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硅油小滴对人视网膜色素上皮细胞吞噬活性的影响(医学论文)

2017-11-27 9页 doc 27KB 28阅读

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硅油小滴对人视网膜色素上皮细胞吞噬活性的影响(医学论文)硅油小滴对人视网膜色素上皮细胞吞噬活性的影响(医学论文) 硅油小滴对人视网膜色素上皮细胞吞噬活性的影响 作者:马丽娜 惠延年 王雨生 张乐 王静波 徐建峰 马吉献 【摘要】 目的:探讨一定大小的乳化硅油小滴能否影响视网膜色素上皮,retinal pigment epithelial , RPE,细胞的吞噬能力。方法:将硅油挤压通过一种微孔滤膜制成大小相似的小滴。用酞箐蓝标记硅油小滴。培养的人RPE细胞与硅油小滴,伴或不伴有血清,共同孵育24h。被细胞内吞的小滴在显微镜下计数。测量人RPE细胞在体外吞噬硅油小滴的数量。结果...
硅油小滴对人视网膜色素上皮细胞吞噬活性的影响(医学论文)
硅油小滴对人视网膜色素上皮细胞吞噬活性的影响(医学) 硅油小滴对人视网膜色素上皮细胞吞噬活性的影响 作者:马丽娜 惠延年 王雨生 张乐 王静波 徐建峰 马吉献 【摘要】 目的:探讨一定大小的乳化硅油小滴能否影响视网膜色素上皮,retinal pigment epithelial , RPE,细胞的吞噬能力。方法:将硅油挤压通过一种微孔滤膜制成大小相似的小滴。用酞箐蓝标记硅油小滴。培养的人RPE细胞与硅油小滴,伴或不伴有血清,共同孵育24h。被细胞内吞的小滴在显微镜下计数。测量人RPE细胞在体外吞噬硅油小滴的数量。结果:挤压通过这种微孔膜制成的硅油小滴至少稳定5d,硅油小滴的直径为4.25〒0.77μm。乳化硅油浓度不同,RPE细胞吞噬硅油小滴的数量有明显剂量依赖性,随浓度增高,吞噬数量也增加。加有血清的硅油小滴使RPE细胞的吞噬能力进一步增强。结论:硅油小滴能刺激RPE细胞的吞噬能力,含有血清时对RPE细胞的吞噬能力有进一步的刺激作用。 【关键词】 色素上皮 眼 硅油 乳化 吞噬 Effects of vesicles of silicone oil on phagocytosis of human retinal pigment epithelial cells in vitro 更多精品文档,欢迎来我主页查询 Abstract AIM: To investigate whether the phagocytosis potentiality of retinal pigment epithelial (RPE) cells can be influenced by emulsified silicone oil droplets with a certain vesicle size. METHODS: Similarly sized vesicles of silicone oil were produced by extrusion of oil through a micro-pore filter membrane. Vesicles of silicone oil were labeled and monitored with phthalocyanine blue dye. Cultured human RPE cells were incubated with labeled silicone oil vesicles and with or without serum for 24 hours. The numbers of the vesicles engulfed in the RPE cells were counted under a microscope. The main outcome measure was the ability of RPE cells to phagocytize the vesicle numbers of silicone oil in vitro. RESULTS: Extruding silicone oil through the membrane resulted in the production of vesicles that remained stable for at least 5 days. The mean vesicle diameter was 4.25〒0.77μm. Vesicles of silicone oil had a dose-dependent influence on RPE cell phagocytosis. The more the concentration of the vesicles, the more phagocytosis the cells did. Phagocytosis of the vesicles by cultured RPE cells was also stimulated by serum added in the culture medium.CONCLUSION: These in vitro data show that 更多精品文档,欢迎来我主页查询 vesicles of silicone oil are stable once emulsified. Vesicles of silicone oil can stimulate the ability of RPE cell phagocytosis. The serum can further stimulate the ability of the phagocytosis. 〃 KEYWORDS: pigment epithelium of eye; silicone oil; emulsification; phagocytosis 0引言 硅油又称为聚二甲基硅氧烷,理化性质稳定。没有生物毒性、透 光和屈光性好、粘稠度高、能限制玻璃体腔内的增生细胞和生化介质 的移动,可能限制增生性玻璃体视网膜病变,并且具有机械性抑制增 生膜的牵引作用,能有效封闭裂孔。目前硅油广泛用于治疗复杂孔源 性视网膜脱离,特别是复杂视网膜增殖性疾病。但眼内长期放置硅油 可引起许多并发症,其中硅油乳化是较严重的一种。硅油乳化是指小 而稳定的硅油小滴与玻璃体内硅油大泡分离并扩散进入眼组织的一 种过程。此时,乳化硅油对限制玻璃体腔内的增生细胞和生化介质移 动的能力降低,封闭裂孔的能力也降低。在视网膜表面的一些地方, 硅油小滴黏附紧密,很难用机械的方法将其冲洗干净。张少冲等[1] 对玻璃体腔注射硅油患者的这些部位进行了视网膜光学相干断层扫 描(optical coherence tomography, OCT),发现均有视网膜下膜的 更多精品文档,欢迎来我主页查询 形成,视网膜色素上皮细胞也有增殖。乳化硅油可能刺激膜形成和随后的增生性玻璃体视网膜病变,proliferative vitreoretinopathy, PVR,反应。吞噬细胞可能被硅油小滴活化,即吞噬等能力增强,并吞噬一定大小的小滴。因此我们在体外用人眼视网膜色素上皮,RPE,细胞硅油小滴对其吞噬活性的影响。 1材料和方法 1.1材料 硅油小滴使用微孔膜乳化法制备。粘度为 5 700mPa〃s硅油0.05mL在1个大气压的乳化压下通过孔径为0.45μm的纤维素微孔膜,分散于10mmol/L PBS 0.95mL液中。向1mL乳化硅油液中加入油溶性染料酞箐蓝10μg,该染料不溶于PBS,能均匀溶于硅油。充分振荡,使染料均匀着染硅油小滴。利用光学显微镜可以直接观察硅油小滴大小,并通过对拍摄照片的分析,计算出硅油小滴的直径。硅油小滴样本由制得乳化硅油液中央吸取,随机吸取3滴样本,每滴样本随机取3个视野,每个视野至少测量50个硅油小滴,用图象采集分析系统(Image,Pro Plus 6.0)测量小滴直径。重复实验3次。 1.2方法 RPE细胞系为原代培养人RPE细胞,由第四军医大学西京医院王静波博士惠赠。细胞复苏后,Eagle培养液(delbeccos modified Eagles medium , DMEM , Gibco , USA )中加入更多精品文档,欢迎来我主页查询 100mL/L新生牛血清,四季青产品,、青霉素,100〓103U/L,、链霉素,100〓103U/L,,培养箱中37?,50mL/L CO2常规培 6代细胞用于实验。将对数养,次日更换培养液继续培养。选择3: 生长期的细胞按5〓108个/mL密度接种于预置有盖玻片,8mm〓8mm,的24孔板中,接种24h后更换培养液,每孔加入2mL培养液。实验分两组,第1组加入DMEM培养液,第2组加入加有100mL/L新生牛血清的DMEM培养液。分别向2组细胞中加入硅油含量为0,10mmol/L PBS液,空白对照,,12.5,25.0,50.0mL/L的染色乳化硅油液100μL,常规培养24h,取出爬片,10mmol/L PBS液充分冲洗3次,40g/L多聚甲醛固定0.5h,用吸管吸取多聚甲醛轻轻冲洗爬片上残留硅油小滴3次,10mmol/L PBS液漂洗3次,待测。光学显微镜下观察,每张爬片随机取3个视野,每个视野至少计数50个细胞,用图象采集分析系统(Image,Pro Plus 6.0)计算细胞内吞的染色硅油小滴来分析RPE细胞对硅油小滴的吞噬作用。每个浓度设3个复孔,重复实验3次。 统计学处理:采用数据软件SPSS11.5处理,采用t检验,进行两样本均数比较,以及LSD 检验,进行多组样本均数比较,数据表示为 。 2结果 更多精品文档,欢迎来我主页查询 用孔径为0.45μm的微孔膜制得的硅油小滴直径为4.25〒0.77μm,硅油小滴可稳定至少5d。酞箐蓝可均匀着染硅油小滴,不溶于PBS,可示踪硅油小滴,分析RPE细胞内吞硅油小滴的情况。培养的RPE细胞固定于玻璃面上,在DMEM组与加有100mL/L新生牛血清的DMEM组中,空白对照中的细胞内均未见硅油小滴。与酞箐蓝标记的硅油小滴共孵育的RPE细胞对此物质有吞噬作用。RPE细胞对硅油小滴的吞噬作用呈浓度依赖性。在DMEM组中,RPE细胞内吞硅油小滴的平均数量随硅油浓度的递增而增加,各组间均为P <0.001,,并没有呈现明显吞噬饱和状态。硅油浓度为50.0mL/L时,RPE细胞内吞硅油小滴数量为35.93〒3.28,图1,。在加有100mL/L新生牛血清的DMEM组中,RPE细胞内吞硅油小滴的平均数量也随硅油浓度的递增而增加,各组间均为P <0.001,,也没有呈现明显吞噬饱和状态。硅油浓度为50.0mL/L时,RPE细胞内吞硅油小滴数量为40.27〒4.34,图1,,多于同一硅油浓度的DMEM组,P <0.05,。DMEM组中各组硅油浓度的RPE细胞内吞硅油小滴数量和加有100mL/L新生牛血清的DMEM组同一浓度的RPE细胞内吞硅油小滴数量之间有明显差异,P <0.05,,说明加有血清的硅油小滴使RPE细胞的吞噬能力进一步增强,血清在这一吞噬过程中起促进作用(图2A,B)。 3讨论 更多精品文档,欢迎来我主页查询 以往实验表明眼球振动、纤维素、白蛋白、血影细胞等加速硅油乳化,但都是使用低粘度硅油,这些因素对高粘度硅油的乳化没有显著作用[2]。工业传统乳化方法耗能高,微粒大小不易控制,用来模拟人眼内乳化硅油模型不理想。膜乳化法是指分散相受压后通过微孔膜,自发形成单分散性乳化液。此种方法能量消耗低、微粒直径和微粒分散性可控和只需低切应力。微孔膜最大优点是孔径均一,能制备单分散乳化液[3]。我们采用微孔膜膜乳化法制备乳化硅油,不需加入其他乳化剂,有利于研究纯硅油小滴对RPE细胞吞噬活性的影响。使硅油在1个大气压下通过孔径为0.45μm的微孔膜制得的小滴直径为4.25〒0.77μm,制得硅油小滴至少可以稳定5d。使用酞箐蓝染料标记硅油小滴。酞箐蓝染料是一种化学性质非常稳定的化合物,对光、热、酸、碱呈高度稳定性,由于其在一定条件下对细胞产生光毒性作用,近年来用于光动力治疗肿瘤等疾病。Glassberg等[4]报道酞箐类染料在缺乏激光激发以及浓度低于25mg/L时,对细胞没有毒性作用。用来标记硅油,对细胞活力、发育或基本生理特性不会有影响。由于酞箐蓝是油溶性染料,不溶于水,可认为染料对硅油标记有特异性。比较不同组RPE细胞内吞标记的硅油小滴数量来研究不同因素对RPE细胞吞噬活性的影响。 RPE细胞具有多种复杂的生化功能。吞噬消化光感受器外节脱落的膜盘,对外节的更新和光感受器的存活至关重要[5],是其重要的功能之一。这种选择性吞噬作用称为特异性吞噬。此外, RPE细胞更多精品文档,欢迎来我主页查询 还具有非特异性吞噬功能,即能吞噬无特异性辨别位点的物质,如聚乙烯微球、胎盘兰染料、黑色素小滴等。非特异性吞噬与RPE细胞膜上的慢速摄取受体有关[6,7]。细胞骨架在RPE细胞非特异吞噬时起一定作用。其中肌动蛋白有助于RPE对异物的摄取,内吞物在RPE细胞内移动至初级溶酶体有赖于微管的参与[8]。在长期硅油填充的患眼中,RPE细胞与硅油小滴接触,非特异性识别、并吞噬,可能引起一系列RPE细胞生物学行为的改变。我们在体外用RPE细胞与硅油小滴共孵育,观察细胞吞噬硅油小滴,结果显示RPE细胞有较强的吞噬活性。我们用乳化硅油液与RPE细胞共孵育,RPE细胞内吞硅油小滴的数量随硅油浓度递增而增加,并且没有显示明显的饱和状态,可能与实验选用乳化硅油浓度稍低有关。另外,如选用纯的PBS液作为对照组,并未加入其他RPE细胞可识别、吞噬的物质,因此,与其他物质相比,硅油小滴能否增强RPE细胞的吞噬能力,以及其他物质刺激RPE细胞吞噬是否呈浓度依赖性,还需进一步实验。 血清能刺激RPE细胞的吞噬活性。Mayerson等[9]的研究显示,在RPE吞噬过程中,识别和摄取是高度特异化的过程,血清在吞噬过程中至关重要。在比较RPE细胞和巨噬细胞的吞噬机制时,Irschick等[10]发现血清能适度的增加RPE细胞对细菌的吞噬。这种刺激作用可能与血清中含有多种活性因子有关。Miceli等[11]报道,在血清刺激RPE 细胞吞噬外节时,玻璃体结合蛋白起一定作用。更多精品文档,欢迎来我主页查询 Hall等[12]认为RPE细胞的吞噬作用需要血清的存在。而血清中的Gas6,一种维生素K依赖的血清蛋白,在此过程中可以完全替代血清。同时还发现蛋白质S,也是维生素K依赖的血清蛋白,与Gas6结构高度相似,在血液中的作用与Gas6相似。此外,Edwards[13]发现,血清刺激RPE细胞吞噬作用仅发生在RPE细胞顶端。因此,在炎症、外伤或其他视网膜疾病情况下,血浆外渗使RPE暴露在血清中,刺激吞噬活性。本实验结果表明,用微孔膜制备乳化硅油液,能够很好的模拟人眼内硅油乳化的情况。RPE细胞对硅油小滴的吞噬呈浓度依赖性,此过程中血清可能刺激RPE细胞对硅油小滴的吞噬。 【参考文献】 1张少冲,李松峰,刘恬,乔利亚.硅油长期充填眼部改变及取出原因和结果.中国实用眼科杂志, 2004;22:269-271 2马丽娜,惠延年.乳化硅油及其并发症.国际眼科纵 览,2006;30:42-45 3 van-der-Graaf S, Schroen CG, van-der-Sman RG, Boom RM. Influence of dynamic interfacial tension on droplet formation during membrane emulsification. J Colloid Interface Sci ,2004;277(2): 456-463 更多精品文档,欢迎来我主页查询 4 Glassberg E, Lewandowski L, Lask G, Uitto J. Laser-induced photodynamic therapy with aluminum phthalocyanine tetrasulfonate as the photosensitizer: differential phototoxicity in normal and malignant human cells in vitro. J Invest Dermatol ,1990; 94(5): 604-610 5 Hoppe G, O’Neil J, Hoff HF, Sears J. Products of lipid peroxidation induce missorting of the principal lysosomal protease in retinal pigment epithelium. Biochim Biophys Acta ,2004;1689(1):33-41 6孙昱昭,洪晶.双重荧光标记法检测人视网膜色素上皮细胞吞噬的 功能.国际眼科杂志,2006;6(1):42-46 7张鲲,何守志.bFGF对体外培养牛RPE细胞特异性吞噬功能的影 响.国际眼科杂志,2006;6(1):72-74 8李红艳, 朱秀安.视网膜色素上皮吞噬机理的研究进展.国外医学 眼科学分册,1994;18(2):86-90 9 Mayerson PL, Hall MO. Rat retinal pigment epithelial cells 更多精品文档,欢迎来我主页查询 show specificity of phagocytosis in vitro. J Cell Biol ,1986;103(1):299-308 10 Irschick EU, Sgonc R, Bock G, Wolf H, Fuchs D, Nussbaumer W, Gottinger W, Huemer HP. Retinal pigment epithelial phagocytosis and metabolism differ from those of macrophages. Ophthalmic Res ,2004;36(4):200-210 11 Miceli MV, Newsome DA, Tate DJ. Vitronectin is responsible for serum-stimulated uptake of rod outer segments by cultured retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1997;38(8):1588-1597 12 Hall MO, Obin MS, Heeb MJ, Burgess BL, Abrams TA. Both protein S and Gas6 stimulate outer segment phagocytosis by cultured rat retinal pigment epithelial cells. Exp Eye Res ,2005;81(5):581-591 13 Edwards RB. Stimulation of rod outer segment phagocytosis by serum occurs only at the RPE apical surface. Exp Eye Res ,1991;53(2):229-232 更多精品文档,欢迎来我主页查询
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