.blankcontrol 薰 图2敏感性试验结果 Fig.2Resultofmulti—PCRsensitivitytest 1.DL2000Marker2,104cfu/t~L3.103cfu/~tL 4.102cfu/t~L5.10cfu/t~L6.1cfu/t~L7.blankcontrol 图3二重PCR特异性扩增结果 Fig3Specificitytestofmulti—PCR 1.DL2000Marker2.samplecontainREPECandclos— tridiumperfringen3.salmonella4.enterococcus5.staphylo— COCCUSaureus.6.blankcontrol 眦Lh一一,?虮m板物眦模引ld 50家畜生态第27卷 2.5二重PCR产物回收测序结果 取二重PCR扩增产物进行测序,结果eae基因 PCR产物833bp测通了一端,为618bp,与genebank中 查到的U59503菌株序列完全相同,a--toxinPCR产物 324bp与genebank中所查序列也完全吻合. ^,t,^ 习 3.1国外流行病学调查表明携LEE毒力岛的兔肠 致病性大肠杆菌(REPEC)很普遍. 巴西Penteado,Ugrinovich等(2002)对从健康 和腹泻兔中分离的178株大肠杆菌进行了毒力基因 地检测和血清型的鉴定,结果发现所有的分离株都 不含编码肠毒素ST,LT,志贺样毒素Stxl,Stx2,和 溶血素hly的基因,9O株(50.6%)含有eaeA基因, 其中74株eaeA阳性的大肠杆菌是从腹泻兔中分离 的,结果表明携带eaeA基因的EPEC是引起巴西 家兔腹泻的主要原因.西班牙Blanco等(1997)研 究了携带eaeA的EPEC在腹泻兔中的流行情况, 结果发现74(60/81)的腹泻兔检出eaeA+的 EPEC.潘劲草等(2001)对大肠埃希菌LEE毒力岛 的临床流行病学也进行过调查.eaeA基因为LEE 毒力岛上的标志基因,编码一种称为紧密素的细菌 外膜蛋白,介导细菌与肠道上皮细胞的紧密粘附,因 此本研究选择了LEE毒力岛eae基因作为PCR扩 增靶基因. 3.2本试验所建立的多重PCR对分离到的4株不 同REPEC的,3株不同魏氏梭菌的菌株进行了多重 PCR检测. 结果均同时得到了与试验设计大小相符的两条 分别为833bp(REPEC)324bp(魏氏梭菌)的扩增带, 而对其它对照病原菌的扩增结果均为阴性,说明本试 验所建立的多重PCR是成功的,并具有良好特异性. 3.3敏感性试验结果表明,该多重PCR最低能同 时检测到10cfu的REPEC和10cfu魏氏梭菌. 由此可见,该多重PCR仍不失为一种高灵敏度 的病原诊断方法,可以用于临床的检测.利用多重 PCR一次可以扩增多个目的基因特点,一次PCR 反应就可以检测两种病原菌,这在临床应用中,对检 测不同病原体感染,特别是在两种病原体混合感染 的鉴别诊断上,具有十分重要实用价值和实践意义. 参考文献: [1]王云峰,王翠兰,崔尚金.兔致病性大肠杆菌生物学特性的研究 EJ].中国预防兽医,1999,21(5):354—355. 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AMultiplexPCRforDetectionofRabbitEPECandClostridiumPerfringen YANGShao—hua,WANGHong—mei,GANGyun—Dong,CHAITong—jieZHONGJi —feng (1.MilkCowResearchCentertShangdongAcademyofAgriculturalSciencestJinan250100 2.ShandongAgricultureUniversity,Taian271018) Abstract:Amultiplexpolymerasechainreactionwasoptimizedtosimultaneouslydetecttwotoxinal geneofREPECandclostridiumperfringeninthisresearch.Twosetsofspecificprimersweredesignedac— cordingtOthesequencesofeaeanda— toxingeneinthegenebank.Itshowedthatallsampleswhichcon— tainedeaeanda— toxincouldbeamplifiedbythemultiplexPCRwiththesetwosetsprimers,yieldingtwo specificbandsoftoxingeneofREPEC833bpandclostridiuma— toxin324bp.Butnospecificbandwas amplifiedfromthreeotherbacteria.Aslittleas10cfuofREPEC,10cfuofclostridiumperfringenwerede— tectedbyelectrophoresisinthismultiplexPCR. Keywords:REPEC;clostridiumperfringen;MultiplexPCR