重组屋尘螨变应原突变体的免疫原性与过敏原性的研究（可编辑）

重组屋尘螨变应原突变体的免疫原性与过敏原性的研究（可编辑） 重组屋尘螨变应原突变体的免疫原性与过敏原性的研 究 泸州医学院 硕士学位论文 重组屋尘螨变应原突变体的免疫原性与过敏原性研究 姓名:刘春华 申请学位级别:硕士 专业:内科学 指导教师:李国平 20090401 重组屋尘螨变应原突变体的免疫原性与过敏原性研究 摘 要 目的:支气管哮喘 简称哮喘 是一种常见的变态反应性疾病，其 发病率呈逐年上升趋势，它是由多种炎症细胞及炎性介质参与的气道 慢性炎症性疾病。其特征是特应性个体异常增高的Th2型反应，Th2 型反应现为增多的Th2细胞及其分泌的细胞因子，如白细胞介素 的作用。哮喘的发生与过敏原暴露密切相关，其中屋尘螨变应原是诱 发哮喘及其它变态反应性疾病最重要的变应原之一。据估计，全球约 10,的人口对尘螨过敏，约80,的外源性哮喘由尘螨引起。屋尘螨 过敏原含有多种过敏原成分，其中以I型、II型过敏原 Der pl、Derp2 所占比例最大，且对Derpl、Derp2过敏的患者亦最多，故Derpl与 Der p2是非常重要的过敏原。研究已证实，哮喘与过敏性鼻炎患者血 清中屋尘螨Derp2抗原特异性IgE抗体阳性率为70-,90,，许多儿 童在较早年龄即接触屋尘螨抗原，大约30,形成Th2型反应，表现为 对屋尘螨抗原特异性IgE升高和皮肤试验阳性。应用尘螨变应原各种 制品免疫治疗是此类疾病唯一的病因疗法。然而，目前采用的提取屋 尘螨蛋白疫苗进行临床防治还存在很多问题，从而限制了变应原浸液 在临床上广泛使用。据文献报道变应原免疫治疗全身不良反应事件的 发生通常在5一-35,，部分文献报导38,患者在免疫治疗过程中至少有 一次全身不良反应事件:由于提取蛋白疫苗诱导高水平IgE抗体，导 致部分接受提取蛋白疫苗免疫治疗患者症状发作或加重，而不得不停 止免疫治疗。因此，研究高质量、安全的变应原疫苗是当前国内外该研 究领域的热点问题。在变态反应学研究中，重组变应原由于成分单一， 容易标准化，同时重组变应原具有与天然变应原相同的免疫原性，非 常适用于变态反应疾病的诊断。也可以通过基因工程技术减少重组变 应原IgE结合的抗原表位，有效降低IgE介导的过敏反应，同时保留 变应原T细胞识别所必须的结构域，能增加治疗的疗效。我们通过基 因合成的方法删除屋尘螨Derp2变应原的的IgE抗原表位，并通过基 因工程获得重组Der p2突变体，旨在阐明重组Derp2突变体的免疫 原性，为特异性免疫治疗与变应原疫苗研制提供理论基础。方法:通 过基因合成的方法删除屋尘螨Der p2变应原的部分氨基酸残基的基因 序列，将编码基因定向克隆到pET32a原核表达质粒中，在大肠杆菌中 BL21 诱导表达Der p2重组蛋白。使用E(Z(N(A(??质粒小量提取试剂 R I,Eco 盒，按照进行重组DerP2,pET32a质粒提取，经Nde I双酶切鉴定Der P2,pET32a重组质粒后，将DerP2,pET32a重组质 粒转化到BL21表达菌。挑选几个菌落分别置于含氨苄青霉素的LB液 体培养基中，振荡培养2小时，加入IPTG诱导，继续振荡5小时。经 1296 SDS―PAGA鉴定有DerP2突变体表达的菌落大量扩增诱导。收集 菌体，超声破碎菌体。根据多聚组氨酸尾重组蛋白的特性，采用BIO―RAD 蛋白层析系统，取上清，在变性条件下用镍亲合柱层析法分离纯化重 组蛋白。将层析收集到的主峰收集液进行复性。将18只Balb,c小鼠 随机分为重组Der p2、Derp2突变体组、对照组。分别用重组蛋白及 与IgG2a抗体变化，用免疫斑点试验测定Derp2突变体的IgE结合 10(0软件作统计学处理，进行单因素方 能力。实验数据结果用SPSS 为差异有显著性。结果:l、用NdeI,EcoRI双酶切鉴定DerP2,pET32a 重组质粒，可切下大小在393bp左右的DNA片段，大小与预期结果一 致，表明Der P2,pET32a重组质粒有目的基因。成功构建了Derp2突 变体原核表达质粒，表达与纯化重组Derp2突变体;2、Balb,c小鼠 腹腔免疫后O天，Der p2突变体组与重组Der 与IgE抗体无明显差异 P O(05 :腹腔免疫后7天，Derp2重组突 变体组诱导IgGl抗体的产生与重组Derp2组无差异 P O(05 ，但 Der p2重组突变体组诱导IgE抗体的产生低于重组Derp2组 P O(01 ，Der p2突变体组IgG2a抗体高于重组Derp2组 P O(05 : 腹腔免疫后14天，Der p2突变体组IgE抗体的产生低于重组Derp2 组 P 0(01 ，Der p2突变体组IgGl低于重组Derp2组 P O(01 。 3、用屋尘螨过敏患者的阳性血清通过免疫斑点试验测定屋尘螨Derp2 突变体及其屋尘螨重组Der p2变应原的IgE结合能力，以正常人血清 为对照。结果表明:屋尘螨提取液与重组Derp2变应原同屋尘螨过敏 患者的阳性血清具有较好的结合能力，重组Derp2突变体与屋尘螨过 敏患者的阳性血清结合能力明显较低。结论: 1、成功构建屋尘螨Der p2变应原突变体的原核表达质粒，经双酶切及测序检测结果可靠。2、 显减少IgE抗体的产生。3、屋尘螨提取液与重组Derp2变应原同屋尘 螨过敏患者的阳性血清具有较好的IgE结合能力，重组Der p2突变 体 与屋尘螨过敏患者的阳性血清结合IgE能力明显较低。 关键词:屋尘螨:变应原突变体;免疫原性;过敏原性 T ? ??? ? _? ? ????? ? ? anQ 0IrecomDlnant 1mmunogenlclWailergenlciW Der2mutant P Abstract asthmaisacommon disease，the 0bject:Bronchial allergic incidencerateshowedan trend after isCausea upwardyear year'it by of cellsand mediatorsthatleadstothe inflammatory variety inflammatory involvementinchronic inflammatoryairway by individualsinwhichthereisanabnormalincreaseofthe atopic Th2-type resultstoanincreaseinthe of response(Th2-typeresponse performance theTh2 cellsandtheirsecretionof suchas cytokinesinterleukin一4 IL一4 ， an roleattheoccurrence IL一5，IL-9，IL-13，etc，which mayplayimportant and ofasthma(Theoccurrenceofasthmais relatedto development closely asthe to of themost which exposureallergens(One importantallergen inducedal asthmaandotherrelateddiseasesishousedustmite lergic isestimatedthatabout10,ofthe are to allergens(It populationallergic dust about80,of asthmaiscauseddust mites，and exogenous by mites( inhousedustmitecontain which Allergens multipleingredients，oftype一1 and the type一2allergens Derpl，Derp2 constituteslargestproportion the to(Studies andalsoofwhichmostof areal have patients lergic that asthma whichis confirmed with and rhinitis dueto patients allergic housedustmite from Der 70―、― antigenp2-specificIgEantibody,ranged 90,(Around30,ofthe housedust childrenwhoare to mite many expose atan showsTH??-2 with housemite early response dust age specific antigen???? 5 levelsand skintest(The treatmentofsucha only IgE positive appropriate diseaseis ofdustmite byapplication allergen for thecurrenthousedustmiteextract vaccineclinical protein prevention of farlimits andtreatmentstillexistalot the questions，andby allergen been inthe extractandusedinclinical(Ithas literatureof reported allergen adverseefffects at5,3 immunotherapy,systemicusuallyhappen 5,，and 38,ofthe casesoftreatmentin after reported treatment withatleastone adverse complains systemiceffects(Becausethe vaccine―inducedlevelof extract of high protein IgE which the hence hasto aggravatessymptoms，andimmunotherapystop( The ofa vaccine athomeandabroadis study high-quality,safeallergen ahotresearchfield research the currently study(In allergy study,since recombinant is with tostandardize allergencomponentsingle，itseasy recombinantofthesamenaturalal allergens lergen itsvery tothe of diseases(Also applicablediagnosisallergic through’ genetic for toreduce engineering，techniquesrestructuringIgEbinding allergen reducethe reactions epitopes，effectivelyIgE―mediatedallergic and while Tcell domainwhichis allergensretainingrecognition required to the increase oftreatment(Wethemethodof efficacy adopted gene toremovehousedustmite Derof synthesis allergenp2 IgEepitopes，and through toobtainmutantrecombinantDer geneticengineering p2， Derp2 seeks to the ofmutantsfor reorganization clarifyimmunogenicityspecific 6 with and atheoreticalbasisforvaccine provide Immunotherapyallergens of to themethod remove genesynthesis development(Methods:Through housedustmite Der oftheaminoacid p2part sequences allergen encoding clonedinto Escherichia plasmid，in gene pET32aprokaryoticexpression the ofrecombinant Der a coli BL21 inducedexpression proteinp2(Use smallamountofEZNA?PlasmidPurification toDer Kit，according 2a Manual NdeI,EcoRI P2,pET3restructuringplasmidextraction，the double ofrecombinantDer afterthe digestion plasmidP2,pET32a recombinantDer wastransformedinto ,pET32a plasmidP2 expression BL21 bacteria(Severalwere coloniesselectedwith attheLB ampicillin oscillationculturedfor2 medium，the IPTG liquid induction， hours，adding 5 hourscontinueto 12,SDS-PAGAidentifiedDerP2 oscillation(By mutant induceda numberof colony expression bylarge cellcrusher(Basedon tail collection，ultrasonic poly―histidine characteristicsoftherecombinant BIO―RAD protein，using protein chromatography the underthe system，takesupernatant，denatured conditionsusedinthenickel column affinity separation chromatography and ofrecombinant becollectedfromthemain purification protein(Will mice peak renaturationcollection(To18Balb,c chromatographyliquid were dividedintorecombinant mutantand Der randomly p2，Der group p2 the control mutant of recombinantandimmunization group(Were protein mice immunosorbent serum usingenzyme-linked assay ELISA ofIgE， 7 l and testwithDer mutant changes p2 IgG IgG2aantibody immunospot of 1 resultsthe data SPSS0(0 bindingcapacity(The experimentalusing IgE softwareforstatistical SNK ANOVA，with processing，conductone―way Law of SNK variance，P O(05 Comparative22 forinter-groupanalysis forthedifference was Results:1、DerP2,Pet32a significant( recombinantwas NdeIandEcoR a plasmid I，it digestedby got393bp DNA whichwasthesamewith of fragment anticipation(Expressplasmid Der mutantwasconstructed recomdinationwas p2 successfully(The GI G2a and werenot obtained(2、Igantibody，IgantibodyIgEantibody differentbetweenrecombinationDer andrecombination significantly p2 Der mutant in0 G1 wasnot p2 groups day P O(05 (Igantibody differentbetween recombinationDer andrecombination significantly p2 Der mutant in7 in p2 groups day 尸 O(05 ，but IgEantibody recombinationDer mutant waslowerthanthatin p2 group recombinationDer in7 G2a in p2group day P 0(01 (Ig antibody recombinantDer mutant was thanthatinrecombinant p2 grouphighter Der n7 inrecombinationDer p2groupday P O(01 (IgEantibody p2 mutantwasmorelowerthanthatinrecombinationDer in group p2group 14 G2a inrecombinantDermutant day 尸 0(01 (Ig antibody p2 group wasmore thanthatinrecombinantDer n14 highter day P O(0 p2group 1 ( 3、Withhouse dustmite in with allergy serum， patientspositive determinationthe ofhouse immunodotting IgEantibodybindingcapacity 8 dustmiteDerandmutantsofrecombinanthousedustmite Der p2 allergen normalserBmasthecontrol resultsshowedthat: House p2(To group(The dustmiteextractsandrecombinant withhousedustmite allergensDerp2 in with serum hasa allergypatientspositiveIgE good antibody binding ofrecombinantDer andhousedustmite in capacity(Mutant p2 allergy with serum patientspositive IgEantibodybindingcapacity significantly lower(Conclusion:1、Weconstructed ofDermutant express plasmidp2 andthatresultwas reliable and method(2、The bydigestion sequencing mice recombinantDermutanthad increased 1 and receiving p2 IgG2a，IgG weak mite 3、Housedust extractsand IgEantibodyresponses( recombinant withhousedust in allergensDerp2 mite with allergypatients serum hasa of Mutant positive IgEantibodygoodbindingcapacity( recombinant Derandhousedustmite in with p2 allergypatientspositive serum lower( IgEantibodybindingcapacity significantly Keywords:Dermatophagoidespteronyssinus;Derp2mutant Immunogenicity;Al lergenicity 9 英汉缩略词对照表 英文缩写英文全称 中文全称 Der P dermatophagoides 屋尘螨 pteronyssinus ELISA immunosorbent enzyme―linked assay酶联免疫吸附 试验 Ig ine Immunglobul 免疫球蛋白 IL Interleukin 白细胞介素 HRP Horseradish peroxidase 辣根过氧化 物酶 IL(4 interleukin(4 白介素(4 IL(13 interleukin(13 白介素(13 PCR chainreaction polymerase 反转录聚合 酶链反应 10D integral 积分光密度 opticaldensity PBS bufferedsaline Phosphate 磷酸盐缓冲 液 eDNA DNA complementary 互补脱氧核糖核酸 泸州医学院毕业硕士研究生 学位论文独创性声明及发表承诺书 本人声明所呈交的学位论文 已整理成发表形式 是我个人在泸州医学院导 师指导下，由导师及泸州医学院提供一切科研条件的情况下进行的研究工作及取 得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它 究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献机构已经发表或撰写过的研 均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。在即将毕业离校之际，本人郑重承诺: 该论文将以泸州医学院的名义发表 论文作者为研究生及导师，作者所在单位为 泸州医学院 ，并在发表后立即将发表论文原件 期刊 寄与导师l册。 学位论文作者签名: 导师签名: 日期: 年 月 日 日期: 名年 9月 (V，， 泸州医学院硕士学位论文版权使用授权书 本人完全了解泸州医学院有关保留、使用学位论文的规定，即:泸州医学 院有权保留并向有关部门或机构送交本人学位论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅，允许有关部门或机构以电子出版物形式出版发行，并对外进行全 文内容服务。本人授权泸州医学院可以将本人学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，进行数字化处理汇编、通过网络或其它途径进行交流传播， 可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印、扫描或其他复制手 段保存和汇编学位论文，即泸州医学院具有本人学位论文的数字化制品复制权、 信息网络传播权和汇编权。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录 到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。 保密 口 年解密后适用本授权书。 本人提交的学位沦文属 密 纯‖ 框内 打 “ 不? 保0 请文 在作 导师签名: 上签( 方名户 :弓 ?， 导师签章: 以者年编 码: 日期: 政: : 学日地联电 位期址系子 0论:及电信 邮话箱: 57 前 言 螨亚纲 Acari ，广泛存在于人类生活和工作环境中，其排泄物、代谢 物及螨体均具较强的变应原性，可引起螨性哮喘、异位性皮炎、过敏 性鼻炎等I型变态反应性疾瘸。与人类变态反应有关系的螨仅是少数 几种，如屋尘螨、粉尘螨、和宇尘螨等。屋尘螨主要生活在卧室内的 被褥、床垫、枕套以及入的衣服上，以身上脱落下来的皮属为食饵， 国内外大量的临床资料，尘螨是一种强有力的致敏原，引起过敏 的原因是螨的尸体粪便卵及脱落下的皮壳，随着漂浮的灰尘被吸入到 人的呼吸道内而发病。在北方，每年春秋两季是尘螨的繁殖高峰，此 时室内及粮食内含螨量最高:南方空气潮湿，更利于尘螨的生长繁殖。 对尘螨过敏的病人常常是全年都发病，在尘螨繁殖季节，可使症状加 重。 国内学者焉粉尘螨浸液对哮喘患者进行皮肤点刺试验，47, 敏珏1。WongGW等通过过敏原皮肤点刺实验和支气管激发试验分析了北 京、广州和香港儿童在喘息发作和气道高反应与过敏原之间的关系发 现，北京、广州和香港儿童在喘息发作和气道高反应与屋尘螨和猫毛 过敏原之间存在明显相关性心1。LeungR等研究也发现香港等城市有哮 喘或其他过敏性疾病的儿童屋尘螨过敏原皮肤点刺实验的阳性率为 95,，认为屋尘螨过敏原是导致过敏最常见的二种主要过敏原?3。《哮 喘全球防治策略》指出，哮喘每年造成的直接或间接损失达100亿美 元n3(随着工业化的发展，人民生活水平的提高，此类疾病的发生不 但不下降反而呈上升趋势阽1。 气道高反应、气道炎症与血清高的IgE水平是哮喘主要特征之一， 子水平相关。来源于ThO、Th2、肥大细胞和嗜酸性粒细胞等的IL一4， 刺激肥大细胞增殖及幼稚ThO淋巴细胞向Th2淋巴细胞的分化，促进 VCAM一1表达、嗜酸性粒细胞趋化因子的产生，对抑制Thl型应答起着 关键的作用，它在哮喘的发病中表达升高，导致了B细胞合成IgE的 增加、嗜酸细胞的聚集和Th2型类别转换，是介导过敏性气道炎症的 喘时抑制性细胞因子分泌减少，气道炎症加重，表明CD4+CD25+T细胞 对哮喘的发生具有调节和抑制作用阳tml。 特异性免疫治疗被认为是目前唯一哮喘病因治疗方法，即通过逐 渐增加、反复皮下注射特异性变应原，提高患者对特异性变应原的免 疫耐受力，调节患者细胞免疫功能，增强Thl反应，抑制Th2反应， 并产生高水平的IgG抗体阻断变应原结合到IgE，以提高患者对特异 性变应原的免疫耐受力，还可以改变支气管哮喘病程、阻滞症状的恶 化和防治对新的过敏原产生过敏反应乜??11-15]。有研究表明，质粒DNA 疫 苗可有效抑制过敏原所诱导的肺部变应性炎症，抑制Th2型细胞因子 的释放n 61。目前患者的过敏原检测与特异性免疫治疗主要通过变应原 ? 浸液，但其成分较复杂，是蛋白质、糖蛋白和低分子量物质组成的复 杂混合物，所以很难进行变应原标准化，且在治疗中长期使用易导致 严重IgE介导的过敏反应，如可发生红晕、肿胀、硬结、坏死等局部 反应和休克、喉头水肿、支气管痉挛、荨麻疹、血管性水肿、全身性 红斑等全身反应…。引。在变态反应学研究中，重组变应原由于成分单 一，容易标准化，同时重组变应原具有与天然变应原相同的免疫原性， 非常适用于变态反应病的诊断n利;同时也可以通过基因工程技术减少 重组变应原IgE结合的抗原表位，有效降低IgE介导的过敏反应，同 时保留变应原T细胞识别所必须的结构域，能增加治疗的疗效n8|。屋 对屋尘螨II过敏源产生细胞与体液免疫应答，故屋尘螨变应原疫苗的 研制具有重要的理论与现实意义。我们通过通过基因合成的方法删除 屋尘螨Der p2变应原的的IgE抗原表位，并通过基因工程获得重组 Der p2突变体，旨在阐明重组Derp2突变体的免疫原性，为特异性 免疫治疗与变应原疫苗研制提供理论基础。 与方法 1 实验材料与仪器 1(1 实验动物 购于成都四川大学华西医学部实验动物中心。 2主要实验试剂 2(1主要试剂 2。1(1TOPIO大肠杆菌泸州医学院炎症与变态实验室提供 2(1(2BL21大肠杆菌 泸州医学院炎症与变态实验室提 供 2(1(3Ni+一NTA琼脂糖 Invitrogen公司 2(1(4 12Kd透析袋 上海生工 2(1(5 I、EcoRI 限制性内切酶:Nde 大连宝生物工程 公司 2(1(6 E(Z(N(A(??质粒小量提取试剂盒美国omega生物技术公司 2(1(7胶回收试剂盒 美国OIAGEN公司 2(1(8重组屋尘螨Der 132变应原 炎症与变态实验室提供 2(1(9重组pET32a质粒 炎症与变态反应实验室 2(1(1l羊抗鼠辣根过氧化物酶偶联IgGl抗体美国SouthBiot公司 2(1(13 ELISA试剂盒 深圳晶美公司 2(1(14屋尘螨过敏患者的阳性血清 泸州医学院附属医院呼吸科 2(1(15正常人血清 泸州医学院附属医院呼吸科 2(1(16 DNA聚合酶 美国Fermentas公司 PCR试剂盒pfu 2(1(17T4DNA连接酶 大连宝生物工程公司 2(2培养基与溶液的配制 2(2(110×TAE电泳缓冲液: Tris碱 48(49 EDTA 9(39 冰醋酸 11(42ml 调PH至8(2，加水到1000ml，作为母液保存，用时稀释。 2(2(21,琼脂糖凝胶: 200mg琼脂糖加入20ml1×TAE电泳缓冲液 2(2(3 LB液体培养基: 蛋白胨 109 酵母提取物 59 NaCl 109 体积1升，高压蒸汽灭菌20分钟，4。C保存。 2(2(4 LB固体培养基: LB液体培养基中每升加129琼脂粉，高压灭菌，4。C保存。 2(2(510×上样缓冲液 0(25,溴酚蓝与40, w,v 蔗糖水溶液混匀，4。C保存。 2(2(6磷酸盐缓冲液 PBS : 14 KCL 0(29 KH2P04 0(29 NaCl 8(Og Na2HP04??7H20 1(569 先后溶于800ml去离子水，混匀加去离子水至总体积1升，高 压蒸汽灭菌20分钟，4"C保存。 2(2(7包涵体洗涤液I: mM 2,Triton一100，50 mM mM (0，150NaCl，10 Tris盐酸，PH8 EDTA 2(2(8包涵体沈涤液II: n$t Tri 50mMNacl 2M尿素，50 S盐酸，1 2(2(9包涵体溶解液: 8 mM M尿素，50 Tris盐酸，150n$tNaCl 2(2(1030,丙烯酰胺: 蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至50ml，过滤， 储于棕色瓶，4?避光保存。 2(2(11十二烷基硫酸钠SDS溶液: IOgSDS，用双蒸水溶解至200ml，室温保存 2(2(12分离胶缓冲液 1(5mmol,L Tris-HCL，pH8(8 : 9(089Tri s溶解在40ml双蒸水中，用4M盐酸调节pH至8(8，在 用双蒸水稀释到50ml终体积，过滤后4。C保存。 Tri 2(2(13浓缩胶缓冲液 O(5mmol,L s-HCL，pH6(8 : 双蒸水稀释到50ml终体积，过滤后4"C保存。 2(2(142xSDS―PAGE加样缓冲液: 0(5mol,L pH6(8 Tris缓冲液8ml，甘油6(4ml，IO,SDS12(8ml， 巯基乙醇3(2ml，0。05,溴酚蓝1(6ml，H20 32ml混匀备用。 2(2(15Tris一甘氨酸电泳缓冲液: 0(25mol,L Tris一1(92mol,L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。 2(2(16 SOC培养基: 2,蛋白胨，0(5,酵母提取物，lOmM NaCI，2(5mMKCl，lOmM MgClz，lOmM MgSO。，20mM葡萄糖。 3主要实验仪器 3(1 低温离心机 美国 Sigma公司 3(2 水平电泳仪 美国BIO―RAD公司 3(3 PCR扩增仪 英国Hybrid公司 3(4 超净工作台 苏州净化设备公司 (5 -20?冰箱 广州华菱3 公司 3(6 -80 oC冰箱 日本SANYO公司 3(7 纯水器 美国Barnstead公司 3(8 微量移液器 日本 Nichiryog公司 3(9 超低温高速离心机 Centrifuge 16 3(10凝胶成像分析系统 意大利BIO-RAD 3(11 酶标仪 芬兰Labsystems公司 3(12 4000删多功能成像仪 柯达公司 3(13 垂直电泳仪 美国BIO―RAD公司 3(14 IO―RAD蛋白层析系统 美国BIO―RAD公司 3(15 恒温摇床 美国Thermo公司 3(16 超净工作台 苏州净化设备公司 3(17 37?，5,C02孵箱 美国Thermo公司 3(18 DU800紫外分光光度计 美国贝克曼公司 4 实验方法 4(1目的基因DerP2的PCR扩增 通过基因合成的方法删除屋尘螨Der p2变应原的21-27、73―78、 118―1 cDNA基因修饰的片段 19氨基酸残基的基因序列，以含有Derp2 加上酶切位点，用于克隆入pET32a质粒。 4(1(1 Derp2的引物合成 由上海生工生物工程公司合成 : 上游 含有NdeI酶切位点 :5??一GCGG 3’ R 5‘一GCGG 下游 含有EcoI酶切位点 : G-AATTC PCR获得目的基因: PCR反应体系: l Primer lpL Primer2 lpL dNTPs 2(5mM 2pL 模板DNA 10ng,pL 5pL 10×buffer 5pL Pfu polymerase 2pL ddH20 34p,L Total 50?L PCR仪进行反应，循环条件如下: 94? 30s 57? lmin 72? 90s 产物。 4(1(3PCR产物的纯化回收 4(1(3(1琼脂糖凝胶电泳 微波炉加热l,2min，到气泡产生完全溶解时混匀，稍冷却后加入少 许EB 1l-q 混匀倒入制胶板，插入样品梳，凝固后取出梳子，放入 18 电泳槽，让电泳缓冲液1×TEE的液面高过胶面1、2ram。 3 电泳:电压90V，电泳时间25分钟。在紫外光下观察电泳情况， 泳。 4 分析:用凝胶电泳图像扫描仪进行凝胶电泳图像扫描，观察目 的条带。 4(1(3(1胶回收 取出琼脂糖凝胶，在紫外灯下切下目的DNA条带，按QIAquick GelExtraction Kit说明书步骤，称重后放入干净离心管中，加等体积 溶胶液，65"C水浴7分钟，期间翻转离心管数次，使胶块充分溶解。 将溶液加入已放在收集管的吸附柱，13000rpm离心30秒，倒掉废液， 秒，倒掉废液，吸附柱放回收集管，再次离心2分钟，将吸附柱放置 室温中晾干后放入另一干净离心管，在柱中加入65"C预热的洗脱液 Maker电泳，估计其含量。得到目的基因，5端引物 5pL与等量DNA 含Nde R I位点，3端引物含有EcoI位点。 4(2重组Der P2,pET32a原核表达质粒构建 R I和EcoI双酶切 4(2(1回收PCR产物及pET32a质粒的Nde lq 按下列分别加入试剂: 37"C恒温水浴1小时，65?10min灭活酶 4(2(2酶切片段的纯化回收 在紫外光下切下预期酶切片段，使用胶回收试剂盒，按照说明书 进行纯化回收。取回收产物2“L，稀释70倍，在紫外分光度仪上测定 其OD值260nm，另取回收产物2肛L，在l,的琼脂糖凝胶电泳，确定 DNA浓度。( 4(2(3酶切片段Derp2 cDNA基因的PCR产物与pET32a质粒连接 按下列分别加入试剂: 16。C恒温水浴16小时，65"C10min灭活酶 4(2(4转化 4(2(4(1转化平板的制备: 1 配制LB液体培养基: 在950mi纯水中加入细菌培养用胰蛋白胨lOg、酵母提取物59、 NaCl lOg，摇动使其完全溶解，用5mol,LNaOH调节PH值7(0，加入纯水， 2 制备LB琼脂平板: 在含IOOmlLB液体培养基烧瓶中加入1(2克细菌培养用琼脂，高 压灭菌20分钟，取出烧瓶并轻摇使琼脂分散均匀，待冷却至50。C， 加入浓度为i00 ug,ul的氨苄青霉素lOOul，混匀后倾出培养基，制 备平板。 4(2(4(2感受态细胞的制作: 停止培养。 2 在无菌条件下将菌液转入到EP管，冰浴5min。 3 4?，13000 rpm,min，30秒回收细胞。 4 弃上清，加入预冷的O(1M的Catl2500ul，重悬菌体，冰浴5 min。 5 4"C，13000 rpm,min，30秒回收细胞。 6 弃上清，再加入O(1M的CaCl2 时，即用于转化。 4(2(4(3连接产物的转化 加入5 加入SOC培养基800 回收细胞，加入到含氨苄青霉素 100ug,m1 的LB固体培养基，铺板， 37?培养过夜。 4(2(5重组克隆的筛选、双酶切鉴定 将构建的重组DNA转化大肠杆菌，在含氨苄青霉素的LB培养基上 随机挑取10个单菌落，培养后提取重组质粒DNA，以此重组DNA为模 板用PCR扩增DerP2片段。 R 取提取的重组DerP2,pET32a质粒，用NdeI,EcoI双酶切鉴 定DerP2,pET32a重组质粒: 按下列须序加入试剂 NdeI lul C0R h1 P― 旦 T― a― O― O厶一I,，一 E一 3一o厶一 质一出个一l业一 一 n一 e―nHr一―川 j X以 一芭一 37。C 3小时，65。C lOmin灭活酶，取回收产物lOul，在1,的琼 脂糖凝胶电泳，确定是否含有插入