糠秕马拉色菌蛋白酶活性的研究_cropped

糠秕马拉色菌蛋白酶活性的研究_cropped 糠秕马拉色菌蛋白酶活性的研究 1 1 2 1 2 1 1曾蔚,贾文祥,冉玉帄,邝玉,熊琳,张再蓉,马巨辉 [ 摘 要 ] 目的 检测不同来源糠秕马拉色菌菌株的蛋白酶活性并研究蛋白酶活性与其致病性的关系 。方法 使 用全脂牛奶帄板法检测糠秕马拉色菌 33 株临床分离株和 28 株正常皮肤分离株蛋白酶活性 ,并选择蛋白酶活性不同的 3 株菌以静脉内注射方式感染免疫抑制小鼠进行毒力实验 ,以小鼠死亡率和帄均生存时间来评价菌株毒力 。结果 糠秕马 ( ) 拉色菌临床分离株蛋白酶活性高于正常皮肤分离株 t = 5 . 296 , P < 0 . 01, 动物试验明蛋白酶活性愈高的菌株 ,相应死 ( ) 亡率愈高 ,小鼠帄均生存时间愈短 ;蛋白酶活性与菌株致病性呈直接正相关 r = 0 . 9925 , P < 0 . 01。结论 糠秕马拉色 菌临床分离株蛋白酶活性高于正常皮肤分离株 ,蛋白酶活性高低与菌株的致病性相关 。 [ 关键词 ] 糠秕马拉色菌 ;蛋白酶 ;致病性 () 文章编号 ] 1001 - 7089 200409 - 0537 - 03 [ [ 中图分类号 ] R 379 . 4 [ 文献标识码 ] A Study the Assay f or Proteinase Activity of Malassezia Furf ur ZEN G Wei ,J IA Wen2xiang , RAN Yu2ping , et al ( )Depa rt ment of M icrobiology , S chool of B asic an d Forensic M edici ne , S ich u an U ni versi t y , Cheng d u 610041 , Chi n a Abstract : Objective To detect t he p roteinase activity of Malassezia f urf ur st rains isolated f ro m various specimens and to st udy t he relatio nship bet ween t he p roteinase activity and pat hogenicit y. Methods 33 st rains of M . f urf ur isolated f ro m clinical specimens and 28 of M . f urf ur isolated f ro m normal perso n were cult ured o n t he whole2fat2cow’s2mil k plate at 32 ?for 14 days respectively to test t he p roteinase activities. The mortality rate and average survival time of immune - co mp rised mice injected wit h t hree isolates of different p roteinase activities was observed to determine t he associatio n bet ween t he activity of p roteinase and virulence. Results There was significant difference of p roteinase activity bet ween t he M . f urf ur isolated f ro m clinical speci2 ( ) mens and normal perso n t = 5 . 296 , P < 0 . 01. Animal experiment showed t hat t he higher p roteinase activity was associated wit h t he higher mortality rate and shorter average survival time. There was a directly positive correlatio n bet ween p roteinase activity ( ) and virulence r = 0 . 9925 , P < 0 . 01. Conclusion The p roteinase activity of M . f urf ur isolated f ro m clinical samples is higher t han t hat of which isolated f ro m normal perso n. The p roteinase activity was correlatio n wit h t he pat hogenicit y. Key words : Malassezia f urf ur ; Proteinase ; Pat hogenicit y ( ) 糠秕马拉色菌 M . f urf ur为嗜脂性酵母菌 ,是人 株菌以静脉内注射方式感染免疫抑制小鼠进行毒力实 验 ,以小鼠死亡率和帄均生存时间来评价蛋白酶活性 类和温血动物皮肤的常驻菌群 ,亦是一种条件致病真 ( ) 菌 。糠秕马拉色菌相关皮肤病 MA SD有花斑癣 、马 与致病性的关系 。 拉色菌毛囊炎 、脂溢性皮炎 、特应性皮炎 、银屑病等 ,其 1 材料和方法 致病机制与菌体在皮肤上高密度的黏附或低密度的黏 1 ,2 1 . 1 菌株与培养基 菌株 : M . f urf ur 标准株由四川 附伴炎症反应有关。近年来白念珠菌产生的酸性 大学华西医院皮肤性病科冉玉帄教授提供 ; 临床分离蛋白酶被证实参与白念珠菌对表皮的侵袭和黏附过 3 4 株由四川大学华西医院皮肤性病科真菌室从花斑癣 、 程 ,与致病性相关; Co utinho 等已测得马拉色菌属 包皮龟头炎 、腹股沟脓肿患者病灶中分离并经形态学 ( ) 中非嗜脂性的厚皮马拉色菌 M . pachyder mitis能 分 5 与生化鉴定;正常皮肤分离株来源于患者正常皮肤 泌蛋白酶 。为进一步研究糠秕马拉色菌蛋白酶的特 和健康人皮肤 。菜子油培养基 : 质量分数为 1 %蛋白 性 ,本实验检测临床分离株与正常皮肤分离株糠秕马 胨 ,4 %葡萄糖 ,0 . 01 %酵母浸膏 ,1 %琼脂 ,0 . 25 %单硬 拉色菌的蛋白酶的活性 ,并选择蛋白酶活性不同的 3 脂酸甘油酯 ,1 %吐温 80 ,2 %菜子油 ; 全脂牛奶培养 [ 作者单位 ] 1 四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室 , 基 :琼脂 2 g 、葡萄糖 4 g 加蒸馏水 95 ml ,高压灭菌后 四川 成都 610041 ; 2 四川大学华西医院皮肤性病科 ,四川 成都 待温度下降至 60 ?,加入 5 ml 无菌全脂牛奶 ,充分混 610041 匀后 ,倾注无菌帄板 ,每一帄板约 16 ml ,待冷却后 ,用 ( ) [ 作者简介 ] 曾蔚 1972 - ,女 ,四川省成都市人 , 在职硕士 , 讲师 , 主要从事细菌 、真菌的致病机制的研究 。 直径 4 mm 的打孔器在帄板上打孔 ,置 4 ?冰箱保存 ,1 ( ) 8 . 7 天 。菌株蛋白酶活性 Pa与小鼠帄均生 生存时间 1 . 2 . 1 接种 待测菌株预先在菜子油培养基上培养 7 ( ) 存时间存在相关性 r = 0 . 9925 , P < 0 . 01 。7 天 ,刮下菌苔 ,用无菌生理盐水配制成含孢子数 10 8 表 1 马拉色菌临床分离株和正常皮肤分离株蛋白酶活性μ,10/ ml 的菌悬液 ,用微量加样器滴加 15l 于全脂牛 奶培养基帄板孔内 ,每株菌接种两个孔 ,用透明胶带将 ( )( )菌 株 株数 强阳性数 % Pa x? ?s 帄板封闭 ,以保持湿度 ,置孵箱中孵育 。 ( )临床分离株 33 32 96 . 97 0 . 48 ?0 . 11 1 . 2 . 2 结果测量 于培养的第 14 天取出帄板 ,10 % ( )包皮龟头炎 15 14 93 . 33 0 . 49 ?0 . 12 ( ) 12 12 100 花斑癣 0 . 47 ?0 . 13的三氯乙酸固定 2 h ,考马斯蓝 G 250 染色过夜 ,次日 ( )腹股沟脓肿6 6 100 0 . 52 ?0 . 09用脱色液充分脱色 。帄板背景呈蓝色 ,如菌株能产生 ( ) 12 42 . 86 28 正常皮肤分离株0 . 67 ?0 . 16 细胞外蛋白酶 ,则因该酶能分解蛋白质而使菌落周围 出现透明环 。测量菌落直径与蛋白分解环的直径 ,计 3 讨论 ( 算两 者 的 比 值 , 蛋 白 酶 活 性 的 值 以 Pa 表 示 两 孔 均 近年来在真菌致病物质的研究中 ,白念珠菌的酸 ) ( ) 值: Pa = 菌落直径除以总直径 菌落 + 透明环。Pa 性蛋白酶已被证实与致病性相关 : 蛋白酶能分解角蛋 值越低 ,菌株蛋白酶活性越强 。Pa = 1 ,即蛋白酶活性 白和胶原蛋白 ,使白念珠菌能利用这两种氮源从而在 4 为阴性 ,0 . 64 < Pa < 1 为阳性 , Pa < 0 . 64 为强阳性。 皮肤及深部组织中定居 、生长 ;此酶还可协助白念珠菌 黏附于宿主细胞并且对中性粒细胞 、淋巴细胞具有趋 1 . 3 蛋白酶活性与致病性的关系 1 . 3 . 1 测试菌株 选择 3 株蛋白酶活性不同的 M .3 ,7 化活性 。 ) ( f urf ur 菌株 , ?株 Pa = 0 . 25 强蛋白酶活性, ?株 Pa目前检测白念珠菌蛋白酶活性的方法常用牛奶帄 () ( = 0 . 67 弱蛋白酶活性, ?株 Pa = 1 . 00 无蛋白酶活 板法 ,原理是在含有葡萄糖 、酵母粉 、琼脂的基质中加 ) 性。待测菌株预先在菜子油培养基上培养 7 天 ,用无 入脱脂牛奶作为蛋白质底物 ,观察及测定蛋白酶分解 菌生理盐水配制成菌悬液 ,用血球计数器计数并将其 4 7 8 蛋白质所产生的透明环 。Co utinho 等 已用该方法测 浓度调节至孢子数 10,10/ ml ,用于注射小鼠 。 得非嗜脂性的 M . pachyder mitis 具有蛋白酶活性 。M . 1 . 3 . 2 动物 为雄性清洁级昆明种小鼠 ,18 ,22 g/ f urf ur 作 为 嗜 脂 性 酵 母 菌 , 它 的 生 长 必 须 依 赖 脂 源 。 只 。腹腔内注射醋酸泼尼松龙 500 mg/ kg ,得到免疫 6 本实验将牛奶帄板法加以改进 ,在培养基中直接加入 抑制小鼠模型。 7经滤过除菌的全脂牛奶 。全脂牛奶广泛应用于培养马 1 . 3 . 3 致病力的测定 用 0 . 5 ml 浓度为孢子数 10 8 拉色 菌 的 培 养 基 中 , 如 L eeming and No rt man 培 养 ,10/ ml 的菌悬液经尾静脉注射小鼠 ,每株同时注射8 基,可提供 M . f urf ur 生长的脂源和蛋白质 , 促进其 10 只小鼠 ,每天观察直到 30 天 ,记录小鼠死亡数和存 生长 。实验帄板使用考马斯蓝 G 250 进行染色 ,使蛋 活天数 ,计算死亡率和帄均生存时间 。 白分解环具有特异性且更加清晰 ,利于观察结果 。实 1 . 3 . 4 统计分析 用 t 检验比较两组间蛋白酶活性 验结果显示全脂牛奶培养基中 M . f urf ur 生长良好 ,蛋 的 差异 , 用相关分析检验蛋白酶活性 与 致 病 性 的 相 白酶活性高 ,不同菌株之间有明显差异 。关性 。 本实验中观察到来源于患病动物的 M . f urf ur 标 2 结果 准株蛋白酶活性值 Pa = 0 . 35 , 为强阳性 。33 株 M . f urf ur 临床分离株蛋白酶活性明显高于正常分离株 ;2 . 1 全脂牛奶帄板法检测 M . f urf ur 标准株蛋白酶活 而临床分离株之间 ,来源于包皮龟头炎的 M . f urf ur 与 性值 Pa = 0 . 35 ,临床分离株 、正常皮肤分离株的检测 来源于花斑癣的 M . f urf ur 的蛋白酶活性差异无显著 结果见表 1 。经 t 检验 , M . f urf ur 临床分离株的蛋白 ( ) 性 P > 0 . 05。动物实验选择蛋白酶活性强 、弱和无 ( 酶活性与正常皮肤分离株相比较 ,差异有显著性 t = 蛋白酶活性的菌株分别静脉注射免疫抑制小鼠 ,实验 ) 5 . 296 , P < 0 . 01。临床分离株中 ,来源于包皮龟头炎 ( ) 结果显示蛋白酶活性愈强 ,小鼠死亡率愈高 100 %,的 M . f urf ur 与来源于花斑癣的 M . f urf ur 的蛋白酶活 () 帄均生存时间愈短 4 . 1 天;弱蛋白酶活性的菌株 ,小 ( ) 性比较差异无显著性 t = 0 . 468 , P > 0 . 05。 7 8 () ( ) 鼠死亡率低 60 %,帄均生存时间较长 5 . 8 天; 无蛋 2 . 2 . 3 株 M . f urf ur 以含孢子数 10,10/ ml 的菌悬 () 白酶活性的菌株 ,小鼠死亡率最低 30 %,帄均生存时液经尾静脉注射小鼠 , ?株 10 只小鼠均在 10 天内死 () () 间最长 8 . 7 天,说明蛋白酶活性越强 ,致病性越强 ,亡 100 %,帄均生存时间 4 . 1 天 ; ?株有 6 只小鼠 10 ( ) () 两者密切相关 P < 0 . 01。但是 ,注射无蛋白酶活性 天内死亡 60 %,帄均生存时间 5 . 8 天 ; ?株有 2 只小 ( ) 鼠于 10 天内死亡 、1 只小鼠 14 天时死亡 30 %,帄均 菌株的免疫抑制小鼠也发生死亡 ,提示 M . f urf ur 的致 3 Ruchel R , De Bernaridis F , Ra y TL , et al . Candida acid p roteinase J . 病性不仅与蛋白酶活性相关 ,菌体产生的其他侵袭性 ( ) J Med Vet Mycol , 1992 , 30 Suppl 1: 123 - 133 . 9 物质 ,如脂酶等,也可能参与致病过程 ,其致病机制 4 Co utinho SD , Paula CR. Proteinase , p ho sp holipase , hyaluro nidase and 有待进一步研究 。 cho ndroitin2sulp hatase p ro ductio n by Malassezia pachyder matis J . 本实验建立的全脂牛奶帄板法能较简便 、准确地Med Mycol , 2000 ,38 : 73 - 76 . 测出 M . f urf ur 蛋白酶的活性 ,该方法敏感性高 , 不易 5 熊琳 ,冉玉帄 ,周光帄 ,等. 马拉色菌属的分类及其在几种皮肤病的 ( ) 分布情况J . 中华皮肤科杂志 ,2000 , 33 10: 318 - 320 . 受干扰 ,是检测嗜脂性马拉色菌蛋白酶活性的较理想 徐宏彬 ,刘维达 ,王端礼. 真菌病的免疫抑制动物模型研究进展 J . 6 的方法 。本实验发现蛋白酶活性与其致病性相关 ,为 ( ) 国外医学皮肤性病学分册 , 1996 ,22 6: 337 - 340 . 进一步研究 M . f urf ur 的致病机理奠定了基础 。7 Yamamoto T ,No hara K ,Uchida K , et al . Purificatio n and characteriza2 tio n of secreto ry p roteinase of Candida . albicansJ . Micro biol , 1992 , [ 参 考 文 献 ] 36 : 637 - 641 . 1 Schmidt A. Malassezia f urf ur : a f ungus belo nging to t he p hysiological 8 Van Belkum A , Boekho ut T , Bo sboo m R. Mo nito rin g sp read of ( ) skin flo ra and it s relevance in skin diso rdersJ . Cutis ,1997 ,59 1: Malassezia infectio n in a neo natal intensive care unit by PCR2mediated 21 - 24 . genetic t ypingJ . J Clin Micro biol , 1994 , 32 : 2528 - 2532 . 2 Ashbee HR ,Shbee A , Gl yn E , et al . Immunology of diseases associated 9 Plot kin L I ,S quiquera L ,Mat hov I , et al . Characterizatio n of t he lipase gy Reviews , 2002 , 15 , wit h Malassezia species J . Clinical Micro biolo activit y of Malassezia f urf ur J . J Med Vet M ycol , 1996 , 34 : 43 - 48 21 - 57 . 210213 [ 修回日期 ] 2004203210 2003[ 收稿日期 ] 两组疗效比较 例 表 1 短?篇? ( )组别 例数 痊愈 复发 复发率 % 治疗组 30 27 3 10 . 0 α重组人干扰素22b 联合液氮冷冻治疗 20 11 9 45 . 0 对照组 多发性跖疣的临床观察 5 讨论 为了有效降低多发性跖疣治疗后的复发率 ,目前治 吴伟伟 ,盛晚香 ,车辙 疗的重点是提高患者皮损局部的免疫功能 。液氮冷冻治疗是 目前较为常用的方法之一 ,液氮所产生的低温 ,可很快引起细 ( 1 临床资料 50 例均为本科门诊就诊的多发性跖疣患者 疣 胞冰晶形成 、变性 、中毒 、细胞膜破裂 ,同时低温可抑制病毒的) 体数目 3,30 个,其中男 22 例 ,女 28 例 ;年龄 18,51 岁 ,帄均 活性 ,使机体对失去活性或被抑制的病毒产生相应免疫力 ,从 26 . 4 岁 ; 病 程 2 个 月 , 6 年 , 帄 均 2 . 5 年 ; 疣 体 大 者 直 径 0 . 8 1 α而使体液免疫和细胞免疫均得到增强。重组人干扰素22b 是cm ,小者针头大小 。局部有严重感染者 、近 2 周使用其他相关 一种广谱抗病毒及提高免疫功能的生物制剂 ,能有效地抑制 病 药物或局部治疗者 、未按规定治疗或复诊者不列入 。随机将患毒 ,调节机体免疫功能 ,增强机体对 HPV 感染的防御反应 , 从者分为治疗组 30 例 ,对照组 20 例 。 α而弥补物理治疗的不足 。因而 ,重组人干扰素22b 局部注射 联 合液氮冷冻治疗多发性跖疣可增强局部细胞免疫和抗病毒 作α( 2 治疗方法 治疗组 :取重组人干扰素22b 深圳市海王英特 用 ,达到根治效果 ,防止复发 ,并能有效避免其不良反应 。在 治) 龙生物技术有限公司生产100 万 IU 溶于注射用水 0 . 5 ml 后 疗后 3 个 月 的 随 访 中 , 治 疗 组 30 例 患 者 中 仅 有 3 例 复 发 加入 1,2 ml 2 %利多卡因注射液 ,于常规消毒后的皮损基底 () ( ) 10 . 0 %,对照组 20 例患者中有 9 例复发 45 . 0 %,两组复发 部作放射状注射 ,至皮损变白为止 ,随后以液氮为致冷源进行 2 ( ) 率比较差异有显著性 P < 0 . 01。本方法简单经济 ,疗效好 ,不 良反应少 ,是治疗多发性跖疣的有效方法之一 ,可供临床选用 。 ,3 次冻融 ;对照组单纯采用液氮冷冻法 。两组根据皮损情况 每周重复上述治疗 1 , 2 次 。治疗结束后每隔 2 周复诊 1 次 , 观察皮损复发情况 ,连续观察 3 个月 。 3 疗效判定标准 痊愈为皮损完全消退 ,恢复正常皮纹 ,无自 [ 参 考 文 ( 觉症状 ,3 个月内患处原位及邻近皮肤 距原发疣 0 . 5cm 范围 献 ] ) 内未见疣体生长 ;复发为治疗后 3 个月内在皮损原位及邻近1 魏国 ,岳春雯 , 张春敏. 治疗尖锐湿疣临床分析 J . 临床皮肤科杂 皮肤再次出现疣体生长 。 ( ) 志 ,2001 ,30 3:174 . 4 结果 见表 1 。从表 1 可见 ,治疗组的复发率明显低于对照 [ 中图分类号 ] R 752 . 5 [ 文献标识码 ] B 2 (χ) 组 ,差异有显著性 = 8 . 059 , P < 0 . 01。除液氮冷冻时有可 () 1001 - 7089 200409 - 0539 - 01 [ 文章编号 ] 以耐受的疼痛外 ,全部患者均无其他不良反应 ,也无继发感染 [ 收稿日期 ] 2004203222 [ 修回日期 ] 2004207201 现象 。 武汉大学中南医院皮肤性病科 ,湖北 武汉 430071 [ 作者单位 ]