【doc】褪黑素对大脑皮层细胞一氧化氮含量及其神经毒性作用的影响

【doc】褪黑素对大脑皮层细胞一氧化氮含量及其神经毒性作用的影响 褪黑素对大脑皮层细胞一氧化氮含量及其 神经毒性作用的影响 272 . ActaPtumnuticaSi1999…34(4272-276 ?-药学acena.):Lu 褪黑素对大脑皮层细胞一氧化氮含量及其神经毒性作用的影响 \/ 堕型,张均田R了1,IR33g,———一『,1…,?ru (中国医学科学院,中国协和医科大学药物研究所,北京l[】【】o50)l 擅耍目的:探讨褪黑索(MT)抗衰老作用与神经细胞NO释放之间的联系.方法:连续给予老年小鼠MT检 测大脑皮层神经细胞NO含量的变化,并用原代培养的大鼠皮层神经元,击血清培养后.观察MT对高钾,各氮酸 (Glu)诱发NO释放及硝普钠(SNP)致神经毒性作用的影响.结果:MT能明显抑制老年小鼠脑内NO含量的增高. 并拮抗KCI与Glu诱发的NO释放及SNP引起的神经毒性.对大脑神经元有保护作用.结论:MT抑制大脑皮层 NO含量增高,可能是其抗衰老作用的机制之一. 关键词褪黑索;一氧化氟:神经毒性;神经元;衰老 褪黑素(melatonin,MT)是松果体分泌的一种 神经内分泌激素.许多研究明,体内连续给药可 以延长寿命,推迟衰老及减低老年性疾病的发 生l1J.一氧化氮(nitricoxide,NO)是一种神经递 质,在神经发育及衰老过程中有重要作用.正常情 况下,参与多种神经功能,但若合成和释放过多,则 会诱发细胞毒作用,导致细胞损伤.加速神经元凋亡 或死亡l2J.正常培养的皮层神经细胞培养液中NO 含量低.去血清后,培养液中NO含量可增加数1O 倍,一氧化氮合酶(nitricoxidesvmhse,NOs)活性 增加约为正常细胞的3倍.与去血清组相比较.观 察MT能否使NO含量降低,以研究细胞损伤与 NO的关系及MT对其影响.本文检测连续用MT 引起老年小鼠大脑皮层神经元NO含量的变化,并 观察MT对原代培养大鼠皮层神经元高钾,谷氨酸 (glutamate,61u)诱发NO释放,以及硝普钠(sodium nitroprusside,ShIP)神经毒性作用的影响,旨在探讨 NO与神经衰老的关系及MT抗衰老作用的机制. 材料与方法 药品与试剂MT(本所合成室合成);MTT(溴 化一(4,5)一二甲基一2一噻唑基一2,5.二苯基四氮唑).硝 普钠(SNP),谷氨酸(Glu),多聚赖氨酸(分子量15 -- 30万),二甲基亚砜(DMSO),十二烷基磺酸钠 收稿日期;1998—09-(17 '联系人Tel:(010)63165179,Fax:(010)63017757,Bm zjtm@punicbtac" (SDS),HEPES(N一2一羟乙基哌嗪一N一2一乙烷磺酸) (Sigma);乳酸脱氢酶测定试剂盒(北京化工厂临床 试剂分厂);DMEM合成培养基,马血清(Gibco BRL);其它为国产分析纯试剂. 磷酸缓冲液(PBS.g?L)NaCI8.0,KC1 0.2.NazHPo4t12H2O3.58,KH2Po40.2;pH 7.4. Gricss试剂0.1%萘乙二胺溶液与1%磺胺 (5%)磷酸溶液,于用前12h内等体积混合备用. 仪器752Z.u/vIs紫外可见光栅分光光度计 (北京光学仪器厂);二氧化碳培养箱(德国Heraeus 公司);相差显微镜(日本Olympus公司);24孔培养 板(美国Costar公司). 动物清洁级昆明种老年小鼠(14个月),早 Wistar大鼠(孕期16,18d)由中国医学科学院实验 动物繁育场提供. NO曲线以10mol?LI1亚硝酸钠溶 液,配制终浓度分别为0.0,0.1,0.5,1.0,2.0, 4.0,6.0,8.0,10.0加0l?L的亚硝酸钠PBS液 0.5ml,加至2m】试剂中.总反应体积2.5ml.混匀 后静置20min,于550m波长时测定溶液吸光度 (A值).以亚硝酸钠浓度(mol?L)为横坐标,所 测A值为纵坐标,作出[NO]一A标准曲线,并求出 其直线回归方程及相关系数. 实验分组昆明种小鼠分为4组,每组8只,早 台各半,于每晚7,9点ip用药,连续14d.(1)成 年对照组:3—6个月,体重25,35g,ip生理盐水 0.O1ml?gI1体重(内含溶媒95%乙醇0.5%);(2) 老年对照组:15--18个月,体重45--55g,ip生理盐 药学ActaPharmaceuticaSinica1999,34(4):272,276?273 水(同上);(3)低剂量治疗组(0.5mg?kgI1体重): 15,18个月,体重45,55g,ip含0.005%MT (95%乙醇溶解)之生理盐水液0.01ml?gI1体重 (0.5mg?kg);(4)高剂量治疗组(2mg?kgI1体 重):15,18个月,体重45,55g,ip含0.02%MT 之生理盐水溶液0.1ml?gI1体重(2mg?kgI1).各 组实验小鼠均在同样自然光照条件下饲养. 标本制备及测定将小鼠拉颈脱臼处死,剪下 头部,分离出两侧大脑皮层,剪碎,置于PBS5ml中 匀浆,20000g离心30min,取上清液保存待测. 蛋白定量采用考马氏亮蓝法口].取上清液0.5ml, 加入Griess试剂2m1中,混匀,静置20min后,于 550nm处测吸光度(A值),根据NO标准曲线计算 NO含量(单位为b~mol?mgprotein). 完全培井基DMEM(净重)13.4g?L,,小牛 血清1q%,马血清10%,NaHC033.7g?L,, HEPES2.382g?L1,青霉素G100ku,链霉素0.1 g?L一;pH7.2. 无血清培养基除不含小牛血清及马血清外, 余相同. 大鼠皮层神经细胞的原代培摊H孕期16, 18d的清洁级大鼠,12%水合氯醛400mg?kgIp 麻醉,常规消毒后,剖腹取出胎鼠,取出双侧大脑皮 层,置于冰冷的完全培养基中,吸管轻轻地吹打分散 细胞,悬液经200目铜网过滤,用完全培养基调整细 胞浓度约为3×10个?m1,,接种0.5ml至预先用 0.25mg?ml多聚赖氨酸覆盖过的24孔培养板 上,置5%co2孵箱中.培养1d后换液,以去除悬 浮之死亡细胞,4,5d,用阿糖胞苷(终浓度10 b~mol?L)处理24h,以抑制非神经细胞的生长.然 后每3-4d换一次新鲜的完全培养基(1m1),细胞 培养至12-14d观察照像并开始以下实验. 神经元损伤模型【5及用药将培养细胞分成3 组,换以无血清培养基并分别加入实验药物及致损 伤物质.(1)无血清对照组:换以无血清培养基继续 培养;(2)毒性对照组;加入终浓度分别为20 mmol?L,,500和100b~mol?LI1的Ka,谷氨酸及 硝普钠.孵育30min后,再换以无血清培养基;(3) 药物处理组:在损伤细胞前先加入终浓度分别为 10,10,10mol?LI1的MT.以上3组细胞 均继续培养24h. 形态学观察相差显微镜观察以上各组的细胞 形态学改变并照相. I~ITT比色处理后20h.每孔加入5 mg?ml—MTT0.1ml(终浓度0.5mg?ml),继续 培养4h,加入含有DMSO(50%)和sDs(20%)的 PBS混合液体1ml,37?放置18,20h,待培养孔内 颗粒完全溶解,吹打吸出后,分光光度计于570rim 处测定吸光度(A5).计算MT对毒性物质引起神 经细胞损伤的抑制率. LDIt测定按LDH试剂盒进行标准曲线 绘制及标本测定.24h后,取细胞外液(培养液)测 LDH释放.然后一20?冻融细胞20h,测总LDH, 以细胞外液LDH占总LDH的百分比表示. NO释放Griess法_7测定培养液中NO含量. 结果 1lVlT对老年小鼠脑皮层细胞NO释放的抑制作 用 直线回归方程:Y=0.0078+27.51X(7= 0.9996). 老年小鼠脑组织NO含量(0.3894?0.040 ~rnol?nagI1protein)较成年组(0,3331?0.071 肿0I.mg.pmtein)有增加趋势,但差别不显着(j ?,=8.P>0.05比成年组).而在老年组中, 两用药组老年大鼠脑皮层NO含量:低剂量(0.5 mg'kg1)组:0.2837?0.040mo卜mg_.protein;高 剂量(2mg?kg)组:0.2727?0.040m1.mg prorein明显降低(?s,=8.P<0.01比老年对 照组). 2MT对KCI,Glu及SNP诱发的神经细胞形态学 改变的保护作用 正常神经细胞培养至14d时,胞体呈锥形,梭 形或三角形,突起多,长,粗大,相互交织成网状,折 光性好.去血清后,细胞折光性下降,突起变短,数 量减少,胞体增大,但无溶解和脱落等改变.经 KCI,Glu和SNP作用后,细胞出现肿胀,界限不 清,突触体萎缩,断裂,甚至脱落和崩解.如同时与 MT合用,则细胞损伤程度明显减轻,细胞形态基本 保持完整,与去血清对照组细胞相比较,形态相似 (图1). 3MlT对KCI,Glu诱发的神经细胞损伤致NO释 放增多的防护作用 KCI,Glu为细胞毒性物质,可致神经细胞损伤 而使NO释放增多.在原代培养的大鼠皮层神经 元.MT可减少KCI诱发的NO的释放(j?s,= 6.去血清对照组:0.936?0.090m0I.L一1,KCI 274药学ActaPharmaceuficaSinica1999.34(4):272--276 毒性对照组:1.455?0.098mol?L..,MT10 +KCI组:1.134?0.097tool?L..一.MT1O1 +KCI组:1.180?0.070/~mol?LI1一.MT10 +KCl组:1.230?0.078~tmol?L';P<0.01 比去血清对照组.一P<0.01比KCI毒性对照 组),以及抑制谷氨酸诱发的NO释放(j?s.= 6.去血清对照组:0.936?0.090/~mol?L一,Glu毒 性对照组:1.317?0.064txmol?L,MT10+ G1u组:0.877?0.099/~mol?L.MTl0+ Glu组:0.927?0.100/~mol?L,.MT10+Glu 组:0.987?0.077txmol?LI1一;P<0.01对比去 血清对照组.一P<0.01对比Glu毒性对照组), 对神经元具有明显的保护作用. Fig1RatcorticalneU1"ODsvisualizedhyphase-contrastmicroscope(× 2oo).A.Completemedium;B.Serum- freemedium;C.Glu;D.MT+Glu;E.KCI;FMT+KCI;G.SNP;H.MT+SNP. 4MT对硝普钠引起神经元损伤的保护作用 大量的NO也可引起细胞毒作用.用硝普钠 (释放NO)造成对细胞的损伤,观察NiT对NO所 致原代培养皮层神经元损伤的作用【8].结果可见, 硝普钠造成MTT活性显着降低,LDH释放明显增 加.MT各剂量组则使M1vr活性增强,LDH释放减 少,表明MT能明显地抑制硝普钠的神经毒作用, 对神经细胞有保护作用(表1.表2). Tab1ProtectiveeffectofMT(mol?L)Oil sodiumnitroprasside(SNP,100pmol?L一)-induced neurotoxlcityinculturedratcorticalcells.Cell viabilitywasmeasuredusingcolorimetricMTI"assay j?5.=6P<0.01VS洲?_freecontrol;'P<0.01 vsSNPtoxicityMT:Melatonin.SNP:Sodiumnhroprusside Tab2InhibitoryeffectofMT(mol?L)OnSNP(10oItmol?L)? inducedLDHreleaseinculturedprimarycorticalaeuronsinrats 孟?s.=6.'P<0.01vsSeHLrn.freecontrol;P<0.01vsSNPtoxicity 药学ActaPharmaceuticaSini~1999,34(4):272~276—275? 讨论 NO是中枢神经系统(CNS)中一个重要的信使 物质.在CNS中,NO主要通过Glu递质的NMDA 受体被激活而生成,引起靶细胞上cGMP升高而产 生生理效应_9J.NO除介导Glu神经传导外.还介 入了Glu神经毒性.一般认为,过量的NO对神经 元具有毒性作用.早在1991年Dawson等就发现. 培养的脯皮层神经元对NO毒性很敏感.Glu受体 的过度刺激和Ca2大量内流可引起Glu神经毒性. 内源性NO参与了这一过程El0J.NO与衰老之间也 有密切关系.即NO的增加导致衰老.脑老化的一 个特征是细胞内超载,ca2浓度增高,激活 cNOs(构成型一氧化氮台酶,oonstitutiveNOS),合 成并释放大量的NO…J. MT是松果体分泌的一种体内激素.随年龄增 长而逐渐减少;反之,MT分泌减少可导致机体衰 老,以及促使一些老年性疾病的发生_1.近年来许 多研究显示,MT是一种天然抗衰老激素,如果切除 大鼠松果腺使MT生成减少会促进衰老过程的加 快,而外源性使用MT则可显着延长寿命_I.在海 马神经元,MT能够阻止兴奋性神经传递以及NO 能神经通路功能增强所致的慢性死亡【14】.本研究 表明.MT降低老年小鼠大脑皮层NO的含量,减少 原代培养大鼠脑皮层细胞KCI.Glu诱发的NO释 放,以及对抗No引起的神经毒性作用,提示MT抑 制神经细胞内Ca2超载,减少突触体Glu释放以及 拮抗Glu兴奋毒作用,进而阻止大脑皮层NO含量 增高,可能是其抗衰老作用的系列机制之一. 参考文献 1PierpaoliW.RagelsonWPinealcontrol.faging:effect .fmelatcaainandpinealgraftingonagjngmice.P删 NatlAcod&U,1994,91787 2Mc~cadaS,PalmerRMJ,HteasEA.Nitricoxide: physiology.pathophys~logyandpharma?IoPhar- macolRev.1991.43:1O9 3BradhdMMArapidandsensitivemethodfor quantitativeofmicrogramquantitiesofproteindye bindingAnalB/ochem.1976.72:248 4ChoiDW.Maulucci-GeddeMA,KriagsttfinAR GIutamateneurotoxicityincorticalcellculture.J Neurosci.1987.7:357 5DermisWC,KohJY.StephenPPharmao31ogyof glutamateneurotc~xicityincorticalcellcultureJ Neurosci.1988.S:185 6颜贻谦,周振华.李萍.等.缺氧对离体鸡胚前脑种经 细胞生长的影响.生理.1992.44:524 7GreenLC,Waghe~DA,GlogowskiJ,eta1.Analysisof nitratBrlJtrite,and[15N]nitrateinbiolc~calfluids AnatB/ochem,1982,126:131 8~deseK,WagnerJ.Boc~aeL_Nitricoxide:a downstreammediatotofcalciumtoxicityintheischemia cascade.NeurosciLett.1994.166:43 9BredtDS,SnyderSH.Ni~icoxidemediatesglutamate- linkedenhancementPlevelsinthecerebeUum. Pro:NatlAcadSc/USA|1989.S6:9030 10DawsonVL.Daw~nTM.BartleyDA,eta1. MechaIsinofnitric~xide-mediatedneurotoxicityin primarybraincultures.JNeurosci.1993.13:2651 11NowickiJP.DuralD.PoignetH.Nitricoxidemedia? neuronaldeatheftalcerebralischemiaintheinol~e. E"rJP^?捌%,1991,204:339 12ReiterRJ.Thepinealglandandmelatonininrelatkmto aging.,asummax-ythetheatiesanddthedata,Exp Gemnto1.1995.30:199 13MaestroniGJM,ContiA.PierlmoliW.Melatordn. $tre~andtheimmunesystem.PihealRe*R即.1989.7: 203 14SkaperSD.AnconaB.FacciL.etat.Mdatonln preventsthedelayeddeathofhippoeampalx-leuIotL~ inducedbyenMncede.v.~tatoryneurotransmi~ionandthe nitfidetgicpathwayFedAmSocExpBiolJ,1998.12 725 EFFECTSOFMELATONINONNITRIC0?DECONTENTAND ITSNEUROTOXICITYINCEREBRALCORIEX ZhangQingzhu(ZhangOz).ZhaoMingrui(ZhaoMR)andZhangluntian(ZhangJT) (InstituteofMaterlaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciencesand PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050) ABSTRACTAIM:Toexplorethemechanismsoftheantiaglngactionofmehtonin(MT)?METHODS: TheeffectsofMTonnitricoxide(NO)ogntent,highconcentrationsofKCI,glutamate(Glu)?inducedNO release,andsodiumnitmpmsside(SNP)-elicitedneurotoxicitywerestudiedinoldmousecerebralcortexandrat 药学ActaPharmaceuticaSinica1999.34(4):276--279 primarycorticalcultures.RESULTS:MTcouldinhibittheelevationofNOcontentinoldmousecerebral cortex,reducetheKCI,Glu.inducedNOrelease,antagonizetheSNP-inducedneurotoxidtyi nculturedcortical cellsoffetalrat.CONCLUSION:TheinhibitoryeffectsonNOreleaseanditsneurotoxicityw ereprobablyone ofthemechanismsoftheMTantiagingaction. KEYWORDSmelatonin;nitricoxide;neurotoxicity;neurons;aging 毛, EB探针研究吩噻嗪类药物与DNA的作用 v/ 苎童二兰高志,何锨7J耳————,,一?,'''' (南开大学化学系.天津300071) 摘要目的:用光谱探针溴己锭(EB)研究3种吩噻嗪药物与DNA的作用.方法与结果:在pH7.4的溶漩中电 子吸收光谱与荧光光谱表明.同为精神分裂症治疗药的盐酸氰丙嗪(CPZ)和盐酸三I|【拉嗪(TFP)与DNA同存在嵌 插作用;有相同功能团的抗组胺药物盐酸异丙嗪(PMZ)与DNA之间为弱的混台作 的离子强度下该 用.结论:一定 嵌插作用会被阻断. 关键调吩噻嗪类药物;DNA;溴己锭探针;嵌插作用 脱氧核糖核酸(DNA)是生物体内重要的遗传 物质.研究小分子物质与DNA的相互作用对以 DNA为靶标的药物分子有一定意义.目前普 遍认为【11小分子物质与DNA的非共价键力作用包 括静电结合,沟渠结合和嵌插作用3种方式.前两 者也可统称非嵌插结合方式. 吩噻嗪类药物是一种治疗精神分裂症或其它心 理疾病的药物J.已知吩噻嗪染料亚甲蓝(MB)是 一 种DNA分子嵌插剂_3J,本文利用溴乙锭(EB)作 探针研究了与其有相同功能团的几种吩噻嗪药物与 DNA作用的情况.其中盐酸氯丙嗪(CPZ)和盐酸三 氟拉嗪(TFP)用于治疗精神分裂症,盐酸异丙嗪 (PMZ)为抗组胺药物.研究表明,虽然3者都有平 面吩噻嗪环,但它们与DNA的作用方式不尽相同. 此项研究可为该类药物的药理解释及新用途的开发 提供信息. l仪器与试剂 实验邮分 收稿日期;1998-03-09 基金项目:国家自j蠡科学基金(29sTs~o)及国家教委博士点专 项基金资助项目(~OSSlS) '联系人Td:{022)23503313.F":{022)23~2455.E-hill: ch_nc吐@锄.n_II'..口 日本岛津RF.540型荧光分光光度计;日本岛 津uv.240型紫外一可见分光光度计;德国MY一870 型pH计;日本岛津TB-85型恒温循环水浴. CPZTFP和PMZ均为临床用药.依据药典方 法配置成溶液并定量.小牛胸腺DNA(ctDNA)购自 华美生物工程公司,纯度以A260nm/A2?mn>1.8衡 量;浓度由260nm处的吸光度来确定(,260mn= 6600L?mol?Cl'n),4?保存备用L.EB(Sigma 公司)配制成1.0×10I4mol-L的储备溶液,避光 保存使用时稀释成所需浓度.MB为生物染色剂. 实验用缓冲溶液为Tris-HCI(pH7.4).所用水均为 2次重蒸水. 2实验方法 取所需浓度的药物3ml于石英比色皿中,滴 加DNA溶液.混合均匀2—3min后,测定其吸收 光谱或荧光光谱.或将所需浓度的DNA溶液置于 比色皿中测定滴加药物时的光谱变化.由于每次 加入的溶液量远远小于原溶液的量(<0.3%),故 可忽略体积效应,认为原溶液的浓度保持不变. 结果与讨论 1药物与DNA相互作用的紫外.可见吸收光谱 1.1DNA对药物吸收光谱的影响