为了正常的体验网站,请在浏览器设置里面开启Javascript功能!

人体内源性抗衰老物质2,3--吲哚醌检测研究(可编辑)

2017-12-20 25页 doc 52KB 32阅读

用户头像

is_597436

暂无简介

举报
人体内源性抗衰老物质2,3--吲哚醌检测研究(可编辑)人体内源性抗衰老物质2,3--吲哚醌检测研究(可编辑) 摘 要 目的建立人体液中2,3一吲哚醌的分析检测方法,研究健康人唾液和尿液中2,3一 吲哚醌的浓度与血液中浓度的相关性。 方法 1.基于2,3一吲哚醌对光泽精电化学发光的增强作用,建立了电化学发光法测定 2,3一吲哚醌浓度。高效液相色谱仪二极管阵列检测器检测人尿液中2,3一吲哚醌 含量。 2.收集健康人血液、尿液和唾液样本,高效液相法测定各样本中2,3-1哼1哚醌浓度。 经相关分析,研究唾液和血液、血液和尿液间2,3一吲哚醌浓度的相关性。 结果 1....
人体内源性抗衰老物质2,3--吲哚醌检测研究(可编辑)
人体内源性抗衰老物质2,3--吲哚醌检测研究(可编辑) 摘 要 目的建立人体液中2,3一吲哚醌的分析检测方法,研究健康人唾液和尿液中2,3一 吲哚醌的浓度与血液中浓度的相关性。 方法 1.基于2,3一吲哚醌对光泽精电化学发光的增强作用,建立了电化学发光法测定 2,3一吲哚醌浓度。高效液相色谱仪二极管阵列检测器检测人尿液中2,3一吲哚醌 含量。 2.收集健康人血液、尿液和唾液样本,高效液相法测定各样本中2,3-1哼1哚醌浓度。 经相关分析,研究唾液和血液、血液和尿液间2,3一吲哚醌浓度的相关性。 结果 1. 电化学发光法测定人尿液中2,3一吲哚醌,线性范围为0.009~2.0lag?mL一。高 效液相色谱法测定人尿液中2,3一吲哚醌,线性范围为0.035---10.0lag?mL~。 2.唾液和血液2,3~吲哚醌浓度有相关性,相关性系数rO.9176。尿液与血液2,3一 吲哚醌浓度也存在相关性,相关性系数rO.7774。 结论 1.高效液相法测定2,3一吲哚醌含量,线性范围广,适于批量在线分析检测人体液 中2,3一吲哚醌的含量。 2.唾液与血液中2,3-1垮1哚醌的浓度有显著的相关性,可望代替血样用于临床检测 2,3一吲哚醌的含量。 硕士研究生倪倍倍药理学 导师 岳旺教授 关键词:2,3-11弓1哚醌:电化学发光;高效液相:唾液 objective Abstract Toesestablisha lmethodt measuretheconcentrationofisatini humanbodyfluids andtostudytheirrelativityamongplasma,urineandsaliva. Methods l BasedonthenhancedECLintensityonlucigenintoestablishanelectrogenerated chemiluminescenceECLmethodforthethedeterminationofur neconcentrationof isatin.Tomesuremeasuretheconcentrationofisatinbyhighperformanceliquid chromatography. 2 jTocollecthealthyhumanblood,urineandsalivasamples,thendetcrminbyHPLCto studyt11eirrelativity. Results 1 ECLisproportionalt theconcentrationofisatinovcrtherangeof0.009.2.0 ‘。pg。mL-1,whilethelinearrangeforHPLCis0.035?10.0lag?mL~. 2 Thecorrelationcocfficientoftheconcentrationofisatinofhumansalivaandplasma ’、. is0.9176,while也ecorrelationcoe佑cientoftheconcentrationofisatinofhuman 、 urineandplasmaisO.7774. Conclusions ’ l HPLCissuitablefortheanalysisof atininhumanbodyfluidsforitswidelinear range? 2 Therelativityoftheconcentrationofisatinofhumansalivaandplasmaisgood. Salivaisexpectedtoreplacethbloodusedforelinicaldetectionofsatin. Postgraduatestudent:PharmacologyNiBeibel DirectedbyProfessor:WangYue Keywords:lsatin;ECL;HPLC;saHva 目 录 引 言..?........?...??.?.....1 第一章2,3-砸Jl哚醌检测方法研究..?...?..?.....3 第一节体液中2,3-N哚醌检测电化学发光法的建立??.?.....3 1.1前言...?..?.?...?....3 1.2实验部分??.?.?.?.??.....3 1.3实验结果?....?..4 第二节高效液相色谱法测定2,3-N哚醌的方法建立??.??.8 2.1实验部分?.??.?..?..8 2.2实验结果....?..?9 2.3讨论??...?...?.....?....?11 2.4体液中2,3-n;l哚醌检测方法的选择??..11 第二章人体血液、尿液和唾液中2,3一吲哚醌浓度相关性研究..??.??13 3.1实验部分?.....?....??...?...?.?.13 3.2实验结果?..?.....?....?..?.13 3.3讨论...?....?..?.?..15 3.4结论?....?.??.......?..?.16 参考文献??..?.?...?17 综述.?.....?.??.??.?......??..2l 综述的参考文献?.?..?....?..??.......?.33 攻读学位期间的研究成果??.?..?....??...?..?..?..?37 附 录.......?.....?......?.....?...?.38 致 谢...?..?..........?.....?...?..............?..?40 学位论文独创性声明?....?..........??...?.?..?.41 引言 人体内源性抗衰老物质2.3一吲哚醌的检测研究 引 言 2,3-?gl哚醌又名吲哚一2,3一二酮indole一2,3-dione,ISA,系天然存在于自然 界的吲哚类化合物,也存在与某些植物和人体内,是从寄生在海洋生物龙虾体内的 一种微生物Alteromonassp.中分离的一种活性物质,是维持龙虾生存的必需物 质?,也是著名中药板蓝根、大青叶和青黛的有效成分之一瞄3。 2,3-g;]哚醌在人体内具有广泛的生物活性。2,3-n弓l哚醌能对抗焦虑臼1,实验证 实,大鼠腹腔注射2,3-g;]哚醌2h后,纹状体中乙酰胆碱Ach和多巴胺DA 的水平显著升高,可能通过增加DA的浓度来调节Ach的水平,同时可提高脑内5一 羟色胺5-HT等神经递质水平H1。另有研究表明2,3-n;l哚醌可能是5-HT。受体激 动剂哺1,其抗焦虑活性可被5-HT。受体拮抗剂阻断?1。2,3一吲哚醌可调节利钠肽包括 心房利钠肽ANP、脑利钠肽BNP、C一型利钠肽CNP口1等。心房利钠肽ANP是 一种具有强大利钠,利尿,扩血管和交感,肾素,醛固酮抑制活性的肽类激素,并 参与水,电解质平衡和血压调节。Telegdy旧1等研究证明2,3-ggl哚醌可在活体内抑制 ANP、BNP和CNP的作用。2,3一吲哚醌可强烈抑制心房利钠肽ANP与相应受体的 结合,减弱大鼠脑,心脏和肾中ANP激动的鸟苷酸环化酶活性阳1。有研究表明,2,3一 吲哚醌的抗氧化活性可能与其拮抗ANP的活性有关n们。在大量的实验中,发现2。3一 吲哚醌有抗惊厥作用n?和降低慢波睡眠的作用[12]o李丰桥n33等已证实2,3一吲哚醌 可抑制大鼠杏仁核点燃,提高惊厥阈值。同时,2,3一吲哚醌具有抗衰老和降血脂作 用?引,对防治动脉粥样硬化,维护脑血管正常功能有一定作用。本课组对2,3一吲 哚醌进行初步研究,已证实2,3一吲哚醌具有抗氧化应激n引、抗衰老?引、抗癌n"、抗 动脉粥样硬化n引、抗病毒n钔和抗抑郁作用啪3并已授权相关专利6项幢卜矧。 2,3-nil哚醌是组织中多种酶如酸性磷酸酶心71、碱性磷酸酶幢耵、透明质酸酶啪】、 黄嘌呤氧化酶m1等的抑制剂。其中最重要的是2,3-uJl哚醌被证实是一种人体内源性 单胺氧化酶BMAO?B抑制剂??,其存在于正常人组织和体液中呤引。MAO-B是一种广 泛存在于人和动物机体内参与胺类代谢的主要酶类。MAO?B的活性变化与机体衰老有 密切关系,被认为是一种衰老酶。45岁后,人脑中MAO?B的活性随增龄而急剧,引 起脑组织儿茶酚胺代谢紊乱,致使神经系统和心血管系统等出现异常,以致老年性 疾病的发生呤羽。老年性疾病发生时,体液中MAO-B活性升高,其拮抗MAO-B的物质, 11P2,3-ngl哚醌,含量代偿性升高,所以通过测定人类体液中2,3-n弓l哚醌含量,有可 能对老年性疾病的发生、发展的预测有意义。 本世纪已进入老年社会,衰老性疾病如帕金森氏病、老年痴呆、癌症、动脉粥 样硬化等的防治及早期诊断显得极为重要。帕金森氏病人尿液中2,3-nil哚醌浓度随 青岛大学硕士学位论文 疾病严重程度依帕金森氏病HoehnandYahr分级而升高m1。暗示体液中2,3一 吲哚醌浓度可作为临床诊断PD严重程度的标志物。研究表明,癌症患者血清MAO 活性显著高于正常人口51,而2,3一吲哚醌作为内源性MAO-B抑制剂可能代偿性升高。 实验证实各系统癌症患者尿液中2,3一吲哚醌的含量明显高于健康人,表明尿液中2, 3一吲哚醌是与多种恶性肿瘤相关的标志物,可能为癌症早期诊断、发展及预后的判 断指标m’。故2,3一吲哚醌是多种老年性疾病的标志物,监测其体液中含量变化为老 年性疾病的早期预防,早期诊断具有重要意义。 最早是用戴维斯测试法从人的尿液中用纸色谱分离二羟吲哚和2,3一吲哚醌。其 他有单扫描极谱法LSV及循环伏安法CV呤刀。而使用高效液相色谱法测定体液中 2,3一吲哚醌含量的报道较多,有高效液相一紫外检测器HPLC-UV啪1、高效液相一 电化学检测器HPLC?ED啪1、高效液相一荧光检测器HPLC-FLm3,液相色谱一质 谱联用LC?MSH?、液相色谱电喷离子化串联质谱LC/ESI-MSH23等。建立快速、 灵敏、高效、低成本的检测方法,有利于临床推广。同时测定唾液与血液,血液与 尿液中2,3一吲哚醌浓度的相关性,为临床选择合适的生物检测样本提供理论依据。 2 第一章 第~章2,3一吲哚醌检测方法研究 第一节体液中2.3一吲哚醌检测电化学发光法的建立 1.1前言 电化学发光E1ectrogeneratedch miluminescence,ECL是指利用电压在电 极上将某组分氧化或还原,使电极反应产物与溶液中组分或电极反应产物之间进行 化学反应而产生的光辐射H引。依据其发光强度进行分析的方法即电化学发光法。该 方法操作简单,易于控制,线性范围宽,尤其是电化学发光在免疫分析方面具优势, 近年来已引起人们的研究兴趣。电化学发光分析可广泛应用于临床、环境和食品等 方面H钔。本文拟采用电化学发光分析法对2,3一吲哚醌进行浓度测定。 1.2实验部分 1.2.1仪器与试剂 MPI?B型多参数化学分析测试系统西安瑞迈分析仪器有限公司:DHG一9053A 型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司;saitorius电子天平北京 赛多利斯仪器系统有限公司;CHl830B电化学工作站上海辰华仪器有限公司;三 电极系统:铂电极PT,直径1.0姗为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,铂丝 电极为辅助电极;pHS一3C型精密pH计上海三信仪表厂:BRANSONIC200超声清 洗仪德国BRANSONULTRASCHALL公司:电热恒温水浴锅天津市泰斯特仪器有限公 司;离心机上海安亭科学仪器。 2,3一吲哚醌isatin,ISA,武汉盛世精细化学品有限公司,光泽精1ucigenin, LG,日本东京仁成工业株式会社,0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液PBS由KH。P0.和K。HPO. 配制。试剂均为分析纯,实验用水为超纯水17MQcm。 光泽精储备液1.0×10。4mol/L配制:准确称取5.img光泽精,水定容至lOOmL 棕色容量瓶中,4"C保存。使用时用缓冲溶液稀释至所需浓度。 2,3一吲哚醌储备液1.0x10。49/mL配制:准确称取10mg2,3一吲哚醌,加入 少许水,使用恒温水浴锅加热至完全溶解,冷却后转入100mk棕色容量瓶中,4"C 保存。使用时用缓冲溶液稀释至所需浓度。 1.2.2实验方法 铂电极的处理:将铂电极PT依次用金相砂纸,O.1um和0.05umA1:0。抛 光至镜面,然后分别在3mol/L硝酸、无水乙醇和二次蒸馏水中超声清洗。使用采用 三电极系统,PT为工作电极,Ag/AgCI电极为参比电极,铂丝电极为对电极,在铁氰 化钾体系0.5mol/LFeCN。3‘/FeCN64-的中性水溶液中,进行循环伏安扫描,若 3 青岛大学硕士学位论文 氧化还原电位差小于1V,则可用。再在0.1mol/L硫酸溶液中从一0.2。+1.20vN lOOmV/s速率扫描5min。之后用水冲洗,干燥备用。 电化学发光的测量:准确移取1.5mL1.0×10叫mol/L的光泽精溶液和250uL一 定浓度的2,3一吲哚醌溶液于25mL棕色容量瓶中,用0.02mol/LPBS溶液定容。吸取 2.OmL所配制溶液于ECL电解池中。使用线性扫描法进行还原扫描,测定ECL强度。扫 描电位范围O~一1V,扫描速率0.05V/s,高压800V,采样速率lOT/s。同法做空白试 验。?,吐一厶厶是未加入2,3一吲哚醌时光泽精的空白电化学发光值;五是加入2,3一 吲哚醌后的电化学发光值。 。 尿液样本的处理:取健康志愿者晨尿中段尿,3000r/min,离心10min,取上清 液2mL,N2气流吹干后,残渣中加入120uL1.O×10。4mol/L的光泽精溶液和1.88IIlL 0.02mol/LPBS,测定电化学发光值。 1.3实验结果 1.3.1实验条件的优化 1.3.1.1光泽精浓度的选择 1 1 童?1 量 .暑 8 ? 0 2 4 6 8 10 C??n昀由nofk蛔掣面脚?l,L 图1.1光泽精浓度对吲哚醌一光泽精电化学发光强度的影响 ISA:L0×10。59/mL 图1.1为光泽精浓度对2,3一吲哚醌一光泽精电化学发光强度的影响曲线图。由图 中看出,光泽精浓度1.0"-10.0llmol/L范围内,电化学发光增强。当光泽精浓度为 6.0X10喝mol/L时,ECL基本达到最大。当光泽精浓度超过6.0×10。6mol/L时,ECL增 强不明显。因此,在实验中选择光泽精浓度为6.O×10‘6mol/L。 4 ???????0 4 2 O 8 6 4 2 第一章 1.3.1.2PH值的选择 1400 h3200 专1000 葛800 .三 600 8 400 ‘口200 0 8 8.5 9 图1.2PH值对2,3一吲哚醌一光泽精电化学发光强度的影响 ISA:1.0×10一g/mLlucigenin:6.OX10?6mol/L 图1.2为PH值对2,3-ngl哚醌一光泽精电化学发光强度的影响曲线图。从图中可以 看出,随着PH值的增大,2,3一吲哚醌一光泽精电化学发光强度增大。但是随着PH值 的增大,背景发光值也增大。故实验中选择PH8。 1.3.1.3缓冲溶液浓度的选择 实验察了不同缓冲溶液如:0.01mol/L硼砂溶液,KH。PO广KzHPO。溶液,KH:PO.一 Na0H溶液。发现在KH:P0.一K:HP0。溶液中吲哚醌一光泽精电化学发光强度最大,故实验 中选择KHzP0。一K。HPO。溶液作为缓冲溶液,并加入KCI作为支持电解质。PBS的浓度可 对2,3一吲哚醌一光泽精的电化学发光产生影响。具体如图1.3所示。 0.02 0.04 0.06 0.08 Co?a由抽nofPBSmol/L 图1.3PBS浓度对2,3一吲哚醌一光泽精电化学发光强度的影响 ISA:1.OX10一g/mLlucigenin:6.OX10?6mol/L 5 ???????0 弱;;龉?墙m嗣 后?量II!,lU? ?? 壹鱼丕堂堡主堂垡迨銮 1.3.2 ,3一吲哚醌一光泽精电化学发光的可能机制 化 掌 发 光 Time/S 图1.4光泽精及2,3一吲哚醌一光泽精的化学发光图 a:6.0X10-6mol/Lucigeninb:6.0x10?6mol/Lucigenin+1.0X10qg/mkISA Potential/、? 图1.5 2,3一吲哚醌和光泽精的循环伏图 a:空白对照0.1mol/LKCIb:2,3一吲哚醌1.0X10~g/mLc:光泽精1.0×10。‘mol/L 图1.4为光泽精3c力nA,2,3一吲哚醌后的电化学发光图谱。由图1.4可看出 6 研蛳何斯暑i新拼懈懈盯耵 以岬。一\:一o.I.一声v 第一章 2,3一吲哚醌可显著增强光泽精的化学发光强度。图1.5为2,3一吲哚醌和光泽精的循环 伏安图。由2,3一吲哚醌和光泽精在O.10mol/LKCl溶液中铂电极上的循环伏安图, 发现2,3-n弓l哚醌在-0.58V上有一还原峰,但无相应的氧化峰。光泽精在一O.3V附近有 一还原峰。说明电位负于一0.58V时,两者都可被还原。那么2,3一吲哚醌与光泽精的 电化学发光可能的反应机理为:电位负于-0.58V时,2,3一吲哚醌和光泽精都被还原, 2,3一吲哚醌被还原后可能产生负氧离子,负氧离子与还原态的光泽精反应产生电化 学发光。这与漆红兰等??的报道基本一致。 1.3.32,3一吲哚醌.光泽精电化学发光的应用 1.3.3.1重现性试验 按2.1优化的实验条件,配制1.0×10咱g/mL的2,3-n弓l哚醌标准溶液,连续6 次测量,其标准偏差为2.4%。 1.3.3.2线性范围及相关系数 2,3一吲哚醌浓度在9.0×10呻~2.0×10吨g/mL范围内与光泽精电化学发光增强值 呈线性。线性方程为?I29.033c+172.83?,是2,3-n9l哚醌对光泽精电化学发光 的增强值,C为2,3一吲哚醌浓度,相关系数rO.9936,检测限为2.1X10。99/mL。 1.3.3.3实际样品检测及回收率结果 为了研究方法的准确度,采用标准加入法考察方法的回收率。按上述1.3.1优 化条件测定处理过的尿液中2,3一吲哚醌的本底含量,之后加入标准品测定电化学发 光值,具体结果如表1.1所示。测得回收率在81.7~110.1%。 表1.1 实际样品测定及回收率实验结果 7 青岛大学硕士学位论文 第二节 高效液相色谱法测定2.3一吲哚醌的方法建立 2.1实验部分 2.1.1仪器与试剂 2.1.1.1仪器 LC-20T型高效液相色谱仪日本SHIMADZUCorporation;SPD-M20A型二极 管阵列检测器日本SHIMADZUCorporation;超纯水制备仪法国Millipore; Xw一80A型涡旋混合仪海门市其林贝尔仪器制造有限公司;TDL80-2B型离心机上 海安亭科学仪器;SK3200H型超声波清洗机上海科导仪器厂;HP-OI型无油真空 泵天津市恒奥科技发展有限公司;pHS-3C型精密pH计上海三信仪表厂。 2.1.1.2试剂 2,3一吲哚醌isatin,ISA,武汉盛世精细化学品有限公司,分析纯;乙腈美 国Tedia公司,HPLC级:乙酸乙酯天津市科密欧化学试剂有限公司:盐酸莱 阳经济技术开发区精细化工有限公司,分析纯。 2.1.2样本处理 取健康人清晨中段尿1m1,加5mol/L盐酸Iml,涡旋振荡2min,加入3ml乙 酸乙酯,混悬震荡2min,于离心机中以3000r/min离心15min。吸取上层乙 酸乙酯层。剩余液再加入加入3ml乙酸乙酯,重复上述步骤。两次提取液合并, 在37?水浴下氮气吹干。吹干后的残渣加入1mol/L盐酸200uL溶解,取10|JL 进样。色谱条件:C18-色谱柱5um,4.6×150mm:流动相为乙腈一O.Olmol/L的 磷酸盐缓冲液20:80,PH7.0,流速为lml/min,检测波长为242nm。柱温28?。 2.1.3标准曲线的制各 精密称取2,3一吲哚醌10mg,置于100mL容量瓶中,加入少量乙腈溶解后,用 蒸馏水稀释至刻廖,制得标准储备液,置于4?冰箱中保存。精密量取取一定量标 准储备液,配制一系列浓度为10.oopg?IIIL~,5.oo“g?IIlL~,2.50pg.mL-I,1.25 pg?mL~,0.625岖?mL一,0.313岖?mL.I’0.156pg?mL_的标准溶液,O.45岬膜滤过后, 按2.1.2中所述的色谱条件迸样测定,微量注射器吸取10汕进样,HPLC分析, 如图1,采用归一化法计算峰面积A。采用外标法,以峰面积A为纵坐标,对照品进 样量C为纵坐标,绘制出标准曲线。 2.1.4精密度的测定 配制浓度为1.25?g?mL~,0.625p.g?mL一,0.313pg?mL‘1的2,3-n弓l哚醌,每个浓度 8 第一章 每天测量6次,连续测定3天,计算日内精密度和日间精密度。 2.1.5回收率的测定 为了研究方法的准确度,采用标准加入法考察方法的回收率。按上述色谱条件 测定处理过的尿液中2,3一吲哚醌的本底含量,之后加入标准品测定。 2.2实验结果 2.2.1回归方程 以2,3一吲哚醌的峰面积对浓度计算直线的回归方程为:A86.834c-378.89,相 关系数rO.9998。结果表明,2,3一吲哚醌浓度在0.035一--i0pg?mL。1范围内,峰面 积与其浓度的线性关系良好,最低检测限0.015“g?mE~。 uV ; j ^ / f 0。0 2.5 G.0 7.5 PDA多色谱图/242nm4nm 图1.62,3一吲哚醌标准溶液色谱图 2,3一吲哚醌浓度为0.625“g?mL~,进样量lOuL 9 10.0 rain ??. 童鱼盔堂堡主堂垡丝銮 1000000 900000 B00000 700000 600000 500000 400000 30?00 200000 1?000 0 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 2,3-吲哚醌浓度ug.L1 图1.72,3一吲哚醌标准曲线 2.2.2精密度的测定结果 三种浓度的2,3一吲哚醌每日测定6次的13内变异系数RSD为2.6~6.7%, 连续测定三天的日间变异系数为3.O~5.4%,详细结果见表I.2。 表1.2精密度测定结果n6 。'___?:。。。。。。。。。。。。’’。。。。。。。。。。。。。。_?l-I___?_?l_I-l_l___??-??l__ll__?l_一一__-标准液 n 日 内 日 间 一 浓度 1ag?mL一1 测定值 RSD 测定值 RSD pg‘mL~,孑?sx%pg?mL~,孑?Sx% 1.25 6 1.293-4-0.0352.6 0.128?0.0393.0 0.625 6 0.607?0.0325.3 0.630?0.0223.4 0.313 6 0.307?0.0216.7 0.314?0.0175.4 2.2.3回收率的测定结果 采用标准加入法测得的回收率结果在82.9~113:i%之间,详细结果见表1.3。 表1.3实际样品测定及回收率实验结果n6 _-'??!?___,,_,-?_!,__?___?__!,__??_?__?__?___-___?__?___一 被测 样品含量加入量 测得值 回收率与标 组分 /pg /pg /“g 准偏差/% 3.O 6.3 6.2 6.2 6.5 6.7 6.3 98.9_-4-6.0 ISA 3.4 4.0 7.5 7.3 7.2 7.8 8.1 7.6 105.5?7.6 6.0 9.5 g.7 9.6 9.5 9.4 9.3 101.7?2.5 ^n筇陋奎 第一章 2.3讨论 本研究通过反复试验证明,流动相乙腈一0.Olmol/L的磷酸盐缓冲液PH7.0 体积比为20:80时,人尿液中的其他物质与2,3一吲哚醌能得到较好的分离。在此色 谱条件下,不需要加入硫酸一卜辛酯一卜钠盐m1,未发现拖尾现象,如图3所示。国 外采用HPLC?UV,一般采用两步纯化法n",测定尿液中2,3一吲哚醌含量,操作繁琐, 而采用GC?MSm1,仪器昂贵。而我们采用二极管阵列检测器HPLC-PDA,操作简 便,精密度和回收率均较满意,能用于测定人尿液中2,3-n弓l哚醌的测定,且能取得 较理想的效果。 PDA多色谱图/242nm4nm 图1.8尿样提取物色谱图 Fingerl.8Chromatogramofurineextract 2.4体液中2,3一吲哚醌检测方法的选择 第一章中电化学发光法测人尿液中2,3一吲哚醌,虽然灵敏度高,但是相对于高 效液相色谱法来说,线性范围稍窄,目前电化学发光法检测2,3一吲哚醌浓度含量尚 只能手工进样,而高效液相色谱法能自动进样,如针对临床大批量样本分析更有优 势。人尿液中2,3一吲哚醌平均含量在7.0“g?mL一,应用电化学发光法检测时,须 对尿样稀释,较为繁琐。 实验中高效液相法灵敏度及选择性均满足要求,故最终选择高效液相色谱法测 定人类体液中2,3-g罗l哚醌含量。 本文虽最终选择高效液相色谱法检测人类体液中内源性活性物质2。3-a;l哚醌的 含量,建立电化学发光法的意义在于为2,3一吲哚醌的电化学免疫分析法提供参考。 电化学发光免疫分析技术ECLIA是目前最先进的免疫测定分析技术,它非常 】】 青岛大学硕士学位论文 适用于少量样品的分析,不容易受生物样品中常遇到的浑浊,溶血等的干扰,且容 易实现自动化。因而可能成为检测各种激素,抗体,药物,微生物的理想选择,成 为极有前途的临床检测方法。甚至有望在此基础上开发出微型电化学传感器,实现 个人、家庭和现场检测,为人类早期预防诊断老年性疾病提供新思路。 12 第二章 第二章人体血液、尿液和唾液中2,3-N哚醌浓度相关性研究 3.1实验部分 3.1.1样品采集 健康自愿者6名,年龄24~27周岁,一周内未服用任何药物。血样的采集统一 肘部浅静脉取血3ml,3000r.min。1离一C..,10分钟,取血浆密封冷冻保存;尿液样品的 采集:取清晨中段尿1ml。唾液样品的取样方法:取样前彻底漱口,取样时舌尖抵 住上颚,让唾液缓慢留下。采集后立即测量其除去泡沫部分的体积,以3000r.min。1 离一C.,10分钟,去上清液密封保存。 3.1.2样本处理 血浆、中段尿和唾液上清液的处理方法见2.1.2样本处理。 3.1.32,3-N哚醌的测定 见2.1实验部分。 3.1.4统计方法 2,3一吲哚醌浓度结果用工?裱示,采用t检验,检验水准P0.5。对血液浓度、 尿液浓度和唾液浓度进行回归分析。 3.2实验结果 3.2.1唾液、尿液与血液2,3一吲哚醌浓度比值 表3.1正常人唾液和血液中2。3一吲哚醌的浓度比值 13 青岛大学硕士学位论文 表3-2正常人尿液和血液中2,3一吲哚醌的浓度比值 3.2.2 ,3一吲哚醌唾液和血液及尿液和血液浓度相关性 相关性检验:根据表3一l结果画散点图,以血药浓度X为横坐标,唾液浓度为Y, 做线性回归,回归方程为y1.4337x+0.0214,相关系数rO.9176,PO.01,经相关 性检验,相关系数有显著的统计学意义。同理,根据表3-2结果画散点图,以血药 浓度X为横坐标,尿液浓度为Y,做线性回归,回归方程为Y75.78X+I.3754,相关系 数rO.7774,P0.05,经相关性检验,相关系数有统计学意义。综上所述,2,3一吲 哚醌在唾液中的浓度与血浆中的浓度呈显著正相关,尿液中2,3-"弓1哚醌的浓度与血 液中有正相关。 唾 液 ISA 浓 度 pg?mL.1 O O.01 O.02 0.03 0.04 O.05 0.06 0.07 血液ISA浓度“g?mLl 图3-1健康人血液和唾液中ISA浓度相关性n6 14 化 J鸺?舛吆O m 0 仉 吼 仉 m 第二章 0 0.02 0.04 0.06 0.08 血液ISA浓度“g?mLq 图3.2健康人尿液和唾液中ISA浓度相关性n6 3.3讨论 唾液是由腺体分泌的一种蛋白含量极低的液体。唾液的产生经历两个阶段:首 先由血浆成分经毛细血管壁和组织间液进入腺泡细胞,与腺细胞内合成的蛋白质、 糖类等物质及水分同时向中央的泡腔排放,这时的液体称原唾液,其离子浓度与血 浆基本相同。其次,水分和电解质离子经过分泌与再吸收,产生低渗性的溶液排入 口腔内,形成唾液H明。唾液与血浆药物浓度比saliva/plasma简称S/P。唾液药 物浓度影响因素有药物的脂溶性、分子量、分子结构、电离度及唾液PH等多方面m1。 用唾液作为检测样品的优点是:样品容易获得:取样无伤害性;取样不受地点时间 限制;可短时间内重复取样:患者容易接受,依从性提高。许多药品在血液和唾液 中的浓度有相关性,可以考虑采用唾液检测来代替血液测定。 l唾液的收集: ‘ 唾液的收集方法可分为自然取样法和刺激法: 1自然取样法:在安静状态下,不给予任何刺激,唾液直接流入容器内。自然取 样法又分为滴取法,吐取法和棉棒法。滴取法是使唾液沿下唇逐渐滴入容器中。吐 取法是指使唾液在口底聚集,受试者每隔60s将其吐入容器中。吐取法的一个缺点 是所收集的唾液样本中细菌含量比滴取法要多十几种,这有可能影响唾液的储存和 样品的测定九。棉棒法指将大小适中的棉棒放入口腔中央轻轻咀嚼2min左右,然后 将棉棒放入玻璃容器中,通过无针头的注射器将唾液收集。自然采集法采集速度较 15 尿 液 吼 浓 度 旧‖ n 青岛大学硕士学位论文 慢,流速约0.05ml/min左右,采集时间大约需要10分钟。 2刺激法:可分为化学刺激法和物理刺激法。化学刺激法广泛应用柠檬酸或维生 素C等,物理刺激法采用嚼石蜡片、小块聚四氟乙烯或纱布球等刺激腺体分泌。化 学刺激法可短时间内收集到大量唾液,但刺激使流量增加,影响唾液PH值,使唾液 药物浓度降低m3。 本实验中采用滴取法收集健康志愿者唾液,取样时间为lOmin。这样避免了物 理或化学刺激造成的2,3一吲哚醌浓度改变。 2唾液中药物的浓度 在人体内,内源性活性物质2,3-gg[哚醌的分泌可随年龄增长而增加?羽。为避开 年龄影响,实验中健康志愿者的年龄选择在24-27周岁。从表3-1可以看出,正常 人唾液和血液中2,3一吲哚醌浓度的比值S/P均大于l,说明唾液中2,3一吲哚醌的浓 度大于血液中2,3一吲哚醌的浓度。尿液中2,3-g弓[哚醌的浓度也大于血液中2,3-gI 哚醌浓度。SandlerM等旧1曾在无菌环境中培养的无菌大鼠,在正常环境中生长的 无菌大鼠和正常对照组,然后检测这三组大鼠尿液中2,3一吲哚醌含量,发现在无菌 环境下培养的无菌大鼠与其他两组比较,其尿液中2,3一吲哚醌含量显著降低 PO.01。此实验说明尿液中2,3一吲哚醌的含量较血液中高,有可能与肠道中的 细菌有关系。由此推断唾液中2,3一吲哚醌含量的升高可能也与口腔中的细菌有一定 的关系。这还需要进一步实验证实口腔细菌与唾液中2,3一吲哚醌含量的关系。 3.4结论 实验结果表明,唾液和血浆中2,3一吲哚醌的浓度相关性良好。尿液和血浆中 2,3一吲哚醌也有一定相关性。两者均能一定程度上反应血浆中2,3-n弓[哚醌的浓度, 考虑到唾液作为检测样本的简便性,唾液有可能作为帕金森氏病,癌症等老年疾病 的诊断,发展及预后的判断指标。 论文创新点:1.首次建立电化学发光线性扫描法测定人尿液中2,3一吲哚醌含量。 此方法灵敏度高,线性范围宽,为电化学发光法与高效液相色谱法联用检测痕量物 质提供参考。 2.首次进行唾液与血液和尿液与血液相关性研究,为临床利用唾液诊断老年性 疾病提供依据。 论文不足处:1.尚待进一步研究在其他体液如男性精液中2,3一吲哚醌含量。 2.尚需进一步研究2,3-n弓l哚醌的体内形成过程及生物来源。 16 参考文献 参考文献 1. GloverV,HalketJM,WatkinsPJ,eta1.Isatin:identitywiththepurifiedendogenous monoamineoxidaseinhibitortribulin[J].JNeurochem,1988,512:656?659. 2. 李清华.青黛的化学成分[J].植物学报,1987,291:67. 3. GloverV,BattacharyaSK,SandlerM.Isatin-anewbiologicalfactor[J].Indian JExpBiol。1991。291:卜5. 4. McIntyreIM,NormanTB.Serotonergieeffectsofi atin.AnendogenousMAOinhibitor relatedotribulin[J].NeuralTransm,1990,791-2:35-40. 5.HotaD,AcharyaSB.Studiesonperipheralactionsfisatin[J].IndiaJExpBiol 1994.3210:710?717. 6. GloverV,ClowA,SandlerM.Effectsofdopaminergicdrugson uperoxidedismutase: implicationsforsenescence[J].JNeuralTransmSuppl,1993,40:37?45. 7. Anand?SrivastavaMB,TrachteGJ.Atrialnatriureticfactorreceptorsandsignal transductionmechanisms[J].PharmacolRev,1993,454:455?497. 8.TelegdyG,AdamikA,GloverV.Theactionofisatin2,3-dioroindoleanendogenous indoleonbrainnatriureticandC?typenatriureticp ptide?inducedfacilitation ofmemoryconsolidationinpassivea oidancelearninginrats[J].BrainResBull。 2000,533:367-370. 9. GloverV,MedvedevA,SandlerM.Isatinisapotentendogenousantagonistof guanylatecyclase?coupledatrialnatriureticp ptidereceptors[J].Life Sci,1995。5722:2073?2079. 10.BattacharyaSK。Ch krabartiA,GloverV,eta1.Anxiolyticactivityof intraventricularlyadministeredatrialnatriureticp ptideintherat[J]. Neuropsychopharmacology,1996,152:199?206. 11.ChocholovaL'KolinovaM.Effectofisatin2,3-dioxoindolineoaudiogenic seizuresinratsanditsrelationshiptoelectrographicandbehavioralphenomena[J]. PhysiolB hemoslov。1979,286:495?502. 12.ChocholovaL。KolinovaM.Effectofisatin2,3-dioxyindolineonphysiological ,.。,andpathologicalelectrographicmanifestationsofv gilance[J].Physiol Bohemoslov,1981。302:129?137. 13.李丰桥.吲哚醌对大鼠杏仁核点燃的抑制作用[J].药学学报。1999,341:1-4. 14.刘占涛.ISA对血中胆固醇的影响[M].大连:第七届中国海洋湖泊药物学术研讨会纪要, 2001,10:162-164. 15.岳旺,李丰桥,安部阳一.内源性MAO-B抑制因子一靛红预防MPTP多巴胺神经递质的耗竭作 用[J].中国神经科学杂志,2002,184:690?693. 16.张芳,张立志,刘占涛,等.2,3一吲哚醌对衰老模型小鼠的作用及机制研究[A].第十一届全 国神经药理学术会议论文摘要集.2004?06-30. 17.刘娜,鞠传霞。岳旺,等.2。3.吲哚醌对二甲基苯葸诱导的大鼠乳腺癌的预防作用[J].中国药 17 青岛大学硕士学位论文 理学通报,2010,2610:1353-1356. 18.刘占涛,岳旺,杨志宏,等.2,3.吲哚醌抗鹌鹑动脉粥样硬化作用及其机制研究[J].中国药 房,2009,204:256?258. 19.谷士军,李静,张继国,等.2,3-nil哚醌对小鼠的抗抑郁作用研究EJ].泰山医学院学 报,2011,3201:23-25. 20.陈达,孟晶晶,张芳,等.海洋抗生素吲哚一2,3一二酮的抗病毒作用[J].中国海洋药物, 2006,254:30?33. 21.岳旺,王蕾,臧东莲,等.靛红防治老年神经疾病药物的制备[P].中国专利:CNl306819, 2001?08?08. 22.岳旺,王蕾,刘占涛,等.一种抗癌防癌海洋活性药物的制备方法[P].中国专利: CN200410023871.1,2005-10-05. 23.岳旺,刘占涛,王蕾,等.吲哚一2,3一二酮在制备抗病毒或免疫增强剂药物中的应用[P].中国 专利:CN200510105691.2,2006-04-19. 24.岳旺,刘占涛,杨志宏,等.吲哚一2,3一二酮在制备心脑血管疾病药物中的应用[P].中国专利: CN20051 045475.3.,2006-08-09. 25.岳旺,刘占涛,刘小红,等.吲哚一23一二酮在制备抗炎药物中的应用[P].中国专利: 200810055735,2008-07-09. 26.岳旺,张丽,周三,等.吲哚一2,3一二酮在制备抗真菌药物中的应用[P].中国专利: CN200810055736.3,2008-07-09. 27.SinghB,SharmaR,SareenK,eta1.Isatinenzymeinteraction.V.Activationof rat1iveracidphosphatase[J].Enzyme,1977,224:256-261. 28.BansalRC,KaurP,KiranR.40deofinterac
/
本文档为【人体内源性抗衰老物质2,3--吲哚醌检测研究(可编辑)】,请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑, 图片更改请在作品中右键图片并更换,文字修改请直接点击文字进行修改,也可以新增和删除文档中的内容。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生,若发现您的权利被侵害,请联系客服邮件isharekefu@iask.cn,我们尽快处理。 本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用。 网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。

历史搜索

    清空历史搜索