分子生物学大题

简答题: 1、简述克隆载体和达载体的异同点。 答:克隆载体的定义:可携带插入的外源DNA片段并可转入受体细胞中大量扩增的DNA分子。该分子中含有能够在受体细胞中自主复制的序列和筛选标记,常用于外源基因的克隆,如噬菌体或质粒。 通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体,在载体上插入合适大小的外源DNA片段,并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中,并在宿主细胞中大量繁殖。 表达载体的定义:在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等),使目的基因能够表达的载体。 包括原核表达载体和真核表达载体,可以是质粒、噬菌体或病毒等。典型的表达载体带有能使基因表达的调控序列,并在适当位置有可插入外源基因的限制性内切位点。 表达载体四部分:目的基因、启动子、终止子、标记基因。 克隆载体必须具备的条件: 具有使外源DNA片段插入的限制性酶识别位点(外源性DNA能组入);能将外源DNA导入到受体细胞并进行自我复制(能繁殖);必须具有选择标记(能筛选出来)。 表达载体必须具备的条件: 载体能够独立的复制;应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记,以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选;应具有很强的启动子,能被RNA聚合酶所识别;应具有阻遏子,使启动子受到控制,只有当诱导时才能进行转录;应具有很强的终止子,以使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因,同时使很强的终止子所产生的mRNA较为稳定;所产生的mRNA必须具有翻译起始信号,以便转录后能顺利翻译。2、简述原核表达系统的缺点,以及真核表达系统的必要性及优势? 答:原核表达体系的缺点是:缺乏合适的转录后加工机制,因此不宜表达真核生物基因组基因;缺乏合适的翻译后加工机制,因此表达产物不能适当折叠和修饰;很难在大肠杆菌表达体系中表达大量的可溶性蛋白。 真核表达体系的优点:既能表达cDNA,也能表达真核基因组DNA;表达产物适当修饰并区域化分布。 3、什么是α-互补?如何利用α-互补来筛选插入外源DNA 的重组质粒? α-互补是指lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase ,由1024 个氨基酸组成)阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。 实现α-互补主要有两部分组成:LacZ△M15,放在F质粒或染色体上,随宿主传代;LacZ',放在载体上,作为筛选标记,当在LacZ'中插入一个片段后,将不可避免地导致产生无α-互补能力的?-半乳糖苷酶片段。在诱导物IPTG和底物X-gal(同时可作为生色剂)的作用下,含重组质粒的菌落不能产生有活性的?-半乳糖苷酶,不能分解x-gal,呈现白色,而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。 4、癌基因和肿瘤抑制基因如何相互配合来维持细胞的正常生命活动? 答:肿瘤的发生可能是癌基因的激活与肿瘤抑制基因的失活共同作用的结果。目前了解的最多的两种肿瘤抑制基因是Rb基因和P53基因。它们的产物都是以转录调节因子的方式控制细胞生长的核蛋白。其他肿瘤抑制基因还有神经纤维瘤—1基因、结肠腺瘤性息肉基因、结肠癌丢失基因和Wilms 瘤-1等。 Rb基因随着对一种少见的儿童肿瘤—视网膜母细胞瘤的研究而最早发现的一种肿瘤抑制基因。Rb基因的纯合子性的丢失见于所有的视网膜母细胞瘤及部分骨肉瘤、乳腺瘤和小细胞肺癌等。Rb基因定位于染色体13q14,编码一种核结合蛋白质(P105-Rb)。它在细胞核中以活化的脱磷酸化和失活的磷酸化的形式存在。活化的Rb蛋白对于细胞从G0∕G1期进入S期有抑制作用。当细胞受到刺激开始分裂时,Rb蛋白被磷酸化失活,使细胞进入S期。当细胞分裂成两个子细胞时,失活的(磷酸化的)Rb蛋白通过脱磷酸化再生使子细胞处于G1期或G0期的静止状态。如果由于点突变或13q14的丢失而使Rb基因失活,则Rb蛋白的表达就会出现异常,细胞就可能持续地处于增殖期,并可能由此恶变。 P53基因定位于17号染色体。正常的P53蛋白(野生型)存在于核内,在脱磷酸化时活化,有阻碍细胞进入细胞周期的作用。在部分结肠癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌等均发现有P53基因的点突变或丢失,从而引起异常的P53蛋白表达,而丧失其细胞生长抑制功能,从而导致细胞增生和恶变。近来还发现某些DNA病毒,例如HPV和SV-40,其致癌作用是通过它们的癌蛋白与活化的Rb蛋白或P53蛋白结合并中和其生长抑制功能而实现的。 5、什么叫RNAi技术?简述目前其常见的研究路线。 答:RNA干涉(RNAi):将这种由双链RNA(ds-RNA)引起的特异性基因抑制现象,称作RNA干涉(RNAi)。RNAi 技术的两种常用策略:A. 在体外获得siRNA(确定目的基因,设计SiRNA序列——化学合成或体外转录——在体外,获得SiRNA ——转染细胞——RNAi 效果检测);B. 采用shRNA表达载体(确定目的基因,设计SiRNA序列——构 建shRNA表达载体——转染细胞——在细胞内产生SiRNA——RNAi 效果检测) 综合论述题: 1、请对下列分子生物学技术原理进行归类,哪些技术是根据分子结构特征发明的,哪些是根据核酸序列特征发明的,哪些是综合几种分子特性发明的。 如:基因克隆技术、核酸分子杂交技术、基因敲除技术、RNA 干扰技术、DNA测序技术、定量PCR技术、核酸电泳技术、酶切片段长度多态性技术、逆转录合成cDNA技术。答:(1)根据分子结构特征发明: 核酸电泳技术:原理是带电荷的物质在电场中的趋向运动。 (2)根据核酸序列特征发明: 基因克隆技术:一般来说,基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接,构建成新的重组DNA,然后送入受体生物中去表达,从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 核酸分子杂交技术:具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下(适宜的温室度及离子强度等)可按碱基互补原成双链。 基因敲除技术:基因敲除主要是应用DNA同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段,从而达到基因敲除的目的。RNA干扰技术:是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA (double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。 定量PCR技术:PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA 聚合酶最适反应温度(72°C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。 逆转录合成cDNA技术:是以RNA为模板合成DNA的过程,即RNA指导下的DNA合成。 (3)综合几种分子特性发明: DNA测序技术:根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,产生A,T,C,G四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得DNA序列。 酶切片段长度多态性分析技术:限制性片段长度多态性(RFLP) 技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切位点)和一段DNA的重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化)等均可导致RFLP的产生。 2、利用所学的理论知识及所掌握的实验技术,谈谈你将如何从人的染色体中获取某一个基因并研究该基因的功能?(写出详细的实验设计方案) 从人的染色体中获取某一个基因并研究该基因的功能:文献检索分析,确定待筛选的目的基因;设计合成引物;收集活检标本;提取RNA;用设计合成的引物和抽提的RNA 采用差异RT—PCR筛选目的基因mRNA表达情况;分析基因表达异常与临床病理特征的关系获取目的基因的ORF框;获得线性化真核表达载体;通过目的基因ORF框和线性化真核表达载体构建包含有目的基因ORF框的真核表达载体;转化细菌质粒DNA抽提,酶切及测序鉴定;转染正常的人的细胞系;MTT分析、流式分析、平板集落形成实验等分析目标基因对细胞增长、细胞周期的影响。Western Blotting 检测稳定转染后细胞中的蛋白的表达;根据所得出的结果综合分析基因表达异常与临床病理特征关系。 人的DNA的提取: 1、采集口腔黏膜脱落细胞,用舌头舔颊黏膜上颚、用牙刮颊部,嘬咀,用分泌出的唾液反复漱口;将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤,2000rpm 离心10min,倒掉上清,重复一次。 2、沉淀中加入1ml * 细胞核裂解液(STE),混匀,再加350ml STE 和150ml 10% SDS,摇匀,至出现黏膜透明状,加10ml 20m g/ml 蛋白酶K,摇匀。37℃温箱过夜或50℃ 3-4 小时。 3、加入等体积饱和酚,轻摇混匀10分钟,室温2000rpm 离心 10分钟,去除蛋白和SDS的沉淀。 4、小心移上清至另一离心管,加等体积氯仿混匀5分钟,室温2000rpm 离心5分钟。 5、小心移上请,若上清不清亮透明,则用等体积氯仿再抽提一次。 6、将上清移入另一离心管中、沿离心管壁向DNA溶液中加入2.5 倍体积的无水乙醇,轻轻摇动离心管混合至体系完全均一,见白色絮状DNA。用移液器吸头挑出DNA沉淀,在新配制的70%乙醇洗二次,室温干燥5分钟,再将DNA溶于20—100mlTE中,测OD值。 7、TE溶解的DNA在4℃下可以保存一年,如要求长期保存,则需加2倍体积无水乙醇置 -70℃保存。