宫颈组织鳞状上皮萎缩的病理学特点探讨

宫颈组织鳞状上皮萎缩的病理学特点探讨 分类号:,,,, 单位代码:,,,,,密 级:公开 学 号:,,,,,,, ?‖ 菇办孽 硕士学位 (同等学力申请硕士学位)论文目:宫颈组织鳞状上皮萎缩的病理学特点探讨 ,,, ,,,,, ,, ,,,,,;,,,, ,, ,,,,,;,, ,？,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,, 作者 姓 名 丁伟山 学院 名 称 医学院 专业 名 称 病理学与病理生理学 指导 教 师 张廷国教授 合作 导 师 ,,,,年,月,,日 ， ，，， 原创性声明 掣， ， ,,， , ， ,,,，，,， ， ， ,,,,,,,,,, ,,, ,, , 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名: 期:少，,?卜? 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 (保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名,净垄蔓,导师签名:幽一日期:出材料与 ’,结 果…… , , …讨 论… , ,结 论……… , ,附 图……… ,,参考文献……? ,,创新点与局限性 , ,致 谢………………… ,,,,,,,, ,,,,,,;, ,, ,,攻读学位期问参与撰写论文 , ,,,,,,; ,,,;,,,,,,, ,,,,,,;, ,，,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,;,,,,,, ,,,,,;,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,;, ,叮桑睿睿铮觯幔簦椋铮?,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,;,, ,,,,,, ,,, ,,,,,, ,, 山尔人。学硕十学位论文 宫颈组织鳞状上皮萎缩的病理学特点探讨 专 业:病理学与病理生理学 硕十研究生:,,(伟山 导 师:张廷国 中文摘要 【目的】通过研究分析宫颈鳞状上皮萎缩(,,,,,;,, ,？,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,)的细胞学及组织学特征，以及宫颈鳞状上皮萎缩中,, ,、,,,,的表达情况和人乳头状瘤病毒高危型别,,型和,,型(,,,,,,,,)的感染状态，并且以证常宫颈鳞状上皮、高级别宫颈鳞状上皮内瘤变(,,，,)做为对照，观察上述指标在宫颈鳞状上皮萎缩以及对照病例中的表达情况，旨在探讨宫颈鳞状上皮的细胞组织病理学特点及生物学性质，为宫颈鳞状上皮萎缩的诊断和与宫颈鳞状上皮内瘤变的鉴别诊断、治疗及预后提供有效的辅助诊断指标。 【方法】本实验用免疫组织化学方法检测,,,,、,,,,在,,例宫颈鳞状上皮萎缩(,,,,)中的表达情况，并选取对照,,例，其中『,常宫颈鳞状上皮,,例，高级别宫颈鳞状上皮内瘤变(,,，,),,例。并且对,例伴有轻度异型的宫颈鳞状上皮萎缩、,,例正常宫颈鳞状上皮和,,侈,,高级别宫颈鳞状上皮内瘤变采用原位杂交的方法进行人乳头状瘤高危型别,,型和,,型的检测。,,,,,,(,软件进行数据处理，采用,,检验对数据进行统计学分析。 【结果】,(,,,的表达:,,,在,,,,组、萨常组、,,，,组中的阳性表达率分别为:,,、,,、 ,,,,，正常组的表达与,,，,组的表达差别有统计学意 义(,,,(,,,，,,,(,,); ,,,,组的表达与,,，,组的表达差别有统计学意义(,,,(,,,，,,,(,,);,,,, 组的表达与正常组的表达差别无统计学意义。,(,,,,的表达:,,,,在,,,,组、『,常组、,,，,组中的阳性表达率分别为:,,,、 ,,,、,,,,，,,,,组的表达与正常纽的表达差别无统计学意义(,,,(,,,， ,,,(,,);,,,,组的表达与,,，,组的表达差别有统计学意义(,,,(,,,， ,,,东人～学硕十学位论文 ,,,(,,)。,(,,,感染状念:高危型人乳头瘤状病毒,,,,,,,,在异型,,,,窆,、正常组、,,，,组中的阳性表达率分别为:,,、,,、,,,，,,,,组的表达与,,，,组的表达差别有统计学意义(,:,(,,,,，,(,(,,);『,常组与,,，,组的表达差别有统计学意义(,,,(,,,,，,(,(,,)。 【结论】,(,，,目前被大量研究证实可做为渗断宫颈鳞状上皮高级别上皮内瘤变的辅助 指标，在本研究中,,,,，,,,,,病例均为阴性表达，与,,，,组的表达差别有显著 差异，支持,,,,为非肿瘤性变化。,(,,,,做为代表细胞增嬗活性的指标，可在部分,,,,病例中呈阳性表达，单一 的,,,,阳性表达不适宜做为鉴别,,,,与,，,的依据。,(高危型,,,感染与宫颈鳞状上皮高级别上皮内瘤变密切相关，宫颈鳞状上皮萎 缩病例的高危型，,,,感染率为零，与高级别宫颈上皮内瘤变的感染率有显著统 计学差异，,,,,高危型,,,检测均阴性也支持其为良性反应性病变。高危,,, 检测可做为困难病例辅助诊断指标。,(宫颈鳞状上皮萎缩为良性反应性病变，在伴随炎症时可有一定的细胞异型性， ,,诊断中不容易同,，,鉴别，困难病例可用,,,、,,,,、及检测高危型,,,,,,,,, 这一组指标来辅助诊断。 【关键词】宫颈鳞状上皮萎缩宫颈鳞状上皮内瘤变免疫组化原位杂交,,,,,,,(,,,,)，,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,, , , , ,,, ,,,, ,, ,, ;,,,, ,, ,,,,，,,, ,,,,,,,;,,,, ;,,,,,,,,, ,, , ;,,,, ,, ,,,,，;,,,,,,, ,,,, , , ;,,,, ,, ,,,,,, ;,,,,;,,,,,,,,，, , ;,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,？,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,(,,，,),,, ,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,;,,,, ,,,,,,, ;,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,; ;,,,,;,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ;,,,,;,, ,？,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,;,,,,;,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,，,, ,,,,, ,, ,,,,,;, ,,, ,,,,,,,,, ,, ;,,,,;,,,？,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ;,,,,;,, ,,,,,,,,,,,( 〔,,,,,,,】，,,,,,,,,,,;,,,,,,,, ,,, ,,,, ,, ,,,,;, ,,, 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,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,, 磷酸盐缓冲液,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, 二氨基联苯胺,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, 苏术素,伊红,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, :乙胺阴乙酸,,, ,,,,,,,, , ,, ,,,,, ,,,,, 辣根过氧化物酶,,,, ,,,,,,,,;,, ,,, ,,, ,,;,,,, ,,;,,,社会科学统计软件包 山尔人学硕十学何论文 宫颈鳞状上皮萎缩的病理学特点探讨 ,,, ,,;, , 譬 业:病理学与病理生理学 硕，研究生:一,‘伟山 导 师:张廷国 前 言 宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，其发生率仅次于乳腺癌。宫颈鳞状上皮内瘤变(,烈)是宫颈癌的前驱病变，这种前驱病变在进展为浸润性鳞状细胞癌前可以存在多年。早期诊断和治疗宫颈上皮内瘤变可以显著降低宫颈鳞状细胞癌发生率和死亡率，宫颈脱落细胞学检查及阴道镜下宫颈活检是筛查、确诊宫颈上皮内瘤变的主要手段，这种检查方法在发达国家已经普及，所以近些年来发达国家的宫颈癌发生率及死亡率呈下降趋势…;我们国家目前正在逐步普及宫颈液基细胞学检查及阴道镜下宫颈活检病理检查，在这种筛查工作中我们发现存在将部分非宫颈上皮内瘤变误判为宫颈上皮内瘤变，从而导致过诊过治的问题;其中宫颈鳞状上皮萎缩是易于误诊为宫颈上皮内瘤变导致过诊过治的良性病变之一。 宫颈鳞状上皮的分化成熟受雌激素水平的调控，在绝经后妇女或体内雌激素水平降低的女性中，宫颈鳞状上皮分化成熟障碍，宫颈鳞状上皮变薄，细胞浆显著减少，核深染，核浆比变大，在,,染色的组织学切片中表现为全层细胞排列较密集，核染色较深，不易与宫颈上皮内瘤变区分。巴氏染色的脱落细胞学表现为细胞浆蓝染，核浆比增大，部分核膜不规则，易判读为意义不明确非典型鳞状上皮细胞(,,,(,,)或不排除高度上皮内病变的非典型鳞状上皮细胞(,,,(,)。 大量的流行病学调查和基础研究早已表明人类乳头状瘤病毒感染是引起宫颈鳞状上皮内瘤变和宫颈癌的主要原因，尤其是高危型的人类乳头状瘤病毒，其中检出率最高的是,,,,,、, ,型,,(,,。文献报道，高危型,,,可诱导,,,蛋白过表达，其机制是高危型的人类乳头状瘤病毒所含有的,,、,,基因可整合入宿主的基凶组内，导致,,、,,蛋白高表达，进而分别使,,,蛋白和,,蛋白的功能失调，使被感染上皮细胞的细胞周期调二话发生失控，,,通路的失控，反馈性 , 山尔人学硕一，,学,)奇:论文的引起原本正常的,,,蛋白高表达,,。多篇文献报道，,,,的表达与高危型,,,感染呈正相关，与宫颈上皮内瘤变的,?,重程度呈证相关,,(,(,(,,,目前,,,被认为是检测宫颈癌和宫颈癌前病变的有效并且比较特异的指标。,,,,抗原是存在于增殖细胞胞核的一种非组蛋仔院说鞍祝 涔δ与有丝分裂密切相关，它出现在有丝分裂的,,后期，在,期和,,期逐渐升高，,期达到高峰， 有丝分裂后逐渐降解消失，半衰期短，且不表达于,,,修复状态的细胞，能准确地反映肿瘤细胞的增殖活性。研究指出,,,,在宫颈鳞状上皮内瘤变病例中呈较弥漫的阳性表达，且与宫颈鳞状上皮内瘤变的研究程度呈『,相关，目前常同,,,组合做为诊断宫颈上皮内瘤变的辅助指标( 本课题将通过宫颈鳞状上皮萎缩性病变的细胞及组织学观察，用核酸原位杂交的方法研究,,,,,、,,在宫颈鳞状上皮萎缩性病变中的表达情况，用免疫组织化学的方法研究,,,及,,,,在宫颈鳞状上皮萎缩性病变中的表达情况，初步探讨宫颈鳞状上皮萎缩性病变的细胞、组织学形念特点，生物学性质，探讨,,,、,,,,在、鉴别宫颈鳞状上皮萎缩性病变病例中的作用以及与,,,感染的关系。 山尔人学硕，学位论文 材料与方法一、实验材料(一)病例选择 选择山东大学齐鲁医院病理;,;〔,,,,年，，,,,,,年期问存档的珍断为宫颈鳞状上皮萎缩(,,,,)的病,,,,,,,作为的研究病例，所有病例均为宫颈活检组织，之前的外院或本院宫颈液基细胞学筛查都诊断为存在异常，,,,,,,诊断为,,,—,,，,例诊断为,,,—,，,例诊断为,,，,。另外选取同一时期诊断为高级别宫颈鳞状上皮内瘤变(,,，,),,例，正常宫颈鳞状上皮,,例作为对照观察组，对照病例也均为宫颈活检病例。所有的病例均由有两位有的病理科专家进行再次的审核确诊，所有实验组和对照组病例都采用免疫组织化学方法标记,,,和,,,,，,,伴有轻度异型的,,,,病,,,,矛,,,,对照组进行了,,,,,,, (二)标本处理 所有标本均为,,,的中性福尔马林固定、,的核酸原位杂交检测。 常规酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋的标本，做连续, , ,切片，用于做免疫组织化学染色署〔，,,,原位杂交，所用载玻片都应用多聚赖氨酸进行防脱片处理，以防止在染色期间脱片。二、实验方法(一)免疫组织化学,、免疫组织化学所用的主要试剂(,)鼠抗人,,,单克隆抗体，购自北京中杉金桥生物公司。(,)鼠抗人,,,,单克隆抗体，购自北京中杉金桥生物公司。(,),,一,,,,免疫组化检测试剂盒，购自北京中杉金桥生物公司，包括,,,:,:去离 子水，,,,,,,, ,,,,,,(聚合酶辅助物)，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,—,,,,,, ,,,,,, ，,,(辣根过氧化酶标记的羊抗兔或鼠的，,,)。(,),,,显色试剂盒，购自北京中杉金桥生物公司，,,倍稀释后使用。,、免疫组化工作液(,)枸橼酸缓冲液(,(,,,,,,,;,,为,(,,,):耿商品化的枸橼酸缓冲液粉剂, 包溶解于,,,,,〕蒸馏水，待到摇匀完全溶解后，调,,至,(,。:,,磷酸古匕缓(’,,(,,,一,,?,队, (议?， ?，友,,,:,(,,。,,, ,? ,,, ,，, ,。,,,?,, ,“,,, ,,(,:为,(,:,(:,,:敬将 ,,,,??,, ?? 饥’，、, ?、,,? 低?, 袋,，苛,,,～，匕盅,,,,糊 ? ,, ,,,, ,，,, 术溶于,,,,,,蒸馏水，彻底溶解后),,,,,,,,, ,滴，调,,至,(,,—,(,,，混匀 山尔人学硕(,:学侮论文 使用。(,),,,,缓冲液(,,为,(,,):取商品化的,,,,溶液，,,倍稀释后即可使用。,、免疫组织化学,,一,,,,法(,)石蜡切片, , ,，用处理过的玻片捞片，放入,,。,烤箱烤片,,分钟，进行初步脱蜡。(,)新鲜二甲苯脱蜡,,分钟×,次。(,)梯度酒精(,,,,，,,,，,,,，,,,)水化之后，用,,,(,,为,(,,)浸泡,分钟。(,)根据一抗的要求，对组织的 切片进行处理。将切片置于相应的修复液中进行 抗原热修复(,,,应用,,为,(,的,,,,，,, ,,应用,,为,(,的枸橼酸缓冲液)。修 复方法为微波炉高火加热,,分钟，取出自然冷却至室温后取出切片，,,,冲洗 三次，每次冲洗时间为三分钟。(,)每张切片滴加一滴,,的过氧化氢溶液，室温下孵育,,分钟，以消除内源性过 氧化酶的活性，孵育后用,,,冲洗三次，每次三分钟。(,)甩净,,,后，滴加,, , ,一抗，使一抗完全覆盖组织，放入,,。,恒温箱中孵育,,分钟。(,)将抗体孵育作用后的组织切片取出，自然复温至室温，然后用,,,,中洗三次，每次三分钟。(,)尽量甩净,,,，滴加试剂,(,,,,,,, ,,,,,,)，置于,,。,恒温箱中孵育,,分钟。 孵育结束后，用,,,冲洗三次，每次三分钟。(,)尽量甩净,,,，滴加试剂,(,,,, ,,,,,,,,,,—,,,,,,,,,, ，,,)，置于,,。, 恒温箱中孵育,,分钟。孵育结束后，用,,,冲洗三次，每次三分钟。(,,)尽量甩干净,,,，滴加新鲜配制的,,,显色剂(,,,蒸馏水中分别加入,、,、, 液各一滴，并于半小时内用完)，在显微镜下控制显色，自来水冲洗中止显色。(,,),,,,,,苏木素复染，,(,,盐酸酒精分化，稀氨水反蓝。(,,),,,、,,,、,,,,酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。(,,)显微镜下观察、拍照。,、对照设置 (,)阳性对照:采用每种抗体特异性阳性表达的组织切片作为阳性对照。 (,)阴性对照:用已经判断为阳性对照的组织切片做空白对照实验，用,,,代替 , 山东人学硕,,～学位论文 一抗，其它步骤不变。 (二)核酸原位杂交技术 原位杂交技术(，, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,，，,,)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于,,世纪,,年代。原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之,,，,有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测,,,或,,,互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。其优点是特异性强，灵敏度高，可用于石蜡包埋组织，具有组织细胞化学染色的可见性。,(原位杂交所用的主要试剂 (,),,,,,,,,(,,,)原位杂交试剂盒，购白北京中杉金桥生物公司。 (,),,,显色试剂盒，购自北京中杉金桥生物公司。,(原位杂交工作液 (,),,,配制:将一袋,,,粉术溶于, ,,,,,蒸馏水，彻底溶解后力,,,,,,,, ,滴，混匀使用。 (,),,,配制:在,,, ,,中加,,,, ,,，混匀，用前配制。,(,,,原位杂交操作步骤 (,)石蜡切片, , ,，用处理过的玻片捞片，放置,,。,烤箱烤片,小时。 (,)新鲜二甲苯脱蜡,次，每次,,分钟。 (,)放入,,,,乙醇中,分钟×,次，然后取出放置空气中干燥。 (,)每张切片加适量胃酶工作液,,?消化,,分钟。 (,)弃掉胃酶工作液后逐级酒精脱水(,,,、,,,，,,,,)，各一分钟，空气干燥后杂交。 (,)混匀探针，每张切片加,,—,,, ,，加盖玻片(注意防止气泡)。 (,)原位杂交仪,,。,变性,分钟，,,。,过夜。 (,)浸入,,,缓冲液中，直到盖玻片自然脱落，用,,,冲洗,,分钟。 (,)滴,滴杂交后洗液(试剂,)，,,。, ,,育, ,分钟，结束后,,,冲洗,次，每次,分钟。 (,,)甩净,，,冲洗液后加适量辣根酶抗地高辛抗体(试剂,)，,,。, ,,孚育,,分 ,, 山尔人学硕十学位论文 钟后用,,,冲洗,次， 每次冲洗,分钟。 (,,)尽量甩净,,,冲洗液后加适量,,,多聚体(试剂,)，,,?,呼育,,分钟 后用,,,冲洗,次，每次,分钟。 (,,)尽量甩干净,,,，滴加新鲜配制的,,,显色剂，镜下观察控制显色，及时用自来水终止。 (,,)苏木素复染，,(,,盐酸酒精分化，氨水反蓝。,,,、,,,、,,,,酒精梯度脱 水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察、拍照。,(、对照设置 (,)阳性对照:采用每种抗体特异性阳性表达的组织切片作为阳性对照。 (,)阴性对照:用已经判断为阳性对照的组织切片做空白对照实验，即用,,,代 替探针滴加，其它步骤不变。三、主要实验仪器,、光学显微镜:购自同本,,,,,,,公司。,、微波炉:购自美的公司。,、电热恒温培养箱:购自山东潍坊医疗器械厂。,、原位杂交仪:购自北京中杉金桥生物公司。,、切片机:购自德国莱卡公司。,、调温电烤箱:购自山东潍坊医疗器械厂。四、结果判定 免疫组化和原位杂交结果按阳性细胞数和染色强度，采用半定量化分反应等级。,,,为细胞浆或者细胞核表达，,,,,,,,,原位杂交为细胞核表达，阳性表达为细胞核出现棕黄色颗粒。阴性:显色与背景没有明显差异，记为:一;弱阳性:阳性细胞数目小于,,,，显色细胞为淡黄或者仅仅为个别细胞呈黄至棕黄色染色，记作:，;强阳性:阳性细胞数目超过,,,，多数细胞呈黄至棕黄色，记作:，，，;中等阳性:阳性细胞及显色强度介于若阳性和强阳性之问，记作:，，。五、统计方法 采用,,,,,,(,统计软件进行数据处理，率之间用, ,检验精确概率分析，,,,(,,有统计学意义。 ,,尔人学硕十学位论文 结 果一、 组织学形态.