1大戟属植物化学成分与灭螺活性研究2酸枣仁汤物质基础及其药理试验研究（可编辑）

1大戟属植物化学成分与灭螺活性研究2酸枣仁汤物质基础及其药理试验研究（可编辑） 娶 分类号????? 密级??一 ...。。...............................?? 缩芍??一 一, 湖北中医学院 硕士学位论文? .大戟属植物化学成分与灭螺活性研究 .酸枣仁汤物质基础及其药理试验研究 。 研究生姓名:剃军锋 , ? 师:刘焱文教授湖北中医攀院 指导教 、一 学科、专业名称:中药学 磅究方囱:中药及冀制剡有效藏分黪研究 二 五年卡月 郑重声明 本人的学位论文是在导师指导下独立撰写并完成的,学位论文没 有剽窃、抄袭、造假等违反学术道德、学术规范和侵权行为,本人愿 意承担由此而产生的法律责任和法律后果,特此郑重声明。 ‘ 、攀一?谁哞 肱年月日‘摘 要一 大戟属是大戟科植物中最大的一个属,全世界 有余种,我国有多种,其资源丰富,形态各异,分布十分广泛.易被发现 和采集。本属植物的特征是含有白色或黄白色乳汁,而且有重要的药用价值。《中 药大辞典》和《中草药汇编》均有收载,民间用于通便、利尿、治疗水肿、结核、 牛皮癣、疥疮和无名肿毒、抗肿瘤等。 据文献报道,大戟属植物的主要活性成分为其所含的二萜酯类。现代研究表 明,大戟属植物还具有很好的灭螺活性,是极好的植物灭螺药用植物资源。目前, 由于生态环境的人为破坏严重,钉螺传播面积扩大,血吸虫疫情呈上升趋势,引 起我国政府和医药界人士的广泛关注。因此,对大戟属植物进行灭螺试验研究, 对于防治血吸虫病具有及其深远的意义。 本论文对大戟属植物的研究概况进行了综述;采用顶空固相微萃取技术,结 合气相色谱一质谱联用方法,对种大戟属植物汁液中的挥发性和半挥发性 成分进行了分析研究,检出种化学成分,鉴定出种化合物,其中种化合物 为首次从大戟属植物中发现:比较了五种英国常见的大戟属植物的灭螺活性,从 中筛选出具有开发潜力的两种植物;并对这两种大戟属植物不同生长期茎、叶的 灭螺活性进行了比较研究。从而为将大戟属植物成研制高效、低毒、可降解的植 物灭螺剂奠定了基础,可望为我国血吸虫病防治研究不辟一个新途径。 顶空同相微萃取 气相色谱质谱联用 血吸虫病 植物灭螺药 关键词:人戟属 . , , .,。, , :, , .,? ,? ,. , ,, ,,,.‘,‘ ’ .. . . , . , . ,., ’. ., , , ?, . , . , .,? . ; : ;; 摘 要二 酸枣仁汤为中医嫡床用于葬血安神的首选方剂,出自《会匮耍略》,由酸枣 仁、甘草、知母、茯苓、川芎等五昧中药组成,用于治疗肝不怒、血不养心所 数的虚劳虚烦不得眠,本方乃张仲景养瓶安神代表方,也是历代医家所推崇的著 名方剂之~。本论文结合药理试验研究,对酸枣仁汤的物质基础进行了相关研究。 论文作者对酸枣仁汤及其组方锫药的研究概况进行了较系统的综述。在此基 础上.针对酸枣仁汤历史沿用的处方剂爨的差异,采用挝笼法和自主活动箱法等 镇静安神动物试验,对其处方的刺堂进程了药理学筛选研究:将本中药复方视为 憋体,对其艇台蚤类化学成分进霉于了提取分离研究;以镇静催眠乍用为药理学指 栋,砖酸枣仁汤的有效邦经进行了囊选磷究,确定了酸枣仁溺促进睡躐作用的主 要鸯效部镣群;磐对其主要鸯效部链魏睨学成分遂牙了翅步醭突。 本论文戆磷究结果对予探讨酸枣仁溺懿物质綦礁其骞一定意义,氇菇中药复 方豹辑究欷豢了一定的经验。 复方硬突 镶静 催翳 、提取分离生物黻 关键诩:酸枣二溺 .’ ? , ? ? . , , , ,. . ??, . . ,,. ,, ’, .. , , ;;; : ; 第一部分大戟属植物的化学成分与灭螺活性研究 日 舌 大戟属植物资源丰富,适应于不同的生态环境,从热带到亚热带,从陆地到 沙漠,分布十分广泛,易被发现和采集。本属植物的特征是含有白色或黄白色乳 汁,并有双重特性??既对皮肤有刺激性和毒性,又有重要的药用价值。 据文献报道,大戟属植物所具有的多种活性刺激性、毒性和抗肿瘤等与其 所含的二萜酯类密切相关。其二萜酯类结构独特、新颖,而且被西方学者广泛认 为是其主要的生物活性成分。现代研究表明大戟属植物还具有很好的灭螺活性, 是极好的植物灭螺药资源宝库。灭螺植物资源的开发与利用,是血吸虫防治工作 中重要的,应用植物中的有效成分进行杀灭钉螺的研究,不仅利用了我国灭 螺植物资源的优势,而且有效地减轻了化学灭螺药物对环境的污染,有着广阔的 应用前景。 本论文综述了大戟属植物的研究状况,首次采用顶空固相微萃取技术,结合 气相色谱一质谱联用分析技术对种大戟属植物汁液进行了化学成分分析研究, 对于探讨大戟属植物的物质基础具有一定的科学意义;比较了五种英国常见的大 戟属植物的灭螺活性,从中筛选出具有开发潜力的两种植物,并研究了这两种大 戟属植物茎、叶灭螺活性的年度变化,从而为下一步开发利用大戟属植物研制高 效、低毒、可降解的植物灭螺剂奠定了基础。第一章大戟属植物的研究概况 大戟属是大戟科植物中最大的一个属,全世界 有余种,我国有多种,且仍有新种在被发现“。大戟属植物资源丰富, 适应于不同的生态环境,从热带到亚热带,从陆地到沙漠,分布十分广泛,易被 发现和采集“’”。本属植物的特征是含有白色或黄白色乳汁,还具有双重特性: 不但对皮肤有刺激性和毒性““”,而且有重要的药用价值。《中药大辞典》和《中 草药汇编》年版分别记载,民间用于通便、利尿、治疗水肿、结核、牛皮 癣、疥疮和无名肿毒、抗肿瘤等“,古人用作箭毒“,南美印第安人和东南亚部 分地区的人们用作毒鱼植物来捕鱼““川,在南非也作为廉价的蜂食原料““。 据文献报道”州,多种大戟属植物具有良好的灭螺活性,可望开发研制低毒、 无污染、靶向性强的灭螺药物。国内外学者对本属植物灭螺活性成分研究都越来 越重视,其主要活性成分为二萜酯、三萜、甾醇和黄酮类化合物。本论文将大戟 属植物主要化学成分及其生理活性的研究综述如下。 一、二萜酯类 二萜酯类是大戟属植物中主要成分,特别是在其白色乳汁中分布较多, 年.等。”率先报道大戟属植物所具有的多种活性与其所含的二萜酯类密 切相关。迄今已有种碳骨架图的多种大戟二萜酯类化合物被分离鉴定, 且新化合物和新碳骨架仍在被发现。近年来国内对大戟属植物的研究有了较大进 展,刘桂芳等“。‘“对狼毒大戟和鸡肠狼毒中的活性二萜成分进行了研究,并发 现一种新的二萜碳骨架:贾忠建等“对分布于西北地区的准葛尔大戟、甘遂大 戟、钩腺大戟、甘青大戟、舟曲大戟和湖北大戟等种大戟属植物进行了比较系 统的研究,发现含种新碳骨架的几十个新二萜酯类,并采用快速比色法, 对上述种植物中的二萜酯类进行了肝癌、肺腺癌、胃腺癌的抑瘤活性体外试验, 发现对癌细胞生长有明显抑制作用“”。他们又对地中海地区的阿勒颇侧大戟、颇 体拉特大戟和巨枝大戟等种植物进行了研究,发现一个新的五环二萜碳骨架, 并提出了该新碳骨架的生物合成“””。蘸程碰? 吖 蜘 书曲?,‰一’ 玷 ‘韩拈帅。 啦?靴 龄部裔秽 蚓埘挑“劫 .移秽职二 踟曲甜埘哺珏 峰罩帖 ‘秽: 剧?撇 帮 丘托?牺日口 玳 地 下面仅就近近二十多年来提出的主要的二萜酯类和其生理活性作一介绍。 型二萜酯 .巴豆萜烷 此类成分是本属植物毒性、刺激性、致炎和辅助致癌的重要成分之一,其中 ?一十四酰基大戟二萜一一乙酸酯?一,简 称是巴豆萜烷型酯中作用最强的“”。巴豆萜烷酯??大戟二萜醇 在自然界中主要以其脂肪酸的单酯、双酯或三酯的形式存在,少数与芳香酸 成酯。 大戟二萜醇一,一双酯被公认为是致炎和辅助致癌因子,假其,, 酯则被称作隐性刺激性因子,因为只有除去位酰基才显示 或增强其刺激性。所以通过对 ?汁中刺激性成分研究,提 出其乳汁的弱毒性部分是由于乳汁中的二萜酯类混合物中大戟二萜醇位羟 基的酰化物“?。 等从绿玉树置乳汁中首次分离出的四种一去氧 和二种一去氧大戟二萜醇一,一不饱和脂肪酸双酯的结构及生理活性进行了研 究,结果发现前四种化含物和已有报道的巨大戟一一有机酸酯是主要的活性成分。 并且大戟二萜醇的刺激性随不饱和度的增加而增强,但其辅助致癌活性却随之降 低。而后两种化合物无刺激蛙和辅助致癌活性啪“。 一去氧大戟二萜醇酯在本属植物中分布较多,多以,一双酯形式存在。 等先从绿玉树,铁海裳正以及蛇皮掌叵乳汁,根和茎 中分离出七种一去氧大戟二萜醇酯,其中五种是去氧大戟二萜醇一,一 双酯,一种是,一二去氧大戟二萜醇酯,另一种是一去氧一一羟基大戟 二萜醇,,一三酯。””。 等报道从铁海裳根和茎中分离出多种含肽的新二萜酯类,这是本属 植物中首次发现,其中 和是一去氧一一羟基大戟二萜醇肽酯。 显示弱刺激性, 无刺激性”“。 .巨大戟烷型酯 此类二萜酯与大戟二萜酯都是本属植物中发现较早,数目较多,并且有致炎 和辅助致癌作用的成分。等人早在年就对本属植物约种中的二萜 醇类成分和其生理活性研究作了比较,发现巨大戟醇酯是本属植物中最常见的刺 激成分“?。年,等人对伊朗的阿塞拜疆省种大戟属植物中对皮肤 刺激性二萜酯类成分的筛选研究也发现其刺激性成分是巨大戟醇酯“?。等 人在对大戟科活性成分研究中以欧洲境内的五种大戟属植物 ,巨 置中分离出十多种 巨大戟醇酯,多数具有刺激性和辅助致癌活性,其中包括首次提出的一去氧 一一 羟基巨大戟醇酯和一去氧一,一二羟基巨大戟醇酯。对其化学结构与生理活 性的关系研究,发现一去氧巨大戟醇当归酰基酯虽仍显一定刺激性,但与巨 大戟醇中刺激性最强的.一一相比明显降低了,而 去氧巨大戟醇酰基酯几乎无刺激性。一去氧巨大戟醇一。一二酰基酯也 无活性。这似乎说明巨大戟醇酯中位羟基的存在是其刺激性的先决条件。?。 ~是巨大戟醇肽酯,它们蚓显示刺激性,其中以 铁海棠中 的刺激性最强,但都无辅助致癌活性?“。从 门鲫印乳汁中分 离出的新巨大戟烷型酯,一羟基巨大戟醇一,三酯和其一双酯也都是刺激性 成分。 贾忠建等啡。“”分别从种大戟属植物钩腺大戟,甘青大戟和颇提拉特大戟 中分离鉴定个新巨大戟醇的酯图。此类化合物被认为是大戟属植物中普遍 存在的代表性活性成分。 .‰,.】?《一.?删’ .采【‘。鼬‰掣.盘, . 掣.?’’?“协枷脯鲫。舳 ‘.?‘五...,,,陬崔‘ .。露.‘‘孑’棚?.明 ‘.靶.‘.’蛔咐耐幽州.,娜姊嘶? 拥?摊 培 .瑞香烷型酯 与前两种二萜酯比较,此类成分在本属植物中分布较少。迄今,从本属植物 中发现的瑞香烷型酯都是树脂大戟醇酯,其中包括丁亚毒素 树脂太戟毒素和原树腊大戴毒索 。瑞香烷型酯也是本属植刎的董妻活性成分之一“““’, 等人曾对毒大戟力乳汁中分离出的种二萜酯类化合物刺激 性比较表明,瑞香烷型的刺激性强于巴豆萜烷型。真中树脂大戟毒素,, 一一?一???? ;,,?一一?一 ?刺激性最强““。年,研究者们又从绿玉树、铁海棠和 蛇皮掌中分离出树脂大戟醇一一乙酸酯和其一苯乙酸黼“””川。 , .千金二萜烷型酯和西松烷型二萜类 千盒二萜烷型酯类图为本属植物中数量最多的大环二萜类。其母体醇主 要有、和种。虽然尚未发现它们具有刺激性和辅助致癌活 性,但经体外试验表明具有细胞毒性和抑瘤活性”’删。西松烷型二萜类在大 戟属 植物中分离得到的很少。这两类化合物被认为是大戟属植物中主要活性成分 巴豆 烷型,巨大戟烷型和瑞香烷型二萜酯类的生物合成前体“’”。铲 ’: 刚 .从泽漆叵鲜叶和根中分离出了两种影型千金二萜烷型酯?”, 它们是,矛 。这三种化合物均 是泽漆中的毒性成分。贾忠建等‘从甘青大戟全草叶分离出】个新的千金二 萜烷 型酯:,一一:从湖北,戟中分得个新的西松烷 型二萜“”,这也表明了各类型犬戟二萜之间的生物转化 关系。 .假白榄酮型酯 假自榄酮酯的结构特征是缺少一个三元环,具有抗癌活性““?。年首次 从大戟属植物 分离出有镇痛作用的: 和酽?,尔后又从 分离出抗癌活性成分 。年至年,从本属植物中 提出的假白榄酮型二萜酯只有这三种““?。近年来 等人先后 从泽漆置鲜叶和根中分离出十多种新的假白榄酮酯,它们均是泽 ~“”, 漆中的毒性成分。’“?,有的具有抗癌作用”?”。 ~““?, ~““。年报道以 的乳汁和根 中分离出八种新的假自榄酮型二萜酯 ~,都无活性”?。 .松香烷型酯 此类二萜酯类化合物有一个五元内酯环,在大戟属植物中分布不多。 ’ 年等的综述“”中没有收载此类成分。 日本学者 等人从泽漆中分离融兰种具毒性松香烷型二萜 酯 ~”“川,苏联化学家等人从根中分 ,它 离出三种化合物 ,和一? 有中等强度的杀菌 们均能引起变态反应,其中曲? 衔 作用,此外,从正分离”?,从 抗淋巴白血病成分。中药狼毒鼠具有抗肿瘤作 用已得到进一步肯定。刘桂芳等““删从狼毒大载中提出了多种该类新二萜 酯, ,、撕 和,动物体内抗癌活 性试验证明,具有抑制艾氏腹水癌、肝癌腹水和一等癌细胞生长的活性.贾 忠建等【】从钩腺大戟中分到个已知的化合物。 ‖‖彩 .?“ 。 ‘’?: . 啪??“细,妯 ?, .对映一贝壳杉烷型? .、、、: 对映一贝壳杉烷型二萜类图是一种普遍存在于植物中的成分,尤其在香茶 菜属植物中分布很广,但也是大戟属植物中的主要活性成分,研究表明此类 成分 具有抗菌和抗肿瘤活性。贾忠建等啪“”从舟曲大戟和钩腺大戟中分别分离 鉴定 了个新的对映一贝壳杉烷型二萜类化合物。 一 .融?毋. ...:..? ,一.;, ??“ . ? .对映一阿替斯烷型? 一??‖ 对映.替斯烷型二萜类图也是一类普遍存在于植物中的成分,但在大戟 属植物中相对较少。闵知大和贾忠建等啪““”分别从金刚纂大戟和钩腺大戟中 分离并鉴定出多种此类新化合物。 。职‖移轧移彬.醚阪。 秽捌?粼 的有效成分是大戟醇。”,法国学者曾报道狼毒大戟 月 根中某些甾醇显示抗癌活性”“。 ..,,... . 三、.黄酮和花色苷类化合物 本属植物中黄酮、花色苷类化合物主要分布在茎叶中。近年分离出的黄酮、 花色苷类化合物也多为已知成分,其中从铁海棠地上部分中分离出一种新的黄酮 成分脚。本属植物中有的黄酮类化合物是活性成分巨茎中有 的一甲氧基槲皮索衍生物体外试验显示的抗细小核糖核酸病毒和具有抗传染性 和抗水泡性口炎病毒作用。通过对其作用机理研究发现黄酮结构中一甲氧基可能 是活性官能团嘀。 四、大戟屑植物的灭螺活性研究概况 世界卫生组织年发布的血吸虫病综合防控中明确指出,除了治疗 已患病人群外,防控血吸虫的中间宿主??螺类和促进社会经济发展、加强卫生 教育等是预防血吸虫病蔓延的重要环节。尽管化学灭螺药剂是螺类防控的最常用 手段.,研究表明其施药后再生、恢复速度极快,年, 等啡指出,在巴西的疫区通常使用化学灭螺药镍铵合剂,但投药 一段时间以后螺类的数量很快又恢复到原来的水平,以致需要至少每月投药一 次,造成极大开支。此外,化学灭螺药的副作用也不可小视,如年 等”研究发现,镍铵合剂对鱼类、虾类和水草等水生生物具有毒杀作用。因此, 许多研究者们将目光投向植物界,希望能从中发现廉价、低毒、环保和高效的植 物灭螺药。 现代研究表明,大戟属植物,特别是其乳汁具有良好的灭螺效果。在印度,等人早在年?就提出, 的汁液具有很强的灭螺活 神经 性和抗胆碱酯酶活性,可降低血吸虫间宿主螺类之一 系统中五羟色胺和多巴胺的水平,并认为可能是其高灭螺活性 机理;在巴西,和等从年起。”蜊研究了 . 对巴西产螺类血吸虫中间宿主 、.和..,非洲产螺类血吸虫中间宿主. 和 .的灭螺活性,并提出该植物是一种有效的灭螺药植物资源。 年, 等。对采集自巴西的大戟属植物 .进行了 植物化学研究,并结合灭螺药理试验,从该植物活性部位中分离出八个有灭 螺活 性的巨大戟烷型萜酯,其中 的仅为.。 迄今为止,已报道的有灭螺活性的大戟属植物包措 ‘”。“、 坤、 .‘器’帆船~’~?、 . ‘‘?、 九” 九、 九、四、最?“、 和 “等,其对 ?括印枷勺深入研究表明,常规投 药量不会对其他水生生物造成危害”“;该植物不同地域和不同季节汁液收获 量变 化不显著。”;其汁液在密闭条件下常温贮存天和在。冷藏条件下贮存 天灭螺活性不变?;野外试验表明其天然汁液浓度下可完全杀灭口 ,浓度下可完全杀灭最?‘”””。 综上所述,近年来对本属植物生理活性的研究主要集中在二萜醇类成分。此 外还发现某些三萜,甾醇和黄酮有引产阻、抗癌脚、抗病毒”作用。二萜酯类无 论是其刺激性和辅助致癌性,还是其抗癌、抗白血病活性均对筛选抗癌药物的研 究具有重要意义。目前,国内外对大戟属植物二萜酯类的研究较为深入,同时配 合其生理活性研究,提出了部分化合物的构效关系。而从大戟属植物中开发研制 新型灭螺药,将对充分利用该属植物生物活性物质开辟新的道路。因此,结合现 代植物化学、分析化学、药理学等领域的新技术、新方法对该属植物进行更加广 泛深入的研究开发,对于充分利用该属植物资源造福人类是很有意义的。 第二章大戟属植物汁液中挥发性成分的比较研究 本试验利用顶空固相微萃取技术.,结合气相色谱.质谱联用分 析检测技术.,对多种大戟属植物的乳白色汁液中的成分进行了分 析研究,初步确定了其主要化学成分种类,为灭螺药用植物筛选和进一步寻找其 昆虫拒食活性成分奠定了基础。 试验材料、仪器与试药 ..供试植物 ,.。. .,. , . ,. .,. . ,.,.,. .,.,. 。.。.,.。.,。,. 等植物材料均出大学苗圃提供。 ..仪器与试药 手动固相微萃取装置,如图所示,不同型号、、/纤维头 如图所示,样品加热器, 玻璃样品瓶, 特氟隆橡胶塞以及帆中部 开口铝盖购自美国公司;?气相色谱.质谱联用仪,工 ×. ... 作站,一 气相毛细管柱;.型十 万分之一分析天平西德;正己醇和甲醇色谱纯, ?公司驻英代办处提供,自制双蒸水。 .推杆.套管.形槽.推杆卡持螺钉.高度标志环.观察窗.针 头长度调节器外层护管.穿刺针管.纤维连接杆.带吸附涂层的熔融石 英纤维 图 手动进样式装置图 \ \’ .颜色编粥螺毂.弹簧.密封隔垫.金属箍.胶塞穿刺钎筲.纤维 连接枵.带吸跗涂屡的熔融石奖纤缎 图 筝动进样式装簧部件圈 试验方法 。.供试熬割务 精密称取供试植物材料,’鼍予恒攫的糕鼎瓶中,。。血珏蔑橡胶垫,镪盏密封, 放 入?冰箱保存至检测前取出。 ..偬谱条件 载气为纯氦气,流速为 /,柱前换装内径.的进气衬捧,柱 前压,柱温;保持,然后以/速率程序升温至 ,保 持,进样翻温度?,离子源检测口温度。,无分流迸样,后 分流眈为:。离予源嘏压,电流为,扫描范围:~, 电子倍增器电压:。数据汇总后经 ,,联合震谱数维电予餮书馆等检 索程黟麴蠡劲检溺餐弱纯念耱数据。 ..攘甥汁液撵发瞧成分数霹柱微摹彀 取蹙毒大戟麟檀甥汁滚的榉晶辍,捶入萃取纾线头顶空萃取一定时阀, 取嫩,立即矮入气相色谱仪进样口,热艟雌分钟。 、‘ 。.固相微萃取条件优化 ./, 正式测试样晶前,为确保试验结果的可靠性,选择檬物 对纤维头类型、汁液样品用量、内标物溶液、翠取温度、萃取时间簿影响固 相微 萃墩效果的因素进行了试验研究。 ..内标物溶液的确定 根掂测试出螓时间和蜂面积的比较研究,选择卜的甲醇溶液作为内 标物溶液,其浓度为. /,加入植物汁液量为 /次。 ..纤维头型弩的确定、“不 / 本试验选取了三种不同型号的纤维头. 芹: 进行了测试鼷相微萃取条件为:加入内标物溶液 , ,密封后?预热 ’顶空固相微萃取 ,酗检测,结祭见表鞠图。 表不同涂朦墅号纤维头萃取结果 彦 不圈涂联裂号纾缕头葶激物峰瑟积 镰整 仡台秘名称 号 时间 / .. . . 一:. .? ... .. .& . 。 。 .,.? 】 , , ..器 . . . ? . . . 一 ‘ 弘. . 。彳 . 捌纤维擦层筛选 靛阕中可踅叫涂若纾维头萃淑所褥成分较多,酶面积较大,纯合物 谈剃结采较好。综合魄较慧峰瑟积、漳数,鞋及谈麓效果,最终确定选用 涂鼷纾维头进行羧《试分摄。 。.植物汁渡撵是用量的确定 涂屡终维头分别萃取 为确定檬物汁液榉晶最佳用星,本试验采熙 同次采集的.、。、.、. 晟棱物的乳白色汁波,围楣微摹 ,。顺空阉相微萃 取条件为:加入内标物溶液,密封詹。预热 取 ,?检测,检测结果如袭见下页和图所示。孙黼 餮祥赫胄蠢薪释倪纯表样品用量优化结果 序 保留 不同样品用量萃取物峰面积 化合物名称 号 时间 , . . . . . . ? . 目., . 一,.:,, . .. . 日 . ... ?’. . . & .. .. . . . ., . .. . . .. . . ... 由前页图可以看出,本试验样品用量对试验结果有一定影响,但不显著, 而且不同品种的大戟属植物汁液产量悬殊,试验过程中根据植物汁液采集难 易确 定用量,取样量确定为.?. 。..萃取温度条件优化 预热与萃取温度是影响试验结果的重要因素之一,为优化加热温度,本试验 设景、、、共四个考查值由于高于。易导致诸多不稳定因素, 本试验设定为最高考查温度。固相微萃取试验条件为:在四个样品瓶中分 别加入内标物溶液,密封后在测试温度下预热,顶空固相微萃取 ,?检测,检测结果见表和图。 表萃取温度优化结果 序 保留 不同温度条件下萃取物峰面积 化合物名称 号 时间 . .? . 助一,一,, . .,一,,一..?. . . . 毋一 . . . . ? 口. ‘、 一 .. . . . . . ’ . 一.,助一 . . . . . . . .. . . 、,,?。. . “ ?圈嘲相徽军取温厦条件优化 根据图示试验结果,条件下萃取物的峰面积和总峰面积均比其他温度条 件下萃取结果明显增高,因而确定为预热及固相微萃取温度。 ..萃取时间条件优化 预热与萃取时间长短同样也会影响试验结果,为优化萃取时间,本试验设置 了、、、和 共五个考查值。固相微萃取试验条件为:在五个样品 瓶中分别加入内标物溶液.,密封后在。下预热 ,再按照设置时 顶空固相微萃取,检测,检测结果见表和图。 圈同相微萃取时间条件优化表萃取时间优化结果 序 保留 不同萃取时间萃取物峰面积 化合物名称 号 时间. ...日?,一一,,. ?.? .毋 . . ’& . .. . . 一 . , 一,. . . .. 【 .. .由上页图可见,随着萃取时间的延长,萃取物的峰面积不断增大,可见固 相微萃取是非枯竭性萃取方式,萃取物只占样品的极少部分。综合考虑检出 效果 和萃取效率,确定试验预热和固相微萃取时间均为。 通过综合分析以上试验结果,最终确定优化试验条件为:内标物溶液为 、~、’ /,用量为 卜拘甲醇溶液,浓度为. /次;采用涂层纤维头,顶空固相微萃取;植物汁液样 品重量为.~. ;。预热, 顶空固相微萃取。 试验结果 本试验采用顶空固相微萃取联合联用分析检测技术,运用以上优化试 验条件对 , , ., , , . ,. ,.,.,. . ?., .括..,.,.,.,。,. 等种大戟属植物的汁液中的挥发性和半挥发性成分进行了研究,共检出化合 物 种,结果见表见下页,其中首次从大戟属植物挥发性成分中检出的化合物 有种,研究结果见表。 盅 譬 嚣一 岔口旨?矗 % 一篇 捣葛一 霜 一枯?? 苎 喀 口 口一擘 ? ; 客 嚣 一美。品一 譬 眯姆嚣求?葛 苗 器一 一日? 一一昱 景。拳 盆 霉一 甜 ?々 啦 一? ? ?葛一宰簧岛生础高“一卜 。甘?.? .?.小 嚣卜?吼 、。 心卜卜卜 卜 西?.一 甘 寸寸寸寸? ? ?『 ? 【【 口 譬 葛『 卜一 一一一 如好蹄糌糕罂匾靠薛黎靼噬都 蒿 高 品 矗 葛 瓮 王 士工士” ” 々 僻 ::::::;:。:::一鲣轴囊口一。一 口士 。 ?掣 。 王? ?? 口 薄婶霉姐翠 ?肖一】?孓专?鲁.寸暑暑?昌一扫矗.【‘。宕焉 廿蜃口口 。。..甲.一【一声日毫日吨石一丫?毫一】一,暑巨 一目互 一? 一一曼呻.口?箐暑?导.『一. ,? ?《 ?日口。口? 饕甲一占瞿嚣。.一等暑告暑暑吕一 晕寸口【邕 口。口鬟寸 目霉已.【也 仁一,暑?昌乓苗苫.呐 ??口.孓以 口??口甲工乱 避即 博×王一 暑粤‘.一..最高霉.?均.呐吨也‘.要。『 . 口荟啪口口篁 苎苦?, 廿 ?口,寸一 一 口?一口一詈 , 氅 暑 口 誉 妻 善 量 苗 豁 品 ? ; 口 盆一 ”卜【 .寸节卜 卜?卜 ”?.卜【 。.?叫 一.? .卜.? ??『 小节?『 ?. ? ??. 乱.?『【 ,卜一 导盎葛卜乱.卜一 一?.?一 ?.?一 寸寸 寸 寸 ?.卜一寸 .【口 甍甍蚤甍蚤甍 ?小一 卜【寸。一 寸 寸 葛 : 葛 矗 葛王 葛 篁 ?气 ,掣 葛 毛一 葛 ?毛 墨一 。九 矗 甜 高 葛兰 .【.【昌?.吐?日‘ ?口. .秽.【舍 ‘时一.?焉】 等。一譬。暮苫‘ 口目 蹦 ?口?一勇上苟芝. . 口毫? 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嚣硭拦一葛事一?,? ?口?芑品.,咛砷口日扫?心 。量叫 ?啐?口 口.????矗『西口 ? ?【女受 。葛卫目,点目 ?菌 ?中工寸卜 ?上.” 口。口矗一甲小 黑? 口譬声暑一口 昏.叶『.暑口若暑工苟置.丫『嗣苗丫. 乜一? 寸 蜀事口寸峪 。口甲竹田 藩一一是嘲,表 种首次从大戟属植物挥发性成分中检出的化合物 . .... . 【】. . .?. ,,,,,,? ‘’ ,,, . 。。一。竺,。毗““卧九“艮,’, . . . . ? . ? . .?一一一一. ???,?一一,邢】 ..,,,?,.、?,.?【. . ,。,,,,】?, ..... .“ . ?. ? ., . ., . .,一一,,一 . 一?.一 . 结果表明,不同种类的大戟属植物汁液中挥发性和半挥发性成分类型和含 量 有较大差异,但多数样品中检出十一碳烷烃、一甲基一十一碳烷 烃?、石竹烯、十五碳烷烃、 大牦牛儿烯 、一甲基一十五烷酸甲酯 , 一一, 和二萜类化合物一一,一一等, 、 但多不是它们的主要成分。从二十种样品中共鉴定出种化合物,其中 、 年口叵四种植物汁液含挥发性物质较少,且其主要 一卜;叵、 成分均为一一一 、 、 、 和叵冲均含有大量石竹烯: 置、叵、最巾和鲋』盯六种植物汁液中末检出被认为是二萜类活性成分前体 的分子量为的成分,而 、 .、 、 . , .和 .、.、.、.、.、 等植物汁液中却检测到大量分子量为的成分。 讨论 . 固相微萃取技术是一种新颖的分析样品预处理技术,具有不需使用有机溶 剂,方法简便、快捷、灵敏度高、选择性好、所需样品量小、易于与其他仪 器联 用、可自动化和适于现场分析、纤维可重复使用等特点。随着中药现代化 发展进程的不断深入,此项技术在用于研究中药成分,“特别是对中药中挥发性成 分的研究值得推广应用。 . 本试验首次采用顶空固相微萃取技术,结合?联用分析方法对种大 戟属植物汁液供试品中的挥发性和半挥发性成分进行了分析研究,共检出种成 分,利用署质谱库联合检索,鉴定出种化合物,其中首次从大 戟属植物挥发性成分中检出种化合物,从而为探讨夭戟属植物的物质基础提供 了科学依据。 . 对各植物汁液中挥发性成分列表分析比较研究,结果表明,所检测各种大 戟属植物间挥发性成分差别较大,其中种含有较多分子量为、,分子结 构具有二萜类化合物特征的成分。另据文献报道,这种大戟属植物中有多个被 .“ 认定具有灭螺活性,进一步研究表明, 车.具毒较好匏必螺溪性参照论文繁三章、第四掌内容,翔?烬霾摆微攀取梭测 结果与药理媾选棚结会,逃一步确立耀者阙的联系,无疑烽极大籁化大毂属灭螺 药用植物筛选程序,提高初筛效率,为研制植物灭螺荆玎辟撕途径。第三章大 戟属植物灭螺活性比较研究 本试验研究谯取了五种英国常见的犬戟属植物置, , ,,嚣劳 ,分别砖其茎、 ,最 叶的纯甲醇、%甲醇水溶液和水提取物的灭螺涌性和对水生微生物影响进行 了 院较研究。 试验耱辩舄仪器 .仪器与试药 僵滠采浴籍,倍生秘溪察鑫徽镜,蠢分之一邀子天平西德, 旋转蒸发仪一一,西德,万分之一分析天平西德,超声清洗机,微爨移液器和 移液管。 .统计绘图软件。 甲醇纯学筑,,囊恧分辑缝,,大王海拳懿裁霜蘸 类购自宠物店,蒸馏水自制。 .试验动物 鹦鹉螺裘 攥予热豢淡水螺,为棼测裟瘩美渊盘吸 擞的主要中间宿擞之一,选取直径.?. 的成年螺用于试验由普淡茅斯大 学科学陡试验动物房提供:水整微生物,是一犟审藏水小虾 ,虾赛农?憾湿自配模叛海承中孵化秘喂养小时,嫩长为试验用成 年虾实验室孵化。 。禳物原辩 .。, , ,,. 晟 等五种犬戟属檬物材料均采大学荫。 试验方法 .供试品制餐 /、段,各称 取以上五种试验植物材料,趁新鲜将其茎、叶部位剪成约. 驳 ,分鞠雳鞠菇甲簿、翠簿瘩溶滚/%秘蒸镄承冷浸夺隧,过滤,浴条件下蒸除溶 剂得干浸膏,称重,分别用蒸馏水配制成、、、、、 、、 的溶液,备用。 阳性对照品溶液制各:称取一定量奎尼丁,加入蒸馏水配制成 /和 /两种浓度的溶液,备用。 .灭螺试验 设置浓度由~ 组等比浓度给药试验组,以蒸馏水作为空白对照组, 每组为两份平行考查,将只鹦鹉螺置于 锥形瓶中,加入 供试品溶 液,在。恒温水浴箱保持时,分别于小时、小时观察药效,并在时 后在显微镜下观察和记录灭螺效果,将结果输/.统计软件处理计算 值。 .水生微生物试验 设置浓度~ 组等比浓度给药组,人工海水作为空白对照组。将 含有只小海虾的 人工海水转入宣微生物培养盘,用微量移液器 取一定量人工海水并加入等量药液,使小室中的药液浓度分别为~ , 每个浓度组设定份平行考查,加盖,时后在显微镜下观察小海虾的生存情 况,将试验结果输入统计软件处理,计算值。 试验结果 . 五种大戟属植物灭螺活性比较研究结果 五种大戟属植物各种溶剂浸提物灭螺的试验结果见图和图。 日‘ “’?’ 圈五种大戟属植物茎的不同溶剂浸提物灭螺的效果图 图五种大戟属植物叶的不同溶剂漫提物灭螺效果图 由图示可知,五种大戟属植物茎、叶的不同溶剂浸提物均表现出较好的灭螺 活性,均小于,符合世界卫生组织规定的有效灭螺浓度;其中 :、叶的水浸提物灭螺活性明显高于甲醇浸提物,其不到甲醇 浸提物的二分之一。 .五种大戟属植物对水生微生物影响试验结果 对小海虾毒性试验结果见图和图。 图五种大戟属植物茎的不同溶剂没提物对 约影响 .矗 图五种大戟属植物叶的不同溶剂浸提物对 的影响 如图所示,五种大戟属植物茎、叶的甲醇浸提物对小海虾 的毒性均明显大于相应的水浸提物,且均小于:其中 和 的茎、叶的水浸提物对小海虾的毒性较小,其分别为、 、和。 .结果分析 研究结果表明,五种大戟属植物的茎、叶甲醇浸提物的药液浓度对鹦鹉螺和 小海虾的半数致死量均低于 ,两者比较,后者的半数致死量溶液浓度更 低;%甲醇浸提物对鹦鹉螺的半数致死量均小于 ,但对小海虾的半数 致死量差别较大,略高于甲醇浸提物的半数致死量;水浸提物呈现较强的灭 螺活 性,但杀灭小海虾的作用较弱,分析比较不同溶剂提取物的半数致死量,见 图。 呻 怕? 图五种大载属植物茎、叶的水浸液对和 毒性比较 如图所示,同其它大戟属植物比较, 和.的茎、叶的水 浸提物具有较强的灭螺活性,同时对水生微生物小海虾的毒性较小,而且 的水提物对两种动物杀灭作用均较强。 此外, 的茎水提物的灭螺活性略高于叶,而胁瞻删的茎水提 物的灭螺活性较叶低。结合试验过程中观察到的现象: 的茎中乳白 色汁液的含量较叶多,而且其茎为肉质;而 的茎中乳白色汁液的含量 较叶少,而且其茎含大量木质纤维。由此推测两种太戟属植物的活性成分存 在于 乳白色汁液中,且其活性存在一定的量效关系。 讨论 . 所研究的五种大戟属植物的提取物均有灭螺活性,总体评价其灭螺活性效 果, 和耽塘打两种植物具有一定的开发应用前景。 . 通过五种大戟属植物分别采用不同溶媒提取的灭螺活性比较研究,结果表 明,水提取物的灭螺活性最强,故推测五种植物中灭螺活性成分具有亲水性。 . 通过对 和胁舱一厢种植物茎与叶水提物灭螺活性的比较研 究,结果表明,其灭螺活性物质存在于植物的汁液中,与文献报道结果一致。 第网章两种大戟属攘物灭螺活性年度变化研究 为考查嚣和最 .硇?掰厢种较舆开发潜力的大戟属植 穆年度不同生长籁生耪活后豹交纯,辩其羹、时的永浸撼杨的灭螺活性和永 生微 生物影嚷进镗了磺突。 试验誊;、仪嚣与试药 。仪器与试药 恒滠水淤箱,倍艇物观察擞微镜,嚣分之一电子天平嚣德, 旋转蒸发仪,嚣德,万分之一分叛天平溪德,。绕诗绘塑款佟; 起声清洗扭,擞爨移波器秘移滚管, 大王海水酝制用盐类赡叁宠躲废,蒸馏水巍剑。 .试验动物 鹦鹉螺类属予热诺淡水螺,为非洲和患美洲血吸 虫的主癸中蒯宿主之~,选取直径.?. 的成年螺用于试验妇普获茅凝大 学科学院试验动物房提供;水生微生物.熄一种咸水小虫下 ,虾卵在。恒温自配模拟海水中孵化和喂养时,生长为试验用成 年虾实验室孵化。 .直物材料 最. .粉骆胛哟地上部分采集:大学 苗蠲。 试验方法 ,试验稍蓊液翻备 趁瓣采集茎稻盱,分剩骜裁缝。 段,称戢 茎或时静小段,嚣予 强瘫烧瓶中, 蒸馏水中冷浸夺对,过滤。吸取擞滤液予已恒重翳 用旋转蒸发仪在水浴条牛下蒸于,褥予浸囊,拣重豢《成、、、、、 、、 / 妙心薅罩申浓度的溶滚供对 的溶液供必螺实验用; 永生微生物小海虫下影响的实验用。.灭螺实验 设置浓度由至 组给药试验组,以蒸馏水作为空自对照组,每组为 两份平行考查,将只鹦鹉螺置于 锥形瓶中,加入 供试品溶液,在 ‘恒温水浴箱保持小时,分别于小时、小时观察药效,并在小时后在显 微镜下观察和记录灭螺效果,将结果输入统计软件处理计算僮。 .水生微生物试验 设置浓度~ 组等比浓度给药试验组,人工海水作为空白对照组。 将含有只小海虾的 人工海水转入室×微生物培养盘,用微量移液 器取一定量人工海水并加入等量不同浓度药液,使小室中的药液浓度分别为 ~ ,每个药液浓度组设定份平行考查,加盖,时后在显微镜下观察 小海虾的生存情况,将试验结果输统计软件处理,计算值。 .相关参数记录 记录每月气温、试验当天气温、水漫提物干重等可能与试验结果相关的参数。 结果与讨论 .试验结果 . 该试验从年月至年月,对最和 耽舱”“两种植物不同生长期的灭螺活性和对小海虾毒杀作用进行了研究, 研究 结果见图~。 已? 阳 ? ? :? ?~?一 蚰 ? ??‘??一 ? 、 ‘?《?一. ?九 ? ????一?《 ? .. . 图 叶的水浸提物年度试验结果