环孢菌素A二聚体及人工抗原合成（可编辑）

环孢菌素A二聚体及人工抗原合成（可编辑） 环孢菌素A二聚体及人工抗原合成 四川大学 硕士学位论文 环孢菌素A二聚体及人工抗原合成 姓名:吴琼英 申请学位级别:硕士 专业:应用化学 指导教师:戴晓雁 20030502挚‰ 四川人学顾学位论文 环孢菌素二聚体及人工抗原合成 应用化学专业 研究生昊琼英 指导老师戴晓雁 本文在提出环孢菌素夹心型酶联免疫吸附方法检测程序的基础上, 合成了环孢菌素的二聚体和人工抗原,为建立环孢菌素的酶联免疫吸附分 析技术提供了关键的物质基础。 为了制备环孢菌素的二聚体,本文提出了通过环孢菌素与光敏化交联 剂一苯甲酰基苯甲酸的光化学反应在环孢菌素分子上引入活泼羧基,然后将 经过化学修饰的环孢菌素分子和乙二胺反应,在一溴一一乙基~吡啶四氟硼 酸 盐缩合剂的作用下生成环孢菌素的二聚体的合成路线,并在实验室合成了环 孢菌素的二聚体。 环孢菌素人工抗原的合成是将化学修饰后的环孢菌素分子在卜一乙基 ~一一二甲氨基丙基碳二亚胺盐酸盐作用下与聚一赖氨酸大分子载体 反应生成的,化学合成的环孢菌素人工抗原通过间接酶联免疫吸附分析方法 检测,证明该人工抗原能与特异性极高的环孢菌素单克隆抗体发生特异性亲 和反应,有望获得高质量的环孢菌素抗体。 本文不仅在总结蔚人工作的基础上提出环孢菌素夹也型酶联免疫吸附分 析方法检测程序,并合成了环孢菌素的二聚体和人工抗原,而且在合成研究 中结合环孢菌素的二聚体和人工抗原具体实验和相关理论对合成涉及的光 化 学反应,酰胺化反应的具体反应机理进行分析探讨。 本文针对缺少活泼官能团的环孢菌素半抗原分子建立酶联免疫吸附分析 方法研究,合成了环孢菌素的二聚物和人工抗原,其合成方法和技术可用于 其他物质的二聚物和人工抗原合成,特别是缺少活泼官能团的物质。 关键词:环孢菌素 聚体人工抗原查兰堡:.兰些堕兰?? ?? : : ?。 ‘ : / ., , , . : ?锄 . 四 一 . .,一 ?; 琦 一 , . . . 瑶网川人学坝.学位论文 .,’ . . : ,?, 川人学硕卜学位论文 .前言 .检测环孢菌素血药浓度的意义 ,简记为,商品名为山地明 环孢菌素 ,由瑞士公司于年从真菌代谢物中首次发现,是 一种具有强大免疫抑制活性的抗生素。与传统免疫抑制剂相比较,具有选 择性强,毒副作用相对较少,感染危害性低等优点。该药物在临床上应用以来, , 促进了器官移植手术的进步,被称作是器官移植发展过程中的一个里程碑 使器官移植进入了新的纪元,大大提高了临床上各种器官移植的成功率,特别 是在肝脏、心脏移植方面发展迅速,多年来徘徊不前的肾移植也登上一个新台 阶。目前,环孢菌素是世界范围内器官移植临床手术使用最广泛的抗排斥药, 此外还用于治疗某些自身免疫疾病,如类风湿、牛皮癣、型糖尿病等】。 在临床上,为了防止移植器官的排斥,要求病人血液中的含量长期保 持在正常治疗窗范围,浓度过低易导致排斥或诱发自身免疫性疾病,高浓度容 易引起肝脏、肾脏毒性以及高血压、高钾血症、神经系统毒性等不良反应【】, 可见其治疗作用,毒性反应与血药浓度关系密切,安全范围窄。加上本药大多 数供长期预防性用药,肝脏、肾脏毒性在肝脏、肾脏移植时,难以和排斥反应 区别。而且,药物的动力学个体差异很大【】,药物的分配和代谢在每 个人体中的情况有很大不同,即使是在同一个病人体内,在整个治疗过程中, 这种差异也很大。因此,在环孢菌素治疗中,监测的血药浓度对指导医 生用药,实现给药方案个体化具有十分重要的意义。 .检测环孢菌素血药浓度的方法 , 为达到个体化给药方案,避免毒副作用发生,在临床用药时应实行环孢菌 素血药浓度的检测。目前常用的检测方法主要有高效液相色谱法?,、 放射免疫分析法、荧光偏振免疫分析法队、酶联免疫吸附分析法 等。法是物理方法,后几种方法都属于免疫标记技术。 法测定的是环孢菌素原形药物浓度,其结果不受代谢物影响,具 有特异性高的特点。但是不能一次测定大量样品,而且需要花很大功夫作样 品 前处理以除去样品中的干扰物】,操作繁琐,成本高,对设备和操作技术也有 特殊要求,因此不适合常规分析。通常法测定值作为测量值的参考。四 川人学硕学位论文 法【 是先在抗体中引入放射性元素如氘,碳等,使标记抗体与 待测样品中的抗原结合,除去多余的标记抗体后,再用相应的仪器检测待测 液 中抗体量,从而知道样品中抗原的量。用来测量的浓度,其系统性 估计比高倍。该法具有标记法的高灵敏度达到和水平, 反应速度快,容易观察,能定性、定量甚至定位的优点。但的缺点是需特 殊的仪器设备,有放射性危害,试剂有效期较短等,在一定范围内逐渐被其他 方法代替。 法 是把、的代谢产物和荧光示踪物一般是在上 连有荧光基团的的衍生物与对它们有特异性的抗体混和,那么及 代谢物与荧光示踪物在有限的抗体结合部位将发生竞争结合,生成代谢 物一抗体复合物和荧光示踪物.抗体复合物。如保持示踪物和抗体的浓度为 常 数,那么代谢物抗体复合物与荧光示踪物.抗体复合物浓度的比值将 与和其代谢物的数量成正比。因此,用偏振光激发该混合物,测量荧光示 踪物与荧光示踪物.抗体复合物发出的偏振荧光,就能定量的求出样品中 与其代谢物的总量。与比较,此法即具有法的优点,而且稳定性好。 但此法中制备的荧光衍生物较为复杂。而且需要特殊仪器,价格昂贵。 法 是用酶如辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶等代替放射 性物质或荧光物质作标记物来测量。由于酶的催化作用,可使原来无色的 底物通过水解、氧化或还原反应而显示颜色,根据显色的程度来确定样品中 的浓度。法不但具有其他超灵敏度检测技术所具有的检测灵敏度高、特 异性强的优点,而且还可避免其他方法的不足之处。法是以抗原或半抗 原与抗体之间特异性亲和反应为基础的免疫标记技术,不需要象法那样 对样品进行特殊处理,也不需要特殊设备。相对于法、法来说, 法是以酶做标记物,具有标记物稳定,有效期长,重复性好,不污染环境,自 动化程度高,操作简便快捷,应用范围广的优点,是一种很有发展前途的方 法。 .酶联免疫吸附分析法 法【是年由荷兰学者 与和瑞典学者 与几乎同时提出的。基本原理是固定在合适载体上的抗原或 抗体与相应的酶标抗体或抗原形成酶标记的抗原抗体复合物,在酶底物参与四川丈学硕士学位论文 下,复合物上的酶催化底物使其水解,氧化或还原成另一种带色物质。在一定 条件下,酶降解底物和呈现颜色成正比,因此可通过显色程度知道反应的抗体 抗原的含量。酶联免疫吸附分析法是以抗原或半抗原与抗体之间特异性亲和反 应为基础的免疫标记技术。抗原物质分为完全抗原和半抗原。完全抗原同时具 备免疫原性和免疫反应性。前者指具有 刺激机体产生免疫应答能力的特性,既抗原性:后者指具有与相 应抗体发生特异性亲和反应的特性。完全抗原是指具有免疫原性和免疫反应性 的一些大分子物质,如蛋白质、多糖等,其分子量一般都大于。半抗 原是指有免疫反应性而无免疫原性的物质。环孢菌素是半抗原,分子量为 . 。 法根据抗体抗原反应动力学可分为竞争性法和非竞争性 法,其基本程序如图.所示【】。 非竞争法 .双位点夹心法检测抗原 洗涤弃去 ? 分析物 过量?’? .双位点夹心法检测抗体 ?洗涤弃去 ? 分析物过量 竞争法 .酶标抗原法检测抗原 ????? 一 ‘分析物’驾舭?飞 洗涤弃去 矗 型查兰堕.:兰竺堡兰????? .酶标抗体法检测抗原 ?????广口匕十? ‘分析物’垄兰竺宝旷眦旷 洗涤弃去 矗 图。非均相固相酶免疫分析的基本设计程序 ? .. 代固相支持物,代表酶,代袭酶的相应底物,代表底物在酶的 作用下产生的产物,代表抗原,代表抗体。和分别是舨 的抗体,.是的抗体,同时又是:的抗原,:是;的单克隆抗体。 根据反应体系与检测体系之阔的关系也将法分为直接法和 间接法。直接法是将抗原吸附于固相载体,用酶标抗体来检测,而间接 法是将抗体吸附于固相载体,用酶标抗原来检测。 法发展迅速,比较常见的有浸测试剂条法,免疫浓缩法,多层免疫 试剂条法等检测模式,基本上都是双位点夹心法。 .小分子的夹心法 法已经广泛用于蛋白质等大分子抗原和抗体以及药物,激素等小 分子的灏定。对于大分子物质,由于具有多个抗原决定簇,可使用常见的夹心 型免疫检测方法,能提高检测的灵敏度和特异性。而是小分予半抗原,对 于小分子物质,由于其与抗体结合的“单价”特性,与一分子抗体结合后,就 不能再跟另外的抗体结合,所以不适合用夹心法测定。 小分子半抗原的酶免疫分析技术多采用液相竞争法,但操作繁琐,重复性 差。为开发出理想的小分予半抗原酶免疫分析技术,人们作了很多努力。最 近, 】。 有用小分子夹心法酶免疫技术测定小分子的报道 等人【“】提出小分子夹心法酶免疫技术测定。他们在化学合成小分子 二聚体的基础上,建立了检测睾酮的夹心酶免疫实验。大大提高了睾酮测定 的 敏感性和特异性。在检测中,先用睾酮特异的抗血清包被固相载体,再加入睾 人学坝学位论文 酮分子的二聚体和待测睾酮以及酶标抗睾酮抗体,根据与固相抗体结合的睾酮 二聚体的量和待测睾酮成反比的关系可算出待测睾酮的量。在这种检测方法 中,睾酮二聚体连接固相抗体和酶标抗体,形成双抗体夹心复合物。 等人【】建立了小分子两位点酶免疫检测方法。在检测中,合成 的小分子一亲合素结合物起到连接固相抗体和生物素一酶结合物的作用。这一 方法由于亲合素一生物素一酶的放大作用,检测的灵敏度较高。 李金命【】等用地高辛为指示分子,化学合成地高辛和的二聚体, 用抗抗体、一地高辛结合物和抗 ’建立了小分子 的夹心法,并探讨了双抗夹心酶免疫测定方法。这一方法使用了不 均一的二聚体一地高辛结合物把表面看来不相关的两部分结合起来实现 的双抗体夹心法的检测。 另外李金命等【】还用地高辛一人血清白蛋白为中介体,建立了地高辛小分 子夹心法。与普通法比较,该方法具有更高的灵敏性,特异性好。 在这~检测中,用小分子一蛋白质取代小分子二聚体,蛋白质只起到载体作用。 通常,这类检测程序设计是先将半抗原通过化学方法连接到一个化合物 上,形成具有两个或多个半抗原的稳定结合物。测定时将半抗原结合物与待 测 样品竞争性地和固相抗体结合,洗涤后加酶标抗体,再洗涤后加底物显色。研 究表明该检测方法不仅简单易行,而且能提高检测的灵敏度和特异性。 前人的工作虽然只是针对某一种小分子建立了夹心法,但他们的研 究为后人进行小分子的酶免疫检测技术的研究开拓了思路。总结他们的工作, 不难发现其共同的地方,即通过化学合成的方法生成小分子半抗原的二聚体、 多聚体,使其具有二价性、多价性,并在此基础上建立小分子半抗原的夹心 法。比较二聚体、多聚体做中介建立小分子夹心法的特点,本文 认为虽然小分子一蛋白质的合成及分离纯化比小分子二聚体的合成及分离纯化 要简单,但是因为小分子蛋白质结合物中小分子数量的批间差异较大,而且同 一批结合物中每个蛋白质分子上结合的小分子数量也常有较大差异,所以在 建立小分子夹心法研究中,用多价的半抗原结合物建立小分子 夹心酶免疫分析方法可能导致检测重复性差,效果并不理想,而是选择二 聚体作中介物较好。删川人学硕卜学位论文 .研究目的和任务 目前还没有成功开发出酶联免疫吸附分析方法的报道,到底什么样的 检测程序设计才能更好地实现酶联免疫吸附分析还需要继续研究考察。前 人针对某一种小分子建立了夹心型法的研究表明,该方法能提高检测的 灵敏度和特异性,这就为建立的夹心型法检测提供了思路。本文研 究工作的目标就是提供建立环孢菌素的夹心型法所需要的物质基础, 以建立环孢菌素的法,并通过建立环孢菌素的法的研究工 作,为以后建立其他物质的法探索合适的思路和技术。具体在环孢菌素 的夹心型研究中需要做的相关研究内容及相互关系如下图.所示。 囡囤 图.建立的研究工作内容 .. 从图.可见,获德环孢菌素的二聚体以及人工抗原的合成是建立环孢 菌素的夹心型的关键和基础。本文重点是进行的二聚体合成路 线与工艺的研究,同时对合成的蚺人工抗原进行检测鉴定,并为抗体制备提 供人工抗原合成产物。 型型查兰堡::兰些堡兰 ??????????????????????? 一????????????????????????????????????,?????????一 .环孢菌素二聚体的合成研究 ,合成环孢菌素二聚体的目的和意义 以二聚体为基础建立的夹心法的基本原理如图.示【】。 掣 怍钿 卢 皓嚣~攀 阡咖 半抗原 固相 二聚物 酶抗 标体 测抗原 抗体 制燃 几? 闭潦廨物 铂潞一 帅夕 夕一物 咖夕 图.夹心酶免疫检测法基本原理..在环孢菌素人工抗原合成研究中,本文采 用了将化学修饰后的与聚 .赖氨酸发生偶联反应生成环孢菌素人工抗原的路线见第三章。的 化学修饰作用在的位残基侧链,这与环孢菌素二聚体合成研究中 的化学修饰位置相同。当生成的人工抗原用于动物免疫实验后,获得的 单克隆抗体应是针对的非化学修饰部位的。因此,在检测过程中,一个待 测抗原与一个抗体结合后就不能再与其他抗体结合,而一个二聚体与一个 抗体结合后,仍可以和另外一个抗体结合,形成抗体一二聚体一抗体复合物, 用 于检测。一 型型查兰堕主兰竺堕苎????????????????一 。【法正是基于抗体一半抗原二聚体酶标抗体复合物的形成和检测 夹. 而建立的。而半抗原二聚物在检测中起到联结抗体和酶标抗体的桥梁作用, 合 成二聚体是建立夹心法的基础和关键。 .确定环孢菌素二聚体合成方案 年等确定了其结 年,瑞士药厂首次发现了, 构【。是山十一个氨基酸残基组成的环状多肽,其分子结构式如图. 所示。 口. 足? : 毪严 。’褥鹊 。?一:琶妻三一一。。一二一一。。::一。。三莹。 ?靶一蓼艇叱冬怠 图 环孢菌素分子结构式在肽链的十一个氨基酸残基中,有七个是端甲基化 的。位氨基酸残基 是认分子中唯一含有活性基团的一一一一丁烯基一,一 二甲基一一苏氮酸。由于空间俺胆的影响。位残基上羟基和 双键的活性也比较低。所以要舍 的人工抗原,必须通过化学方法对 分子作出一定的改造,引入活性基团如羧基、氨基等,进而实现的二聚体 塑型叁堂堡.:兰丝堡苎???? 的合成。 ..确定环孢菌素化学修饰的路线 为了在分子上引入活性基团,人们进行了不少探索和努力。由于在 分子中,只有位残基侧链上有活泼基团。所以,对于化学修饰的报 道通常是在位残基侧链上进行的。其中羟基由于受到空间位阻的影响,反应 活性降低,所以目前关于利用上羟基的活性进行化学修饰的报道较少。大 多数关于化学修饰的成功报道都是基于双键的反应活性而进行方案设计 的。 锄.等人】于年提出一种氧化双键形成羧酸的合成方法。先 将上的羟基通过乙酰化保护,然后用四氧化锇把上的双键氧化成顺 式二醇,再用高碘酸钠将其氧化断链成醛,分离纯化后将醛与羧甲基羟胺半 盐 酸盐在碳酸氢翎盐溶液中反应形成希夫碱,从而引入羧基。 等人【 在年提出将上的羟基保护后,用过氧乙酸 对上的双键进行环氧化。利用双键环氧化后的产物的活性可继续进行其他 反应。 等人【‘】于年提出将羟基保护后的分子与高锰酸钾/高碘 酸钠复合氧化剂反应,使双键氧化断键生成可供偶联的羧酸。 等人?于年提出以.氨基己酸为桥在臭氧化处理双键后 的分子上引入氨基。 等人【州于年报道了在分子位残基上进行结构 改造的方法:环孢菌素与一氯化过苯甲酸在碳酸钠存在下发生氧化反应, 由于的环氧化物不稳定,重排为更稳定的五元环结构内酯衍生物,再经过 与过量乙二胺开环反应得到环孢菌素的氨基衍生物。 江辉等人剐于年对以上方法进行改进,合成了的氨基衍生物。 在叔丁醇反应溶剂中,碳酸钠存在下,与高锰酸钾偷碘酸钠复合氧化剂反 应,然后再与反应。产物与过量乙二胺反应,得到的氨基衍生物。 这些方法都是在氧化双键的基础上引入活泼羧基的。通过氧化方法对 进行化学修饰的方法都有一定的缺点,如涉及的反应步骤多,反应时间长,氧 化反应的条件不容易控制,副产物多给分离造成困难,反应收率低等。 四川人学硕学位论文 此外,等人‘】于年还提出了一种利用光反应引入活泼基团 的合成路线。将与光敏化交联剂苯甲酰基苯甲酸溶于苯中,用 紫外灯产生的紫外光,在室温下光照小时,发生光解反应将含 有羧基的连在上,生成?共轭物,引入羧基。 采用光化学反应引入活性基团的方法具有条件温和,不需要特殊的反应和 分离设备等优点,而且光激活的中间体不会断开肽键,更大程度地保存了 的结构特征。 在本文中,由于的检测法是以抗原和抗体的特异性亲和反应 为基础的,所以应该在化学修饰中尽量少的对分子结构进行改造,特别是 要保证环状结构的完整性。在对前人工作的总结基础上,结合对相关化学 反应特点的理论分析,本文选择采用光化学反应引入活性基团的方法,在 上引入羧基,即在紫外光的照射下,与光敏化交联剂一苯甲酰基苯甲酸 反应,生成共轭物,在上引入羧基。 ..确定合成环孢菌素二聚体的路线 通过化学方法在上引入活性基团后,可幂用活泼基团的化学反应活性 来实现二聚体的合成。目前还没有查到将两个连接在一起的成功报道。 由于?上羧基直接联在苯环上,受到共轭效应的影响,反映活性不 高,加上空间位阻的影响,可能较难直接反应生成二聚体,可考虑用双官能团 分子联结,如乙二胺、己二胺等。从夹心法检测技术的角度考虑, 双官能团分子的长度对检测结果是有一定影响的。长度太短,可能造成两个 分子过于接近,从而在空间结构上产生变化,影响抗原和抗体在空间结构上 的 对应,不利于抗原抗体间的反应;如果双官能团分子过长,可能会出现二 聚物中两个分子由于在空间上自由伸展过大,同时与固相抗体结合而造成 检测误差。因此本文初步选择胺做双官能团分子,这主要是考虑到经 过光化学反应接上后分子侧链长度已经有一定的延长,使用链长较短的乙 二胺分子有利于避免桥链过长造成的不良后果,而且乙二胺分子结构简单, 价 格便宜,使用方便。等人【在建立检测睾酮的夹心酶免疫检测方法时,就 是以乙二胺为桥,利用睾酮上羧基的反应活性,实现了睾酮二聚体的合成。 二聚体的生成是基于羧基和氨基的反应。羧基和氨基的反应称为酰胺 心川人学硕学位论文 化反应。反应机理如图.所示。 : 五 一;?一 一?。 一一。 : ,:裔 ,羔??一一。:。一 酰胺化反应一般通过以上两步来进行,第~步是羰基的碳上发生亲核加 杂化,是一个四面体结构。 成,形成一个带负电的中间体,中心碳原子为 第二步,反应中间体消除一个离去基团,形成羧酸衍生物。因此将此类羰基化 合物的亲核取代反应叫做羰基的亲核加成一消除反应。 通常,从酸酐或者酰卤化物可制备高产率的酰胺化合物,但对于自由羧 基和氨基来说,它们的酰胺化反应往往要求某一种反应物质过量并且要通过 加热等方法连续除去反应中产生的水,这就给反应操作带来很多麻烦,特别 是对于某些对温度敏感的物质,这类方法显然是不适用的。 因此多年来,人们一直在寻找新的方法,使等摩尔量的自由羧基和氨基 的酰胺化反应的条件更温和,操作更简便。为了使酰胺化反应较易发生,可 活化氨基,也可活化羧基,但迄今为止,普遍使用的是活化羧基的方法。常 用的活化羧基的方法有混合酸酐法、活泼酯法、碳二亚胺法等【?】。 混合酸酐法:在低温和叔胺存在下将羧基组分同氯甲酸酯反应制成混合酸 酐,然后将生成的混合酸酐与氨基组分反应。 叶?即吼?删茹? 混合酸酐法简单,反应释放出和醇,有利于产物分离纯化。但是由 于活泼中间体很不稳定,所以在制备酸酐时要严格保持低温,保持所用的仪 四川大学硕:学位论文 器和溶剂干燥。 活泼酯法:在低温下,羧基组分和一羟基丁:酰亚胺反应生成活泼酯, 然后与氨基组分反应。??. 召 否 活泼酯中间体具有一定稳定性,可以分离纯化保存,但是活泼酯立体效 应大,反应活性不高,反应速度幔。 碳二亚胺法:在低温下,羧基组分同,’.二环己基碳二亚胺反应生 成活泼中间体.酰基脲,然后与氨基组分反应生成酰胺化合物,并释放一分 子,’一二环己基脲。 唧?拈‘一言篡柑。 碳二亚胺法反应生成的在多数有机溶剂中溶解度小,很难完全除去, 后来发展了水溶性的碳二亚胺缩合剂,可避免这一麻烦。 近年来,随着多肽物质的发展,人们设计、合成了更多新的多肽缩合剂, 简化了酰胺化反应的操作,提高反应产率,反应条件温和。碳二亚胺法、活 泼酯法、混合酸酐法等渐渐被各类鲶盐法所代替。其中用毗啶鲻盐做缩合剂 可以高效促进酰胺键的形成,具有反应速度快、收率高、反应条件温和、操 作简单等优点,特别在生成商空间位阻的酰胺键时有令人满意的结果【。 本文通过光化学反应在分子上引入羧基,再利用羧基的反应活性通过 酰胺化反应实现二聚体的合成。酰胺化反应中的亲核取代步骤发生在与 苯环相连的羧基的羰基碳上。羰基碳原子是杂化,它的三个键以三角形结 构分布在同一平面上。羰基碳的正电性是亲核试剂对这个碳进攻的原因。羰基 碳上连接的基团对反应有一定影响,吸电子基将增强羰基碳的正电性,有利于 亲核试剂的进攻。如果是推电子效应则效果相反。在本文中,中的羧 基接在苯环上,由于受到共轭效应的影响,羰基碳的正电性减弱,不利于亲核 杂化。 试剂的进攻。亲核加成后所生成的中间体其碳原予由杂化变为 即角结构转变为四面体结构。如果原来羰基碳原子上连接的基团过于庞 川人学明士学位论文 大,在四面体结构中就显得空间过于拥挤面不利于反应的进行。本文中苯环与 大分子相连,空间位阻较大,不利于.的酰胺化反应。上述电子 效应和空间效应都将对第一步的反应速度有所影响。总的反应速度与两步反应 速度都有关系,但第~步较重要。第二步反应是否进行,取决于离去基团的碱 性,碱性越弱。越易离去。当?直接与氮基组分反应肘,离去基是羟 基,不是~个很好的离去基。 从以上分析可知,对于.分子来说,很难直接通过自由羧基和氨 基的反应来生成二聚体,需要对羧基迸行活化,根据.分子上羧基反 应活性低,空间位阻大的特点,本文最终选择一溴.一乙基一吡啶四氟硼酸盐 做缩合剂,以实现.分子二聚体合成。 ,,环孢菌素二聚体合成方案 通过对化学修饰以及酰胺化反应进行分析,本文卒刀步确定了二 聚体的合成方案,实验部分合成路线如下: 乙二胺 ??一聚体 即在光照条件下条件下,与光敏化交联剂苯甲酰基苯甲酸 反应,生成共轭物,分离纯化后,在.溴.一乙基吡啶四氟硼 酸盐作用下,与乙二胺反应生成二聚物。反应分为光解反应和酰 胺化反应两步。心川火学硕:卜学位论文 .环孢菌素二聚体的合成 ..试剂和器材 表 实验所用试剂 名 称 规 格 生产厂家 环孢菌素 杭州中美华东制药有限公司 一苯甲酰基苯甲酸 丙 酮 中国成都金山化工试剂厂 无水甲醇 成都化学试剂厂 三氯甲烷 成都化学试剂厂 二氯甲烷 重庆东方试剂厂 厶 酸 四川德阳化学试剂厂 一乙基一一一二甲氨 基丙基碳二亚胺盐酸盐 二甲基甲酰胺 天津德信化工公司试剂分厂 成都无缝钢管有限 商纯氮气 ???? 塞堡垒望堡墨 硅胶“型 中国青岛淘弹化工集团公司 叔丁醇 上海化学试剂站中心化工厂 胺 广东西陇化工厂 三乙胺 成都科龙化工试剂厂 ?一氰基一一羟基一肉桂酸 公司 ?兰型坠兰至薹堕鐾璺堑塑墼垫坚 奎塞些堕三些堡塞叁垫 硼 酸 成都化学试剂厂 三羟甲基氨基甲烷 竺坚些坚 一 乙二胺四乙酸二钠 成都化学试剂厂 ?????一 叫』『大学预学位论文 表 实验所用主要器材 名称 型号及生产厂家 型 红外光谱仪 肼 一型或 紫外光谱仪 /蛋白质分析仪 核磁共振仪 一型 显微熔点仪?型,四川大学科仪厂 水环真空泵 ?型,河南巩义市英峪豫华仪器厂 旋转蒸发器 型 碘镓灯 ,成都灯泡厂 电子天平 型, 公司 医用氧气袋 型,上海医疗器械工业公司 飞行质谱仪型,公司 ..光化学反应 ...反。应机理 在光化学反应中,本文选用苯甲酰基苯甲酸作光敏交联剂。 分子式如下: 在光激发下,羰基化合物通常会出现两种类型的激发:。?。、。一。. 对于带有强的释放电子基团的某些芳酮类和醛类,也可能出现电荷最终迁移 到 羰基氧上而产生的电荷转移态态‘冽。这三种类型的激发态一“?、。 一、具有不同的电子分布: 叫川人学硕:学位论文 戳 \ \巧 一 一 ? 一 《 \\。 口 ?一? 当发生一“跃迁时,氧上的非键电子对中的一个电子,从定域在羰基平 面中的轨道跃迁到离域在羰基之上的反键轨道。轨道中电荷更多地离域 在碳上,激发态时碳上的电子密度比基态高。两氧原子激发态时电子相对不 足, 使氧原予带有局部形式的正电荷,羰基氧原子表现出良好的亲电性。在? 跃迁中,羰基不明显参与作用,因此保持了羰基的正常极化。而在跃迁 中,羰基是电子受体,氧原子上出现形式上的负电荷。 原则上,所有酮类的?态都具有“?的某些特征,而在反应溶剂 和其他实验条件相同的情况下,一定结构的酮类具有相应的主要最低三线态 激 发态形式。研究认为二苯酮以?态为主要贡献结构,从结构分析, 为羧基对位取代的二苯酮,其激发态以?态为主要贡献形式。 具有亲电子中心的激态可能发生氢提取反应和双键的加成反应膦。 侧链有一个不饱和双键,激发态还可与双键发生光环化加成,生 成产物。反应机理如图.所示。 ?。。一 激发三线态 矗一 双自由基中间体 图。环化加成反应 ? .. 心川大学坝二学位论文 羰基化合物与烯烃的光环化加成一般是以羰基化合物的一态进攻一 个不饱和化合物的方式进行的【”。在反应中,羰基氧非协同地加成到烯烃的 体系上,形成双自由基中间体,双自由基电子自旋反转配对后形成第二个键, 生成氧杂环丁烷。 如果在附近存在适当的氢供体,具有亲电子中心的激发态则可发生氢 提取反应,理论上分子中的各个氢原子都可以发生氢提取反应,反应的效 率取决于氢供体的亲核性。由于共轭效应和空间位阻的影响,双键末端位的 氢活性更大,将优先被提取,即最可能的结构为: 影父 夺氢反应机理【】如图.所示: 婚? 蠢 篙 /、人赢~ 。一;土》。。一?. 笛 广。一竖叫川大学硕上学位论文 土 鼍一 篙 广,面一 图,提氢反应 ?激发三线态先从分子中随机的提取一个氢形成羟基碳自由基,同 时分子失去一个氢原子后形成自由基。如果的羟基碳自由基与 自由基结合就生成偶联物,如果它们的单自由基自身结 合则生成副产物,。由于分子较大,其单自由基?碰撞的几率小, 形成的几率也就小,而的羟基碳自由基有较大几率形成嘲哪醇。 综上所述,激发态的分子可能与分子发生两种不同类型的反应, 即氢提取反应和与双键的光环化加成反应。两种反应虽存在着竞争,但它们 都 能将具有反应活性的羧基基团引入分子,符合本文对分子进行化学 修饰的目的和要求,都可作为反应的产物用于下一步实验反应。 ...反应条件的选取 反应式 一尘一,? 光源 在光解反应中无论是氢提取反应还是双键加成反应都主要通过激发 的?跃迁实现的。要使分子被激发到?三线态,就必须提供相 应于其紫外波谱中的波长范围内的紫外光。为了选择合适的光源,本文首先 考 察了分子在溶液中的紫外吸收情况。在甲醇中的紫外吸收光谱图如图 .所示:删川火学硪一学位论文董? 篓 擎. .波长 图 在甲醇中的紫外吸收光谱图善。从图.可看到,存在两个吸收带,在左右出现 一个峰形较宽 的吸收峰,吸收强度较大,这是芳环上的一?。跃迁。在左右还出现 一个峰形较宽且强度较弱的吸收峰,这对应于,~不饱和酮基的一“ 跃迁,实验中的光化学活性即源于此。即反应需要提供范围 的紫外光。 常用紫外光源主要有各种不同压力的汞灯、高压氙灯、金属卤化物灯等, 本文综合考虑了各种灯源的发射谱线、价格等因素,最后选取了一般用作照 相 和复制用的碘镓灯作为紫外光源【,其发射光谱见下图: 波长曲 图. 碘镓灯发射光谱图 ..四川大学硕士学位论义 碘镓灯能在的波长范围内产生较强的辐射,而且具有较好 的再现性,因此对的光化学反应来说是一种比较合适的光源。 溶剂 溶剂的选择要综合考虑多方面的因素。首先,反应溶剂应尽量不吸收反 应波长范弱的光。第二,具有反应惰性。第三,能溶解反应物,使反应在均相 进行。第四,要方便分离。为了满足以上要求,本文从溶剂沸点,极性以及作 为氢供体的活性考虑选取了以下溶剂作比较。 表.光反应溶剂比较 .鎏型 堑 盛 笙堡 文献选用苯为光反应溶剂,但其溶解能力差,反 。 . 本 不合适 应很缓慢 婴墨垡壁婆亘适望墨:堡鳖堡垒墅墼垄堡差:壁叁篁星壅 至鱼望 查 旦至坌塑鳖型:里型垦鳖壁墼堑塑竺坠堕堡垄差 丕鱼垩 极性很大,有利于溶解,但可能会使激发态发 .。 ,. 乙豫 不合适 生转移,从而使。一。?跃迁成为最低激发三线态 ”“ 乙酸糕?孑嚣:曼黧羹雾礼礁徽“不合适 电子质子化,造成?激发态消失 。“ 供体,与 竞争,猝灭?三线态 异丙醇蓑嚣冀篓尝竺鐾恸湫舱一 对反应物都有较好的溶解性,不会吸收吼左右的紫 叔丁醇 可诜 通过以上分析,本文认为叔丁醇和丙酮可满足作为光化学反应溶剂的要 求,在实验中分别用叔丁醇和丙酮作反应溶剂进行具体考察,结果见 ....。 反应器 在本实验中,?的紫外光是反应必需的光源,所以反应器的 川大学坝卜掌位论文 材质选取必须保证它对这一波长范围的紫外光有良好的透过作用【】。普通 玻璃 器皿由于在该波段处的透过率太低在处仅为%左右而不适宜用 作该反应的反应器,而一般常用的石英玻璃对以上的紫外光几乎都没有 截留作用,透过率很高,但以下的能量较高的短波紫外光可自会引发副 反应,还可能使的结构受到破坏,因此也是不合适的。本文通过比较,最 终选取了型分光光度计的比色皿作为光反应的反应器,它的 。 透光率曲线见图 . 鬟? 嚣? 捌. 蜊. . 波长 屡.比色皿的透光率曲线图 。通入氮气 通入氮气主要是为了排除溶液中的氧气,因为基态分子氧是对有机分子 单线态和三线态的有效猝灭种觋。氧分子的基态是三线态,它有两个能量很 低 的激发单线态,它们的激发能分男?为/和 /,因此具有低至 /激发能的敏化剂都可以通过能量转移而被猝灭。此外,三线态激发 态氧分子本身是一种活性分子,它可以加到激发的分子上或从激发态分子提 取 一个电子,这些过程都可以导致猝灭。所以为了提高光解反应的产率,防止副 反应发生。要排除溶液中的氧。在氧饱和的溶液中,的压力下,氧 分子的浓度约为×,具有中等猝灭作用。在用氢气饱和脱气后的溶液 中,氧分子的浓度为×/,猝灭作用大大降低。通入氮气还可以起到搅 拌作用,使溶液混合均匀,另外还能减少高浓度的光子在反应容器壁旁的簿 层 中产生的浓缩效应的影响。 反直物鲍匕双四川人学硕二学位论文 从前面的理论分析可知道,对于提氢反应,最有可能发生在环孢菌素 的位残基侧链上的双键的末端,当末端位的一个氢被提取后,由于空间位 阻的影响,很难再发生位的其他氢被提取的反应:对于光环化加成反应,环 孢菌素和的理论比为:。从理论上分析可知,环孢菌素和的光 反应产物基本上是环孢菌素和以:反应生成的。由于环孢菌素本 身价格昂贵,所以希望反应在允许的条件下能提高环孢菌素的转化率,降低 成本。增加在反应物中的比例在一定程度上是有利于提高环孢菌素的转 化率,但增加的量更有利于的羟基碳自由基形成嘲哪醇的反应,所以 一味增加的量极有可能使反应生成大量噤哪醇副产物,不利于产物分离, 故在实验中要按有限过量的原则确定环孢菌素和配比。 光照距离和反应时间 光化学反应是由光提供反应能量的,反应体系要与光源保持足够近的距 离以利于光能的吸收,但并不是越近越好。因为碘镓灯需要在以上的高 温下激发,在发光时,有大部分电能转化为热能,所以光源周围温度较高,容 易引发副反应,溶剂挥发严重,因此需要选择合适的光照距离。在具体实验 中, 用薄层色谱法监控反应过程,以确定适宜的反应时间。 .。。实验操作 .... 与的反应 用电子天平称取,摩尔比约为:.装入比色 皿中。用移液管加入. 叔丁醇,连续通氮气约一刻钟后、溶解完 全。比色皿外部用冰水冷却以减少溶剂损失。启动碘镓灯开始光照,光照距 离 约为厘米,光照时间约为小时。每隔小时左右补加叔丁醇、换碎冰、 图. 小板示意图 .. 四川大学硕:学位论文 取样,用毛细管点板,在::的二元展开剂中展开,用紫外灯 显色。情况如图.所示。 、样为反应过程中取样。从图. “样为未反应的、混合物, 可以看出,随着反应的进行,原料,的显色逐渐变小变浅,而产物 ?和副产物噤呐醇的显色逐渐变深。当两次取样显色情况基本不变化时 可认为光解反应已达平衡。 实验最终确定了合适的反应条件,如表.所示。 表 光反应条件 . ....光反应产物分离 本文利用制各薄层层析法来进行产物的分离提纯。它具有分离速度快,分 离清晰灵敏度高等特点,特别适用于挥发性较小,不能用气相色谱分析的物 质。 制备薄层层析法的基本原理是利用混合物中各组分在某一吸附剂中的吸 附能力的不同,使混合物溶解在展开剂中,并随展开剂上升,在上升过程中, 遇到新的吸附剂时被吸附,接着又被不断流过的展开剂溶解,再随展开剂上 升, 从而在不断的溶解、吸附,再溶解、再吸附的过程中实现分离。 在以硅胶为吸附剂的研究中,化合物的吸附性通常与它们的极性成正比, 化合物分子中含有极性较大的基团时,吸附性也较强。吸附剂对各种化合物 的 吸附性一般有如下次序: 酸和碱醇、胺、硫醇酯、醛、酮芳香族化合物卤代物、醚 稀饱和烃 本实验选氯仿:甲醇:的二元展开剂和二氯化碳:甲醇:乙酸 ::的三元展开剂。在本实验中,有不饱和双键,是酮类物质, 嗍哪醇为醇类物质,在硅胶为固定相,二元展开剂为流动相的实验中,吸附次 序为噤哪醇。用展开剂展开时噤哪醇最难被展开剂 溶解带走,它吸附在载体的最下部分,其次为,然后是,处 于载体的最上部分。四川大学硕.:学位论文 具体实验操作如下: 用注射器将该光化学反应后的残余液约,略呈淡黄色在 ×的大荧光薄层层析板的一端点成一均匀细线,晾干后置于盛有二元展 开剂的展开槽中展开,约,小时后取出层析板,标记出溶剂的前沿线。将板 置于通风橱中使溶剂挥发至于。在紫外灯下显色,刮下值约为.的颜色 较深的一带,用×的无水甲醇洗提。离心分离约分钟,上层清液合 并后再离心约分钟,得到澄清洗提液。洗提液在减压下旋转蒸干即可得白 色的固体粉末状产品。所得产品用二元展开剂展开,产物为一个点值约为 .。 ...实验结果讨论 ....溶剂的影响 在光反应实验中,本文选用了叔丁醇和丙酮两种溶剂进行考察。实验表 明,叔丁醇和丙酮做溶剂都能获得较好的效果。由于考虑到微量操作的影响, 还不能明确分辨出两者在提高收率方面的优劣。通过实验发现丙酮做溶剂的反 应收率重珊生不如叔丁醇好。这跟反应是微量操作有关,反应在光照条件下通 氮气进行,紫外灯要在高温下激发,而且在将电能转为光能时还产生大量的热, 所以虽然反应用冰冷却,但是由于丙酮的沸点较低,比较容易挥发,反应过程 中随着溶剂的减少,光照面积减少,反应体系不稳定,引起反应收率不稳定。 而叔丁醇沸点较丙酮高,能有效避免溶剂挥发带来的不稳定性,从放大实验的 角度来说,叔丁醇做溶剂能提高系统稳定性,是较好的选择。 ....产品鉴定 由于缺乏光解产品的标准物性数据,本文对其鉴定主要通过以 下途径: 薄层色谱法展开后各物质停留在薄板上的不同位置用相对比移值表 刁耳: 溶质的最高浓度中心至原点中心的距离 。 一 溶剂前沿至原点中心的距离值与溶质在固定相和流动相间的分配系数有关, 因此在一定的层析条 件下,对于一定的组分,值是一定的。尽管值容易受操作条件的影响而稍 有变化,仍然可根据值迸行定性鉴定。 在本文中,光反应产物的值为.,与文献值【 接近,可初步判 断产物为? 测定熔点 本文分别测得反应物、及产物的熔点如表.所示: 表.光解反应反应物及产物熔点 、、 从表,可看出,产物的熔点比两种反应物的都高,这从一个 侧面映证了该产物是与分子通过共价键连接在一起的,而不是它们 的混合物。另外由于整个实验属于微量操作,光解反应的产品量少,本文未能 对产物进行进一步的重结晶纯化,所以测出的熔程较长。 紫外光谱分析 . 罄 .?.......?? 舀. ??,.,.?? 装。 ,.毯. .波长 圉, 、及产物的紫外光谱圈 、、四大学硕士学位论文 从图.可知,的一在左右,这是肽环上酰胺键的? 跃迁所引起的,峰形较尖,到左右吸光值已很低。的。。则在 左右,峰形较宽,这是芳环上的?一。跃迁。在左右还出现一 个峰形较宽且值较小的吸收峰,这对应于,一不饱和酮基的?跃 迁。产物的。。在左右,比的大而比的小,峰形 较宽,可以看成前两种物质峰形的叠加。另外它在左右没有吸收峰,吸 光值随波长增加而单调减少,证明原上的羰基已发生了反应而不再存在。 红外光谱 以及的红外光谱图见附图、附图 以及产物 的红外光谱图对比情况见表.。 表. 、的红外光谱图比较 .坤 声搠 吸收峰 归属 说~ 明 ~ 谱图 谱图 毒蚤 谱图 :: : 至 至垄 笪垄茎型壁圭翌堡垄堡些些 从表.可见产物中出现了上没有,而在整个反应体系中只有 有的苯环的特征振动,说明产物接上了分子,而. 吸收峰在产物 谱图中消失的隋况与文中分析的在分子位残基侧链上双键发生了光环化 加成的结果一致。 核磁共振波谱 产物?的氢核磁共振谱图见附图。谱图比较复杂,这与分子中 所含有的质子数多而且所处的化学环境不同有关。在值较低的区域,出现密 集的吸收峰,对应于环肽侧链上的质子。在值为.左右的区域出现一组峰,叫 川人学坝。学位论史 ??????????????????????????? 一???????????????????????????????????????????~ 对应于环肽上的仲酰胺质子。在值.左右出现了一组峰,是苯环在氢核磁 共振谱图中的特征吸收峰,对应于产物中分子苯环上的质子,可见产物中 已经接上了分子。 飞行质谱 产物?的基质辅助激光解吸与离子化飞行时间质谱图见附图。 .图中出现了/ 的.的准分子离子峰 】。检测结果说明反应在分子上引入了分子,产物为和 的结合物。 .,酰胺化反应 ...反应机理 为了适应肽合成发展的需要,人们做了很多工作以开发出更高效价廉的缩 合卉寸。.溴一一乙基毗啶四氟硼酸盐就是人们从分子设计的角度出发合 成的一种肽缩合剂。在十九世纪六十年代,..和... 【”】报道了将甲基一.卤代吡啶碘化物用于酰胺合成的反应。后来等 人【研究了,卤代吡啶黯碘化物.并用于等摩尔量的自由羧基和醇生成酯的反 应,以及等摩尔量的自由羧基和氨基的反应,具有良好的效果。但这些反应都 罴要在溶剂回流的条件下进行,因为毗啶碘褥盐在一般溶剂中溶解度比较 小。 后来采用四氟硼酸盐代替碘盐,改善了缩合剂的溶解性,反应在室温下进行, 反应产率提高。也有人将.甲基一一溴吡啶碘化物用于合成空间位阻较大的酯类 物质,反应在溶齐回流条件下迸行“。近年,徐杰诚等人刈在综合比较各类鲔 盐缩合剂的基础上,考虑对脲鼢盐进行改造,用没有孤对电子的碳原子代替脲 鲶盐中的氮原予,再参考前人对吡啶鲶盐的研究,合成了高效缡合剂.溴.一 乙基.吡啶四氟硼酸盐,并用来成功合成了环孢菌素等多肽物质。 一溴..乙基.吡啶四氟硼酸盐与四级铵盐相似,吡啶氮上没有氢。分子式如 下: 国釜 皇 吡啶环上的五个碳原子和一个氮原子处于一个平面,以杂化轨道相互删川人学惯士学位论文 ????????????一???????????????????????? 一?????????????????????????????一 重迭形成六个口键。另外,每个原子还各有一个轨道其中有一个电子垂 直于环面,相互重迭组成电子的大?键,符合休克尔规则,个, 具有芳香性。吡啶环上不存在一般的单双键,而且碳碳键和碳氮键的键长数值 相似。吡啶环上的氮原子有五个价电子,除一一个电子参与形成环状大“键外, 其他的四个分布在环面的三个轨道上。其中两个与环上碳原子的杂化轨 道重迭形成两个氮碳键,另外一个由未共用电子对所占有。因为这一对孤对 电子不参与环上的共轭体系,所以表现出弱碱性,能与路易斯酸结合,可生成 吡啶鲶盐。 吡啶环和苯环结构相似,具有一定芳香性,但是吡啶环上有氮原子,上面 的未共用电子没有参与环的共轭体系,所以不对吡啶环起供电子共轭效应,又 由于氮原子的电负性比碳原予强,表现出较强的负诱导效应和共轭效应,对分 子中电子云密度分布情况有很大影响。和苯环相比,氮原子上电子云密度增高, 环上位,位,位电子云密度降低,位上电子云密度变化不大。应用共振 论概念,得到定性上相符的结果。 ;:一?一?一一 这些共振式可综合表示如图:当毗啶与正离子以共价键结合形成毗啶锚盐时,由于正离子的吸电子作用, 吡啶环上碳的电子云密度降低,所以对于溴一.乙基吡啶四氟硼酸盐,当其 被羧基离子进攻时,位上的卤原子容易被亲核试剂取代,形成活泼中间体, 即得到中间体.酰氧基..乙基吡啶四氟硼酸盐。 人们对一溴.。乙基。吡啶四氟硼酸盐作为缩合剂的反应进行研究【,认为 酰胺化反应可能的反应历程如图. 所示。酰胺化反应是从对羧基的活化 开始的,中间体是由羧基对毗啶环的亲核取代生成,具有与酯相似的结构特 点和化学性质。中间体与胺的反应类似于酯和胺的置换反应,生成酰胺化 合物和毗啶酮衍生物。‘川久学碳学位论立 中间体 兰竺 目、。,。 一酽 】 矗 带玎 ‖ , ; 融刚 州?? 】,“ ~一酽。南..。 图,缩合反应机理 ..” 一,却呻~ 塬艚利 氨基组分对中闻体的反应是在碱催化下迸行,反应机理如图.所示。 一。鲥?:一吼茹当?二器然’ ;盎 ~一邑一 ~??一 围.酯的脏解反应,张 鳃 凹”】入学颤,学位论文 碱的存在有助于减退质子,形成的中间体上带负电荷,促进了离去基团的 离去。在该反应中,离去基团为 /\ 沁一 相当于连有吸电子基团的苯氧基,是比较容易离去的基团。 在进一步的研究中没有检测到中间体的存在,可能是中间体很不稳定 的原因。在用红外光谱研究该反应机理的过程中发现了酰基氟的存在,于是 人 们根据现有的认识,提出该反应可能存在以下的情况”】: 七 融一融卜 一 图.可能的缩合反应 毒 . 沁一吐 岬音反应首先是羧基组分和,溴..乙基.毗啶四氰硼酸盐形成中间 体,经过活 化的羧基可能与带有氨基的物质反应形成产物,也可能竞争转化成酰基卤化 物,酰基卤化物可能作为活泼中间体参加反应,生成产物。反应中还可能产生 对称酸酐,考虑到它的反应活性还不足以完成后萄的反应,所以认为对称酸酐 不是反应的主要活泼中阊体。 ...反应条件选择 反应式 删川人学顺:学位论文 .?. .旦墅 反应物配比 传统的有机合成是逐步进行反应的,难免步骤多,产率低,操作烦杂。 最近十年来,一锅合成法圳? .? 迅速发展,避免了逐步反应的不足,具有高效,条件温和,操作简便等特点。 这一方法可将多步反应或多次操作置于一锅完成,不再分离中间产物。在本文 中,也曾设计过先合成??,分离后再跟?反应生成 ????的方案。但考虑到本文所用的原料都很昂贵,实 验投料量很少,对于微量操作实验来说,需要多次分离纯化的分步合成法较一 锅合成法并不能有利于提高产品的收率,所以,本文没有采用分步合成的路线。 该反应中羧基成分来自的一个羧基,氨基成分来自乙二胺的两个 氨基,生成目标产物的?和乙二胺理论比为:。通常,在酰胺化反应 中为了促进反应发生,希望某种反应物过量,可在实际反应中,由于? 的合成代价远高于乙二胺的价格,试图通过增加的比例来促进反应发 生的想法是没有实际意义的。在乙二胺过量的情况下,反应更趋向于生成~ 分 子与一分子乙二胺反应产物?髓?:才:。所以本文选取反应 物和乙二胺的比为:。 溶剂 反应溶剂不仅要求不参与反应,而且要对反应物表现出良好的溶解性, 便于反应物质在反应体系中充分接触。此外,还要考虑溶剂的极性