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水溶性维生素检测分析的研究进展.doc

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水溶性维生素检测分析的研究进展.doc水溶性维生素检测分析的研究进展.doc 水溶性维生素检测分析的研究进展 摘要:维生素是维持生命活动必不可少的一类有机化合物,摄入不足或过量均可导致机体功能障碍,因其易在烹调、加工过程中损失,因此分析和评价食品和营养保健品中的维生素含量将对指导人群科学摄取维生素具有重要参考价值。水溶性维生素多为强极性化合物,其检测难度较大,因此系统介绍了微生物法、分光光度法、高效液相色谱法等水溶性维生素的检测方法,并针对多种水溶性维生素联合检测的高效液相色谱法,从同时提取、分离以及检测等方面进行综述,以期为今后开展水溶性维生素的高通量快速...
水溶性维生素检测分析的研究进展.doc
水溶性维生素检测分析的研究进展.doc 水溶性维生素检测分析的研究进展 摘要:维生素是维持生命活动必不可少的一类有机化合物,摄入不足或过量均可导致机体功能障碍,因其易在烹调、加工过程中损失,因此分析和评价食品和营养保健品中的维生素含量将对指导人群科学摄取维生素具有重要参考价值。水溶性维生素多为强极性化合物,其检测难度较大,因此系统介绍了微生物法、分光光度法、高效液相色谱法等水溶性维生素的检测,并针对多种水溶性维生素联合检测的高效液相色谱法,从同时提取、分离以及检测等方面进行综述,以期为今后开展水溶性维生素的高通量快速分析提供借鉴和参考。 关键词:水溶性维生素;联合检测;高效液相色谱法 中图分类号:O657.7 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2013)23-5676-05 维生素是一类人体不能合成或合成量不足、必须直接或间接从食品中摄取的化合物,广泛存在于谷类、果蔬、肉禽及蛋类等动植物细胞中。根据其溶解性差异,分为水溶性维生素(Water-soluble vitamins,WSVs)和脂溶性维生素(Fat-soluble vitamins,FSVs)。WSVs通常指极性较大,易溶于水的一类维生素,包括B族维生素、生物素(H)和抗坏血酸(VC)等。现已知WSVs具备多种生理生化功能。例如:B族维生素是多种辅酶的组成成分,参与有机体中的糖、脂肪、蛋白质及核苷酸的合成代谢;VC作为强氧化剂参与了氨基酸羟化反应和去除自由基等过程。目前已建立了单 一WSV的检测方法[1-3],现行分析方法(国标、欧盟指令条例和AOAC等)多数为微生物法、分光光度法,但这类方法耗时、费力,已难以满足当前分析要求和发展趋势。基于色谱技术的分析方法准确、快速、重现性好等特点,目前已在WSVs上得到了应用,高通量WSVs检测方法已有报道,但由于WSVs结构各异,理化性质差异大,导致建立高通量的维生素前处理和检测方法难度较大,本研究将围绕相关进展进行评述,以期为开展相关工作提供参考。 1 微生物法 1889年Beijerinck首次发现酵母菌的生长与其生长环境中的某些营养成分存在对应关系,由Williams首次提出微生物测定维生素的构想,随后B族维生素的微生物法相继建立,并于20世纪50年代广泛地应用于 -6]。尽管早期微生物法是分析WSVs食物、药剂和饲料等各类样品的分析[4 的标准方法,但是该方法检测时间长、操作复杂,检测结果的相对不确定度达到?20%,而且还存在培养污染、菌株个体差异、样品基质影响菌株生长等[7]不确定性因素,导致方法重现性较差。基于上述原因,目前微生物法在常规WSVs分析中已基本淘汰。 2 光度法 光度法(Spectrophotometry)是继微生物法之后开发的一类方法,包括紫外分光光度法和分子荧光法等。这类方法一般是测定维生素或其衍生物在特定波长或激发光下的吸光度或发射光强度从而进行定性定量分析的一类方法。紫外分光光度法的操作简单、快速、取样量小、成本低、选择性强,但吸光度值易受样品基质的干扰。分子荧光法的灵敏度通常比 紫外分光光度法高2,4个数量级,因此检出能力更强。例如,分子荧光法可用于VB1、VB2、VB6的联合检测,最小检出浓度依次为12、9、10 μg/L[8],但由于目标物结构相似,荧光光谱重叠,存在干扰,其稳定性和选择性有待提高。 3 高效液相色谱法 高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)是根据化合物性质差异,在固定相和流动相中反复分配,依次进入检测器产生信号的一类方法。目前几乎所有的WSVs均可采用HPLC法分析,检出限最低可达ng水平。但由于WSVs理化性质各异,尽管同时分析多种WSVs具有分析效率高、检测成本低等优点,但其难度较大。现有多种WSVs分析方法详见1。需要指出的是,WSVs的同时检出方法受到前处理、色谱条件和检测器等因素影响极大,现简述如下。 3.1 提取方法 提取方法直接决定HPLC法检测的灵敏度和准确度。由于WSVs极性较大,这使得采用极性较大的试剂同时提取多WSVs成为可能。由于WSVs存在游离态或者结合态两种,因此WSVs的同时提取根据样品不同略有差异。游离态WSVs通常采用水提取,而对于婴儿营养配方食品或维生素强化饮料等复杂样品,通常先用醋酸锌或高氯酸等试剂先沉淀样品中的蛋白质,然后采用乙酸铵-甲醇或者乙酸-水溶液提取;结合态WSVs通常被基质中的蛋白质或糖等化合物偶联或包裹[9],因此在提取前常需采用硫酸、盐酸或蛋白酶、淀粉酶水解样品,将结合态的WSV转化为游离态的WSV,并结合固相萃取净化,获得待测液[10,11]。例如天然食品中的VB2主要以 黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)与蛋白质结合的形式存在。因此,分析VB2时通常采用先水解再酶解的方法将其转化为游离态VB2后再分析;检测样品中VB6总量时,将磷酸化和游离状态的类维生素(吡哆醛、吡哆酮)转化为吡哆醇[12]。但不管是酸水解还是酶水解,效率均较低,且WSVs多以辅基、辅酶形式存在,酸消化虽然能释放出部分维生素的游离形式,但易损坏某些种类的结构,比如叶酸在酸性溶液中对热不稳定,泛酸虽在pH 5,7的水溶液中最稳定,但遇酸或碱则水解,因此酸解并不适合于多种WSVs的联合检测。 超声处理属于物理前处理方法,在高频声波(>20 kHz)作用下,在液体中可产生强化传质、空化以及发热等多种效应,不仅有助于样品分散,更有助于样品中的WSVs进入提取液。目前,超声处理的方法已广泛应用于药物检验,并列入《中国药典》中VC、VB1以及VB2的前处理方法[22]。而近10年,恒温(低温)超声的方法也总被用于WSVs的提取(表1)。另外,在前处理中,为避免部分WSVs发生氧化反应,常在提取过程中使用抗氧化剂,包括丁羟甲苯、硫代硫酸钠、EDTA等[13]。并在操作过程中要尽量避光,降低WSVs的光解率。 3.2 液相色谱分析 由于WSVs极性较强,使得开发多种WSVs同时分离的方法难度较大。目前报道的WSVs液相色谱分析方法主要包括3类:化学键合相色谱、离子交换色谱和亲水作用色谱等。 3.2.1 化学键合相色谱 WSVs的联合检测多采用C18键合固定相色谱分析,这类方法通常选择甲醇、乙腈等有机试剂和缓冲剂(如乙酸、磷酸二氢铵等)为流动相,梯度洗脱,其重复性好,不仅适合于WSVs的多组 分检测,还特别适宜于WSVs和FSVs的联合检测。我国食品安全国家标准《婴幼儿食品和乳品中维生素B6的测定》中采用C18柱实现3种VB6(吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺)的分离[12]。Heudi等[23]运用C18柱分离、以酸性乙腈梯度洗脱、紫外双波长(210 nm和275 nm)检测,定量分析了婴儿强化食品中的9种WSVs。Borivoj等[24]采用C18柱,以0.010%三氟乙酸-甲醇梯度洗脱,二极管阵列检测器检测实现了样品中的10种WSVs和4种FSVs的同时检出。但另一方面,由于WSVs含有极性基团,溶液中常以离子形式存在,如VB1和VB6,因此采用反相色谱分析样品中的WSVs时,某些WSVs的保留时间短,甚至不保留。为此,常采用含离子对试剂的流动相,通过离子对试剂中和WSVs的电荷,形成配对离子[25],Vidovic等[26]以0.012 5 mol/L己烷磺酸钠为离子对试剂,采用C18柱成功分离了VC、VB1、VB2、VB3、VB5和VB6,但这类方法的平衡时间较长,特别是长期使用离子对试剂易对C18柱产生损伤,因此,也有采用离子交换色谱分析WSVs。 3.2.2 离子交换色谱 离子交换色谱根据固定相中带电基团不同分为阳离子和阴离子2种,可与溶液中的阳离子或阴离子发生交换。在采用离子交换色谱分析WSVs时,常通过调节流动相pH来控制WSVs带电状态,进而分离各种WSVs。2011年,Dabre等[19]运用反相弱阴离子交换(Reversed-phase weak anion exchang,RP-WAX)树脂为固定相,磷酸盐缓冲液/乙腈梯度洗脱,同时检测了维他命含片中的7种WSVs和3种FSVs,WSVs的检出限为0.335,6.719 μg/mL。离子交换色谱分析WSVs的关键在于调节流动相pH,存在一定难度,因而该方法并不普及。 3.2.3 亲水色谱 亲水作用色谱(Hydrophilic interaction chromatography,HILIC)是用来改善在反向色谱中强极性化合物保留行为差的一种色谱方法[27],主要特征在于亲水性的固定相,流动相通常是含高比例有机溶剂的水溶液和与有机试剂相容性好的缓冲液组成,因而可避免水溶性物质不溶于RP-HPLC流动相的问。由于流动相的特点,检测器适合选择质谱检测器(MS)或蒸发光散射检测器(ELSD)。在分析亲水化合物时,HILIC的检测灵敏度通常会比RP-HPLC提高10,1 000倍。Goldschmidt等[21]同时比较了3种色谱柱(2种普通C18柱和1种HILIC柱),发现HILIC对VB1、VB6、烟酰胺3种WSVs的分离效果好,信号强度比反相色谱大,但对叶酸、生物素、VB2、泛酸无明显优势。Yang等[28]研究了亲水色谱柱的选择(纯硅胶柱、酰基柱、氨基柱)与流动相条件(pH值、流动相比例等)对HILIC-ESI-MS检测WSVs的影响,发现在pH 2,8范围内,中性和弱极性(尼克酰胺和氨基苯甲酸)的WSVs在HILIC上基本无保留,而酸性维生素(尼克酸和叶酸)和碱性维生素(硫胺素和吡哆醇)在色谱柱上均有保留,且保留特性不同。 3.3 检测器 根据WSVs的结构特征,目前在液相色谱中采用的检测器主要包括:紫外/二极管阵列检测器(Ultraviolet/Diode array detector,UV/DAD)、荧光检测器(Fluorescence detector,FLD)、质谱检测器(Mass detector,MS)等。由于多种WSVs中具有生色团(羧基、醛基、共轭双键等),因此紫外检测器适宜于几乎目前已知的全部WSVs,而且,检测器分析成本低,操作简单,也是目前使用最为广泛的检测器[29,30];同时,选择离子对 试剂,可增加保留时间,优化部分维生素的峰形[31]。而采用DAD检测器还可获得色谱峰的紫外-可见光谱,因此可以通过色谱峰保留时间和光谱图实现双参数定性,最大程度避免假阳性结果。对于痕量WSVs而言,该UV/DAD已经不适合这类维生素的检测。对于这类WSVs,采用FLD或者MS检测器,能提高检测的灵敏度。目前,主要有两类维生素可通过FLD分析:其一,自然产生荧光的,如VB6和VB2可以无需衍生直接检测[32],其二,不能产生荧光的WSVs需要衍生或其他化学修饰,如VB1在碱性介质中被铁氰化钾氧化发生蓝色的荧光,采用FLD检测,定量限为0.05 mg/100 g[1];在分析VB5时,采用柱后衍生将VB5衍生合成荧光化合物,检出限达0.65 μg/g[33]。但是,由于不同WSVs的处理过程往往不能统一,FLD常用于同时分析具备天然荧光特征的WSVs;并且,由于仪器的限制,很难同时设置多组激发波长与发射波长来测定WSVs。因而,FLD并不普遍用于WSVs的联合检出。 采用MS检测器(Mass spectrometry,MS)分析WSVs,是近几年报道的一类检测方法。质谱分析,特别是串联质谱联用可检测多种基质中的WSVs含量[14,34-36],具有更高的特异性和灵敏度。王一红等[37]采用反相液相色谱分离10种水溶性维生素,用电喷雾正离子源进行离子化,选择反应监测方式(SRM)进行监测,三重四极杆质谱测定,检出限达0.1,0.8 ng/L。Zand等[14]采用LC-MS分析婴幼儿食品中的VB2、VB6,检出限达0.07 μg/mL。MS在分析不含生色基团的维生素时有明显优势,并且无需加入对色谱柱有影响的离子对试剂,但是由于串联质谱结构复杂,维护成本高,因而该方法尚未普遍用于WSVs的分析。 4 小结 相较于传统的微生物法、分光光度法,HPLC法在检测单一或多种WSVs 时都更加快捷、灵敏、准确。随着分析化学技术的发展,国内外各食品、 药品检测标准都倾向于选择HPLC法,但仅涉及单一WSVs的检出,联合检 出方法还在实验室摸索阶段。近10年来,随着许多灵敏、高效的HPLC联 合检出方法不断产生,建立准确、快速的WSVs联合检测技术、并制定相 关标准,不仅有助于评价相关食品、保健品的营养指标,也与日益发展的 食品、药品加工技术相配套,为科学、合理地服用维生素制品提供参考。 参考文献: [1] GB 5413.11—2010,食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维 生素B1的测定[S]. 2010,食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维 [2] GB 5413.12— 生素B2的测定[S]. 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