sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr法分析肠应激综合征儿童肠道菌群

sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr法分析肠应激综合征儿童肠道菌群 SYBR Green?实时荧光定量PCR法分析肠应激综合征 儿童肠道菌群变化 12*华川～曹海涛,解放军252医院:1.检验科,2.医务处～河北保定 071000, 摘要 目的 应用SYBR Green ?实时荧光定量PCR法分析1-6岁肠应激综合征儿童患者肠道菌群的变化～探讨肠道相关分子微生态在发病中的作用及意义。方法 根据16SrRNA基因序列双歧杆菌属、乳酸杆菌属、肠球菌属、大肠杆菌、拟杆菌属、梭杆菌属、梭菌属的特异性引物～收集25份患者粪便标本及25份正常对照标本～提取细菌基因组DNA～应用SYBR Green ?实时荧光定量PCR反应测定7种细菌的数量。 结果 正常对照组与肠应激综合征儿童粪便中细菌数量为双歧杆菌属:8.85?0.57比8.28?0.68～乳酸杆菌属:8.36?0.45比7.79?0.39～梭杆菌属:8.12?0.44比6.07?0.46～梭菌属:7.32 <0.05,～大肠杆?0.63比6.66?0.65～发病组的数量明显减少,P 菌细菌数量的对数值分别为8.41?0.38比8.40?0.50～肠球菌数量的比值为7.49?0.65比7.96?0.42～拟杆菌属数量比值为10.62?0.47比10.64?0.55～2组数据没有明显差异。结论 肠道菌群的变化与儿童肠应激综合征的发生及发展机理有一定的关系,SYBR GreenI实时荧光定量PCR技术为儿童肠道菌群组成、动态变化及相关的研究提供了一种有效监测手段。 关键词: 肠应激综合征 肠道菌群 荧光定量 儿童 中图分类号:R725 文献标识码: A Analysis of the changes of intestinal microflora in patients with diarrhea in children by real time fluorescent quantitative PCR SYBR Green I 12Hua Chuan,Cao Haitao* (1.Department of Clinical Laboratory;2. Department of Medicine; No. 252 Hospital of PLA, Baoding 071000, China) 通讯作者:曹海涛,男，主要从事检验医学和科研工作，E-mail:cht252@163.com Abstract objective: Analysis of the changes of 1-6 years old children with diarrhea intestinal flora in patients with application of SYBR Green real-time fluorescence quantitative PCR～To investigate the gut associated molecular micro ecological role in the pathogenesis and significance。Methods According to the specific primers of 16SrRNA gene sequence of Bifidobacterium, Lactobacillus, Enterococcus and Escherichia coli～Bacteroides, Fusobacterium, Clostridium. Collect 25 stool specimens and 25 normal control specimens～ Extraction of bacterial genomic DNA～SYBR determination of real-time fluorescent quantitative PCR Green ? response quantity 7 kinds of bacteria. Results The normal control group and the number of bacteria in the stool diarrhea children for Bifidobacterium spp.: 8.85?0.57 vs 8.28?0.68, lactic acid bacteria of the genus: 8.36?0.45 vs 7.79?0.39, Fusobacterium: 8.12 ? 0.44 vs 6.07 ? 0.46 ,Clostridium: 7.32 ? 0.63 vs 6.66 ? 0.65significantly reduced the number of disease groups (P <0.05), Escherichia coli bacteria number of values were 8.41 ? 0.38 vs 8.40 ? 0.50, ratio of Enterococcus was 7.49 ? 0.65 vs 7.96 ? 0.42, Bacteroides species number was 10.62 ? 0.47 vs 10.64 ? 0.55. There was no significant difference between 2 groups of data.Conclusion There is a certain relationship between the change of intestinal flora in children with irritable bowel syndrome and development mechanism, provides an effective means of monitoring the real-time fluorescence quantitative PCR technology SYBR GreenI, for the children's intestinal flora changes and related research。 Key words Irritable bowel syndrome ,IBS,; fluorescent 通讯作者:曹海涛,男，主要从事检验医学和科研工作，E-mail:cht252@163.com quantification real-time PCR; intestinal flora ;children 肠应激综合征被认为是与肠道微生态环境的变化有关。正常的肠道菌群在长期历史进化过程中形成了一个动态的微生态系统～像是一道屏障～保护宿主的健康～维持人体肠道正常生理功能。儿童肠道菌群的定植时间较成人短～更易受到外界的影响而发生改变～外来细菌容易入侵～从而影响肠道菌群中的细菌比例～引起消化不良、腹泻等[1-2]。 1材料和方法 1.1标本采集 采集25例1-6岁肠应激综合征儿童,符合罗马?诊断,及 [3]25例健康儿童的粪便样品～所有患者留取粪便标本前均未应用抗生素或微生态制剂,对照组儿童留取粪便标本前2周内无消化道不适症状～且未应用抗生素或微生态制剂采用无菌采便盒收集～ 1.2 主要仪器和试剂 粪便基因组DNA提取试剂盒、SYBR Green荧光染料均购自北京天根生化科技有限公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA Marker、琼脂糖、2×PCR Mix购自北京康为世纪～实验所需引物为北京天一辉远合成～PCR仪为美国伯乐公司的MyCycler～荧光定量PCR仪为美国ABI公司的7500。 1.3方法 1.3.1 粪便标本细菌DNA的抽提取 2克粪便加入18毫升无菌PBS～振荡10分钟形成粪浆 取0.2g粪浆标本用DNA缓冲液处理～取上清200ul使用天根粪便基因组DNA提取试剂盒,DP328,抽提样品粪便内的细菌基因组DNA～操作依照#说明#进行。 1.3.3 PCR引物的设计 根据双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌、拟杆菌属、梭杆菌属、梭菌属 16SrDNA基因序列～应用引物设计软件 Primer premier 5.0设计并参考文献～定如下PCR引物: 双歧杆菌属: 230bp F: 5’-GATTCTGGCTCAGGATGAACGC-3’ 通讯作者:曹海涛,男，主要从事检验医学和科研工作，E-mail:cht252@163.com R: 5’-CTGATAGGACGCGACCCCAT-3’ 乳酸杆菌属: 232bp F: 5’-TGGA AACA GRTG CTAA TACC G-3’ R: 5’-GTCC ATTG TGGA AGAT TCCC-3’ 大肠杆菌属:75bp F: 5’-CTCG CTGG CATT TGCG TAC-3’ R:5’-ATCT TTTG CCGT CCGT TTTG G-3’ 肠球菌属: 144:F: 5’-CCCTT ATTGTTAGTTGCCATCATT-3’ R:5’-ACTCGTTGTACTTCCCATTGT-3’ 拟杆菌属 169:F: 5’-TGA CAGTGAGAGATTTGCTGCGTT-3’ R:5’-TCAGCCGACATTTCCTCTTCCGT-3’ 梭杆菌属 100 F: 5’-CGCAGAAGGTGAAAGTCCTGTAT-3’ R:5’-TGGTCCTCACTGATTCACACAGA-3’ 梭菌属 260 F: 5’-CGCAGAAGGTGAAAGTCCTGTAT-3’ R:5’-TGGTCCTCACTGATTCACACAGA-3’ 1.3.4制作标准曲线 取标准菌株冻干粉各0.2g～用1ml PBS溶解～其中200ul用于试剂盒提取标准菌株基因组DNA～并用相应的引物扩增。将扩增产物用DNA产物纯化试剂盒纯化～将标准菌株的DNA测量OD值～计算双链DNA的浓度～计算出PCR片段的拷贝数换算为各标 1414准品1ul的拷贝数:双歧杆菌属 2.3×10～乳酸杆菌属1.8×10～ 141414大肠杆菌属5.8×10～粪肠球菌2.6×10～屎肠球菌3.6×10～拟 141414杆菌属3.95×10 梭杆菌属5.16×10 梭菌属2.02×10 然后作十 28倍系列稀释～使之成为 1×10，1×10拷贝数/ml～作为标品～进行实时荧光定量PCR反应～得到标准曲线～其中横坐标代不同阳性细菌拷贝数的对数值～纵坐标代表出现荧光信号的初始循环数,Ct值,。 1.3.5 荧光定量PCR 采用20ul反应体系: SYBR premix(2×):9 ul～ 10umol/L上下游引物 各1 ul,模板 2ul,水7 ul,最后加入石蜡油 8ul,扩增条件为95?预变性2 rain～95?变性20 S～双歧杆菌57?、拟杆菌属57?～乳酸杆菌58?、梭杆菌属58?～大肠杆菌59?、梭菌属59?～粪肠球菌60?、屎肠球菌61?退火30 s～68?延伸30 s～通讯作者:曹海涛,男，主要从事检验医学和科研工作，E-mail:cht252@163.com 循环40次～74?后延伸1 min。每次反应每个样品做一个复孔～并做阳性和阴性对照。最后根据标准曲线和样品的Ct值～得出样品中7种细菌的拷贝数。反应完毕后根据融解曲线分析PCR产物的特异性。 1.4 统计学分析 所得数据采用SPSS 17.0 统计软件处理～菌群所测结果对数转换后进行统计学分析。正态分布的计量资料用均数?标准差,?S,X表示～组间差异采用两独立样本t检验,非正态分布的计量资料用中位数和四分位间距表示～组间差异采用秩和检验。P,0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2组研究对象的粪便定量结果见表1。由表1可见～与正常对照组相比～IBS患者粪便中的双歧杆菌属、乳酸杆菌属、梭杆菌属和梭菌属数量明显减少,P<0.05,～大肠杆菌、肠球菌属和拟杆菌属数量无明显变化,P,0.05,, X表1 粪便标本细菌定量结果,LogN/g～?S, 组别 正常对照组 IBS患者组 ?双歧杆菌属 8.85?0.57 8.28?0.68 ?乳酸杆菌属 8.36?0.45 7.79?0.39 大肠杆菌 8.41?0.38 8.4?0.5 肠球菌属 7.49?0.65 7.56?0.42 拟杆菌属 10.62?0.47 10.64?0.55 ?梭杆菌属 8.12?0.44 6.07?0.46 ?梭菌属 7.32?0.63 6.66?0.65 3.讨论 肠道微生态系统是机体最庞大、最重要的微生态系统。人体肠道内的微生物中～超过99%都是细菌～存活着数量大约有100兆个～有500，1000个不同的种类。这些数目庞大的细菌大致可以分为三个大通讯作者:曹海涛,男，主要从事检验医学和科研工作，E-mail:cht252@163.com 类:有益菌、有害菌和中性菌。人体是否健康与肠道内的益生菌群结构息息相关。肠道菌群在长期的进化过程中～通过个体的适应和自然选择～菌群中不同种类之间～菌群与宿主之间～菌群、宿主与环境之间～始终处于动态平衡状态中～形成一个互相依存～相互制约的系统～因此～人体在正常情况下～菌群结构相对稳定～对宿主表现为不致病[4-5]。肠应激综合征,IBS,是最常见的功能性肠胃病之一～约占消化内科门诊的20%-30%～肠道菌群失调在IBS发病过程中的作用已经被广泛认同～尤其是在感染后IBS患者发病率更高～约有28-80%存在菌群失调。通常研究肠道菌群主要有大肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌四个种群～本研究加入和肠道菌群失调密切相关的厚壁菌门和拟杆菌。梭菌属是厚壁菌门的优势菌属～梭菌属结构的变化与肠道 [6]粘膜的粘膜完整性密切相关～其中的产气荚膜梭菌具有编码肠毒素和细胞毒素的致病基因～其毒素可以破坏肠粘膜而引发腹泻等疾病～另一方面酪酸梭菌产生的丁酸盐则可保证粘膜的完整性祈祷保护肠道抵御结肠癌的作用～酪酸梭菌还能与双歧杆菌、乳杆菌等益生菌共生并促进其增值～加强肠道的蠕动～减少机会致病菌在肠腔内停留时 [7]间～病菌黏附和定植。拟杆菌是肠道菌群的三大门之一～也是肠道中最主要的厌氧菌～在帮助宿主分解多糖、促进肠粘膜的血管再生和免疫系统的发育方面有重要作用～有利于维持肠道微生态的平衡～梭 [8-10]杆菌属和拟杆菌属是拟杆菌科中最重要的组成部分。 人出生后数小时～胃肠道就会有细菌出现～即菌群初级演替～此后经生理演替和刺激演替达到稳态。婴儿后期至断乳后～肠道菌群结构才趋于稳定～这种状态维持整个儿童期。由于儿童期仍处于次级演替过程～其肠道内生环境、定植能力及免疫功能尚不稳定～故肠道微 [11-12]生态的平衡稳定性较差～容易受到气候、饮食等因素的影响 。 16S rDNA是细菌染色体上的一段被用于细菌分类的DNA序列～其保守区在进化过程中稳定～某些序列片段为所有细菌所共有～中间的可变区则与种属相关。根据NCBI数据库中已知的不同细菌的16S rDNA序列设计特异性引物～就可应用实时定量PCR技术检测样本中细菌中通讯作者:曹海涛,男，主要从事检验医学和科研工作，E-mail:cht252@163.com 对应的拷贝数。实时荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃～它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光分子～如SYBR Green I等荧光染料。在PCR反应体系中加入过量SYBR Green I荧光染料～SYBR Green I荧光染料特异性的掺入DNA双链中后～发射荧光信号。荧光染料的优势在于它能检测任何dsDNA序列的扩增～不需要探针的设计～使检测方法变得简便～同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合～因此它也能与非特异性的dsDNA～如引物二聚体结合～使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目 [13-14]前可以用带有溶解曲线,melting curve,来加以解决。 本实验所研究的对象为菌属～其类型较多～并且无法设计合适的探针～所以选择设计特异的菌属引物～使用SYBR Green I嵌合荧光法进行荧光定量PCR～其原理是通过PCR反应生产双链DNA～SYBR Green I与双链DNA结合发出荧光～通过PCR反应液中的荧光信号强度～可以对目的基因进行准确定量。在本实验中～各个样本都进行三次重复试验～每次所得的结果取均数基本一致～这也证实了我们所选取方法具有稳定性和可重复性。本研究应用SYBR GreenI实时荧光定量PCR技术～实现了对双歧杆菌属、乳酸杆菌属等难培养的肠道细菌的定量分析～结果显示肠应激综合征患儿正常对照者间细菌数量的差异有统计学意义,P<0.05,～提示肠道菌群的变化与儿童肠应激综合征的发生及发展机理有一定的关系。SYBR GreenI实时荧光定量PCR技术为儿童肠道菌群组成、动态变化及相关的研究提供了一种有效监测手段～为临床诊治提供新的理论依据。 参考文献: [1] Sandler RS,Everhart JE,Donowitz M,et al.The burden of selected digestive diseases in the Unitied States[J].Gastroenterology,2002,122(5):1500-1511. 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