罗库溴铵对大鼠正常或损伤面神经与肢体神经肌接头突触前膜乙酰胆碱量子式释放的影响

罗库溴铵对大鼠正常或损伤面神经与肢体神经肌接头突触前膜乙酰胆碱量子式释放的影响 罗库溴铵对大鼠正常或损伤面神经与肢体神经肌接头 突触前膜乙酰胆碱量子式释放的影响 麻醉学基础研究 中青年优秀论文评奖 罗库溴铵对大鼠正常或损伤面神经与肢体神经肌接头突触前膜乙酰胆碱量子式释放的影响 陈君亮1,陈莲华2 1发言作者:复旦大学附属眼耳鼻喉科医院麻醉科,上海,200031; 2通讯作者:上海交通大学附属第一人民医院麻醉科,上海,200080 通信作者:陈莲华(E-mail:chenlianhua@citiz.net) 国家自然科学基金面上项目(30872428) 【摘要】目的 比较大鼠正常或损伤面神经和肢体神经肌接头在不同浓度罗库溴铵作用下突触前膜乙酰胆碱量子式释放的数量,观察正常或损伤面神经和肢体神经支配的肌肉对罗库溴铵的敏感性差异是否与三种神经肌接头突触前膜神经递质释放功能有关。方法 采用自体对照设计,制备大鼠右侧面神经主干急性压榨伤模型,左侧为正常对照侧;分别取双侧面神经主干及相连接的口轮匝肌肌条和肢体神经主干及相连接的腓肠肌肌条,用细胞内微电极法测定三种神经肌接头的终板电位(EPP)和微终板电位(MEPP);分别在相当于大鼠0.5ED95、ED95、1.5ED95、2ED95血药浓度的罗库溴铵梯度浓度孵化下记录EPP和MEPP,比较正常面神经、损伤面神经和肢体神经突触前膜乙酰胆碱量子式释放(EPP/MEPP)的差异。结果 三种神经肌接头的EPP都随着罗库溴铵浓度的增加而 呈剂量依赖性地降低,在不同浓度罗库溴铵水平下,损伤面神经的EPP降低较之于正常面神经明显,而肢体神经降低更明显,差异有统计学意义(P0.05);三种神经肌接头的MEPP都降低,正常面神经、损伤面神经和肢体神经之间的差异没有统计学意义(P0.05)。三种神经肌接头的EPP/MEPP都随着罗库溴铵浓度的增加而呈剂量依赖性地降低,在2.5μg /ml浓度罗库溴铵水平下,损伤面神经的EPP/MEPP降低较之于正常面神经明显,而肢体神经降低更明显,但差异没有统计学意义(P0.05)。在5μg /ml、7.5μg /ml和10μg /ml浓度罗库溴铵水平下,损伤面神经的EPP/MEPP降低较之于正常面神经明显,而肢体神经降低更明显,差异有统计学意义(P0.05)。结论 罗库溴铵对正常或损伤面神经和肢体神经肌接头突触前膜乙酰胆碱的量子式释放功能呈现不同程度的抑制作用,按抑制程度从大到小次序排列为肢体神经、损伤面神经和正常面神经,这种差异可能是造成三种神经肌接头对罗库溴铵敏感性差异的原因之一。 【关键词】罗库溴铵;突触前膜;乙酰胆碱;量子式释放 The effect of rocuronium on presynaptic quantal release of acetylcholine from normal or damaged facial nerve and somatic nerve innervated neuromuscular junctions in rats CHEN Jun-liang1, CHEN Lian-hua2 1Department of Anesthesiology, The Eye Ear Nose and Throat Hospital, Fudan University, Shanghai 200031, China 2Department of Anesthesiology, The affiliated first people’s hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai, 200080, China Presenting anthor: CHEN jun-liang Corresponding author: CHEN lian-hua, Email: chenlianhua@citiz.net [Abstract] Objective To compare the amount of presynaptic quantal release of acetylcholine from normal or damaged facial nerve and somatic nerve innervated neuromuscular junctions under the effect of different concentrations of rocuronium in rat in vitro. To evaluate whether the differences in sensitivity to rocuronium among the normal or damaged facial nerve and somatic nerve innervated muscles are related to the function of presynaptic neurotransmitter release. Methods Autologous paired controlled design was used in the study. An acute nerve trunk squeeze injury model was induced in the right facial nerves of the rats and the left facial nerves were used for control. The facial nerve trunks from both sides with the connected orbicularis oris muscle strips and the somatic nerve trunks with the connected gastrocnemius muscle strips were isolated for measuring the endplate potentials EPP and the miniature endplate potentials MEPP from the three groups of neuromuscular junctions by using intracellular microelectrode gauge. The EPPs and MEPPs were recorded at rocuronium concentrations equivalent to the blood levels that produced the 0, 0.5ED95, ED95, 1.5ED95 and 2ED95 responses, and then, the presynaptic quantal release of acetylcholine which was calculated from the values of EPP/MEPP was compared among normal or damaged facial nerve and somatic nerve innervated neuromuscular junctions. Results The EPPs and MEPPs from all the three groups of neuromuscular junctions exhibited a dose-dependent decreasing as the concentration of rocuronium increased. At rocuronium concentrations of 2.5, 5, 7.5 and 10μg/ml, the extent of decreasing in EPPs of damaged facial nerves was significantly bigger than that of normal facial nerves, and that of somatic nerves was the biggest P0.05, while no significant difference was found for the comparisons of MEPPs among the three groups of neuromuscular junctions P0.05. EPP/MEPP of all the three kinds of neuromuscular junction exhibit a dose-dependent decrease against a concentration increase of rocuronium. In the 2.5μg / ml concentration level of rocuronium, EPP/MEPP of damaged facial nerves decrease more obviously than that of normal facial nerves, and body nerves EPP/MEPP reduction is even more obvious, but with no statistical significance P0.05. Whereas in the 5μg / ml、7.5μg / ml and 10μg / ml concentration level of rocuronium, EPP/MEPP of damaged facial nerves decrease more obviously than that of normal facial nerves, and body nerves EPP/MEPP reduction is even more apparent, with statistically significant differenceP0.05.Conclusion Rocuronium presents different levels of inhibition on presynaptic quantal release of acetylcholine in normal or damaged facial nerve and somatic nerve innervated neuromuscular junctions, the extent of inhibition was showed as the sequence of somatic nerve damaged facial nerve normal facial nerve. This kind of difference may be one of the reasons causing differences in sensitivity to rocuronium among the normal or damaged facial nerve and somatic nerve innervated muscles[Key words] rocuronium, presynaptic, acetylcholine, quantum release, facial nerve, somatic verve 面神经诱发肌电位(Evoked Electromyography, EEMG)监测作为术中面神 经保护的有效手段已在涉及面神经的手术中得到越来越广泛的应用[1,2]。但 是,EEMG监测依赖于面神经肌接头完整的电生理信号传递功能,在需行全麻的手 术,使用阻断神经肌接头的肌松药是施行面神经EEMG监测的最大顾虑。根据临床 经验,在相同的监测条件下,术前面神经功能受损者与面神经功能正常者相比,其EEMG反应基础值减小,监测的灵敏度也下降[3],因而肌松药在这类患者中的使用更需谨慎。我们前期的临床研究明:将部分外周神经肌肉阻滞技术(Partial Neuromuscular Blockade,PNMB)应用于需行面神经监测的中耳手术,可以既保留面神经肌接头传导功能,又确保四肢骨骼肌足够的制动[4];并且已经证实该技术的理论基础在于面肌和四肢骨骼肌对非去极化肌松药罗库溴铵的敏感性存在差异[5]。 在神经肌接头水平,非去极化肌松药的作用机制可能是多部位的,不仅作用于突触后膜的乙酰胆碱(Acetylcholine,ACh)受体,阻断神经肌接头传导,还能抑制突触前膜正反馈机制, 减少突触前膜ACh释放[6] 。在喉肌、膈肌和胫骨前肌的研究中发现,这些肌肉对非去级化肌松药的敏感性差异的原因也可能是多部位的,包括突触前膜ACh量子式释放量、突触后膜ACh受体的数目和密度、胆碱酯酶活性以及肌纤维的构成等[3,7]。但是,关于面神经支配的肌肉和四肢骨骼肌对罗库溴铵敏感性差异的作用部位还未见报道。 我们在已经完成的实验研究中证实:正常面神经、损伤面神经支配的口轮匝肌和肢体神经支配的腓肠肌对罗库溴铵的敏感性差异与神经肌接头突触后膜终板区乙酰胆碱受体密度及乙酰胆碱受体对罗库溴铵的亲和力的差异有关。鉴于罗库溴铵的作用机制可能不仅仅局限于突触后膜,因此本实验拟在前期实验研究基础上,进一步探讨正常或损伤面神经和肢体神经支配的肌肉对罗库溴铵的敏感性差异是否与三种神经肌接头突触前膜乙酰胆碱量子式释放功能有关。 材料与方法 实验动物与试剂: 成年雄性SD大鼠10只(复旦大学实验动物中心,清洁级),体重180~220g,饲养。罗库溴铵注射液(批号692482,荷兰欧加农公司),实验开始前10分钟稀释到所需浓度。 建立损伤面神经模型:戊巴比妥纳(45mg/kg)腹腔注射麻醉,常规消毒,暴露右侧面神经主干,用文氏止血钳压榨面神经主干,夹闭一扣长度2 mm,夹闭时间30s,然后缝合创口,左侧为正常对照。术毕以角膜刺激引起的瞬目反射消失作为面神经损伤的特征[7,8]。 检测指标及方法: 标本制备: 术后10天,戊巴比妥纳(45mg/kg)腹腔注射麻醉下,显露出咬肌表面面神经上下颊支,采用自体对照法,分别取正常侧和损伤侧面神经主干及相连接的口轮匝肌肌条和肢体神经主干及相连接的腓肠肌肌条(剪成沿肌纤维方向1.5-2.0 cm,肌纤维横轴方向2 cm的肌条),置于含kreb’s营养液(NaCl 135; KCl 5; CaCl2 2; NaHCO3 15; Na2HPO4 1; MgSO4 1; 葡萄糖 11;单位:mmol/L)的恒温浴槽内,95%O2+5%CO2通气灌注,恒温37?,pH保持在7.3左右[6]。 2.细胞内微电极记录: 将运动神经搭在刺激电极的钩内,两电极相距1mm,记录电极电阻15-25 MΩ,内灌3 mol/L醋酸钾。经SMUP-E型生物信号处理系统在PC机上输出,可见静息电位基础上出现微小的电位变化,即为自发的微终板电位(Miniature End-plate Potentials, MEPP)。然后用超强刺激,波宽为0.2ms、8V的方波,刺激运动神经,在解剖镜下找到肌肉非常轻微的收缩部位,把微电极插入与神经纤维连接的肌肉周围,经SMUP-E型生物信号处理系统在PC机上输出,记录终板电位 (End-plate Potentials, EPP)。静息30分钟,稳定后记录MEPP和EPP的基础值,EPP与MEPP的比值可反映突触前膜乙酰胆碱量子式释放的数目Quantal Release of Acetylcholine,EPP/MEPP [9] 。 3.罗库溴铵对EPP和MEPP影响程度的观察: 采用自体对照法,分别在浴槽中加入相应浓度的罗库溴铵溶液,观察不同浓度罗库溴铵作用下,每个肌条的EPP和MEPP的变化。分为正常面神经支配的口轮匝肌、损伤面神经支配的口轮匝肌及肢体神经支配的腓肠肌3组,每组10个肌条。罗库溴铵浓度分别为2.5μg/ml、5μg /ml、7.5μg /ml和10μg /ml(相当于大鼠0.5ED95、ED95、1.5ED95、2ED95的罗库溴铵血药浓度),采用累积剂量法,每个罗库溴铵浓度下孵化15min,记录EPP和MEPP,并计算出相应的EPP/MEPP,从而判断等效浓度罗库溴铵对三组神经肌接头突触前膜乙酰胆碱量子式释放数目的影响。 统计学处理: 所有数据以均数?标准差(?s)表示,采用SPSS 13.0软件做统计学处理,组内与组间均值用随机区组方差分析法,P0.05认为差异有统计学意义。 结果 三种神经肌接头的EPP和MEPP都随着罗库溴铵浓度的增加而呈剂量依赖性地降低,在不同浓度罗库溴铵水平下,损伤面神经的EPP降低较之于正常面神经明显,而肢体神经降低更明显,差异有统计学意义(P0.05);三种神经肌接头的MEPP都降低,正常面神经,损伤面神经和肢体神经之间的差异没有统计学意义(P0.05,表1,图1)。三种神经肌接头的EPP/MEPP都随着罗库溴铵浓度的增加而呈剂量依赖性地降低,在2.5μg /ml浓度罗库溴铵水平下,损伤面神经的 EPP/MEPP降低较之于正常面神经明显,而肢体神经降低更明显,但差异没有统计学意义(P0.05)。在5μg /ml、7.5μg /ml和10μg /ml浓度罗库溴铵水平下,损伤面神经的EPP/MEPP降低较之于正常面神经明显,而肢体神经降低更明显,差异有统计学意义(P0.05,表2)。 讨论 MEPP是神经肌肉接头终板区在静息时突触前膜个别囊泡自发的、随机的ACh释放引起肌膜的微小电位变化,它是由一个量子(一个囊泡)的ACh所引起的电位变化,此ACh释放称为量子释放。当多个量子(小泡)100-300个同步释放便产生局部的终板电位(EPP)。EPP不是全或无反应,其振幅随着末梢释放的ACh量连续改变。EPP振幅和EPP/MEPP比可以反映ACh释放的量。我们的实验中发现正常或损伤面神经和肢体神经肌接头EPP、MEPP和EPP/MEPP都随着罗库溴铵浓度的增加而呈剂量依赖性地降低,说明罗库溴铵干扰了突触前膜ACh释放。从MEPP和EPP/MEPP降低的结果,我们可以推测罗库溴铵减少了ACh释放的量,而MEPP反映的是ACh量子式释放,其ACh分子多少由囊泡内含量决定,所以从MEPP降低的结果,我们又可以推测罗库溴铵干扰了ACh量子释放的频率。非去极化肌松剂作用于突触后膜的乙酰胆碱受体阻断神经肌接头的传导,而罗库溴铵可能还有较强的突触前作用,我们实验中EPP、MEPP和EPP/MEPP的下降证明了这点,与Feldmam SA[9]、England[10]等研究一致。Tan YS[11] 、李传翔[12] 、Rowley KL[13]也证明罗库溴铵抑制突触前膜正反馈机制,减缓ACh由储存部向释放部运转,减少突触前膜ACh的释放。最近Suzuki等[14]在临床研究观察罗库溴铵在麻醉诱导期用于气管插管效应时也证实这种机制。EPP、MEPP和EPP/MEPP降低为什么与罗库溴铵浓度呈剂量依赖性?Van[15]推测罗库溴铵减少细胞外Ca2+,低 浓度的Ca2+减少MEPP振幅;Murali等[16]推测罗库溴铵同时作用于突触前N-乙酰胆碱受体与甘氨酸受体,在足够剂量时也将引起ACh释放量下降,随着罗库溴铵与受体结合的饱和度增加,引起ACh释放量下降也增加。 当罗库溴铵浓度大于5.0μg /ml时,正常面神经、损伤面神经和肢体神经的EPP和EPP/MEPP均降低,三组间有明显差异,而MEPP降低三组间没明显差别,这表明罗库溴铵对三类神经的神经肌肉接头突触前膜乙酰胆碱释放的影响不同,影响敏感度依次增高。在面神经临床监测中,我们也发现术前面神经功能损伤者与面神经功能正常者相比,EEMG反应的灵敏度下降,刺激阈值增加、振幅减小。Aimoni C等[3]证实损伤面神经对肌松药的敏感性也大于正常面神经。我们以往已发现面神经支配的口轮匝肌对非去极化肌松药罗库溴铵的敏感性明显低于肢体神经支配的腓肠肌,损伤面神经支配的口轮匝肌肌张力振幅基础值虽然低于正常面神经支配的口轮匝肌,但两者对罗库溴铵的敏感性并没有差异[5],同时证明其可能机制是肢体神经支配的腓肠肌终板区乙酰胆碱受体密度低于面神经支配的口轮匝肌,并且腓肠肌乙酰胆碱受体对罗库溴铵亲和力也大于口轮匝肌,损伤面神经运动终板乙酰胆碱受体密度较正常面神经低 。但临床监测却发现损伤面神经的EEMG监测敏感度较正常面神经低,因此我们推测神经损伤可能导致了突触前膜递质释放功能改变。当罗库溴铵浓度小于2,5μg /ml时,三组的EPP/MEPP降低不明显,推测造成神经肌接头突触前膜乙酰胆碱量子式释放数目的不同需要达到一定浓度的罗库溴铵,从而也证明ACh量子释放的大小是可调节的。 ACh的量子式释放是Ca2+依赖性的,Ca2+经局限于活性带的高阈值Ca2+ 通道进入[17];在突触前膜水平,不同的神经在同样的刺激下对乙酰胆碱的释放是不同的,这造成非去极化肌松药对不同的神经支配肌肉的敏感性不同[18];神 经兴奋传导的速度和轴突的直径、轴突受损情况有关。损伤面神经的轴突受损后和正常面神经的传导速度不一样,而肢体神经的轴突的直径和面神经不一样,由此可能因为正常面神经、损伤面神经和肢体神经传导速度不一样而导致使突触前神经末梢释放乙酰胆碱量有差异,故产生的终板电位和微终板电位大小不同。 对本实验影响的因素有:MEPP振幅的变化与基线噪音、小泡中ACh含量的波动、突触后受体密度的差异等有关;离体灌注的肌条上所带神经为末梢神经,电刺激末梢神经时神经轴突囊泡储存的神经递质释放受到神经主干损伤的影响;神经体液因素对EPP和MEPP的调节等。所以,关于罗库溴铵对神经肌肉接头的作用机制还有许多进一步研究的地方。 我们的试验证明了大鼠正常、损伤面神经和肢体神经肌接头在不同浓度罗库溴铵作用下突触前膜乙酰胆碱量子式释放的数量存在差异,这种差异与突触前膜神经递质释放功能有关。其次证明罗库溴铵可调节ACh量子释放的大小。 表1 罗库溴铵各浓度水平正常和损伤面神经及肢体神经EPP和MEPP比较 n10,?s 罗库溴铵浓度 0 2.5μg /ml 5μg /ml 7.5μg /ml 10μg /ml 正正常面神经 EPPmV 9.522?0.1429.218?0.116 7.993?0.044 7.459?0.077 6.714?0.075 MEPPmV 0.266?0.017 0.265?0.016 0.243?0.015 0.233?0.015 0.213?0.015 损损伤面神经 EPPmV 9.469?0.125 8.805?0.081 6.790?0.207 5.895?0.188 4.589?0.183 MEPPmV 0.273?0.015 0.261?0.014 0.233?0.017 0.214?0.016 0.182?0.015 费肢体神经 EPPmV 9.189?0.132 7.794?0.133 5.286?0.071 3.396?0.171 1.645?0.189 MEPPmV 0.270?0.024 0.237?0.019 0.197?0.016 0.157?0.015 0.114?0.012 罗库溴铵不同剂量处理组之间差异有统计学意义(P0.05),并随着剂量增加,电位值逐渐下降。正常面神经组及损伤面神经组与肢体神经组之间,EPP值差异有统计学意义(P0.05),MEPP之间差异无统计学意义(P0.05)。 表2 罗库溴铵各浓度水平正常和损伤面神经及肢体神经EPP/MEPP比较 ?s,n10 组别 罗库溴铵浓度 0 2.5μg /ml 5μg /ml 7.5μg /ml 10μg /ml 正常面神经 35.903?1.845 34.878?1.755 33.004?2.024 32.130?2.028 31.646?2.000 损伤面神经 34.759?1.549[1] 33.815?1.688[1] 29.130?1.992[2] 27.654?1.665[2] 25.348?2.000[2] 肢体神经 34.252?2.746[3] 33.067?2.481[3] 26.979?2.082[4] 21.741?1.488[4] 14.407?1.431[4] 罗库溴铵不同剂量处理组之间差异有统计学意义(P0.05),并随着剂量增 加,EPP/MEPP的比值逐渐下降。与正常面神经组比较,损伤面神经组 [1] P0.05,[2] P0.05;肢体神经组 [3] P0.05,[4] P0.05。 参考文献 王正敏. 耳神经外科术中神经监测.中国耳鼻咽喉头颈外 科.2004,113:137-138. 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