2，4，6三氯酚慢性暴露对青鳉生长和生殖影响研究（可编辑）

2，4，6三氯酚慢性暴露对青鳉生长和生殖影响研究（可编辑） 2，4，6三氯酚慢性暴露对青鳉生长和生殖影响研究 西南大学 硕士学位论文 2,4,6-三氯酚慢性暴露对青?生长和生殖影响的研究 姓名:何悦 申请学位级别:硕士 专业:环境科学 指导教师:张进忠;查金苗 20100401摘要 两南大学硕十学位论文 ,,.三氯酚慢性暴露对青鳝生长和生殖影响的研究 环境科学专业硕士研究生:何悦 指导教师:张进忠教授 查金苗副研究员 摘 要 ,,.三氯酚,,是化工生产中的重要原料,可用作杀菌剂、防腐 剂、脱叶剂,在有机合成、造纸和印染行业中得到使用广泛,目前在工业废水、 污水处理厂排放废水、农药废水、垃圾渗滤液、饮用水和河水中都检测到它 的存 在,美国环境保护署已经确定,,一三氯酚为疑似致癌物。 目前,针对三氯酚的毒性研究大多集中于水生生物某一生理阶段上的急性和 亚急性毒性,而它在整个世代暴露的慢性影响研究较少。在自然环境中,大多数 情况下污染物对鱼类的影响可能作用于整个发育和繁殖过程,慢性毒性研究的结 果将更接近于实际环境,有助于人们了解环境内分泌干扰物对鱼类生理生态的影 响机制。 青蝣是发源于日本的一种小型鱼类,易于饲养,对水质的环境变化特别敏感。 成熟青鳝个体小,体长 ,繁殖力强。世纪初日本开始将青鲻用于毒理学 实验研究,作为供试物种在生理学、生态学和内分泌学等领域被逐渐采用,研究 涉及青鳝的培育、饲养管理和实验操作等方面,目前被广泛用于毒理学实验。 本文以日本青鲻 为实验动物,研究了,,.三氯酚对青鲻 整个世代生长、生殖能力和子代质量的影响。取性成熟的青蝣鱼,暴露在不同浓 度水平,,,,,“‖的,,溶液中,以.%/ 为溶剂对照。暴露 后,收集鱼卵,统计每对产卵数、存活个数和受精率; 选取一组清水恢复饲养,另一组继续暴露直到性成熟,分别观察胚胎发育、孵化 天数、孵化率、畸形率等生长和生殖指标的变化;成鱼暴露周后,取鱼样考察搁婴 州南人学硕士学位论文 畸形率和死亡率。本文获得了如下研究成果: .总体来说,随着,,.三氯酚暴露浓度的增加,青鳞豹体长和体重均下降, 但雄鱼在高浓度水平有回升现象;雌鱼的肝脏指数下降,而雄鱼在各浓度水 平无 明显影响。在低浓度组中,青鳞卵巢指数无显著变化;在高浓度组中,卵巢指 数 显著下降.。 .随着,,.三氯酚暴露浓度的增加,青锵的每天产卵对数没有明显变化, 但每条雌鱼的产卵量下降;鱼卵的受精率下降,特别是在“‖浓度水平,存 在显著性差异尸.;鱼卵的存活数在和鹏几浓度水平也显著下降 .。 .子代孵化率在清水饲养后其孵化天数没有明显变化。孵化率在矛 /浓度组中显著下降。畸形率在、币 /各浓度组中都显著增加。 继续暴露的子代,在孵化天数上仍然没有显著的变化。孵化率和畸形率在、 ;“/浓度组中均有显著性上升。与在清水中饲养的鱼卵相比,孵化率下降, 畸形率均上升。 暴露后,幼鱼在不同程度上出现了大量的畸形,出生后不久 就死 亡。 关键词:青鳝;,,.三氯酚;生殖;胚胎发育;子代质量 ,, ?::. .. ,,,,, . ,, , ,,.,,, , , , ,, . . ,, , , .,. , ’ . , ?, . , 。.,。 / ,, ., , 两南大学硕士学何论文 ??鼍曼 一?; 一 一 曼皇曼皇曼皇曼曼;一一。 ,, ’ , . , ?’ , , ,,,,,,, /,.%/ . , ; ;; ,. , . , , . ’ ’’ ,. ’ ;.. ’, ? , ,, ?’ . ’.... :;,,;; ;独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果,文中已加了 标注。 学位论文慨何悦罚,慨签字魄知。年易月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书,本论文:坼保密,口 保密期限至 年 月止。 导师签名:张灶岩, 学位论文作者签名:/巧?’已 签字日期: ?年月日 签字日期:加加年月.日保护知识产权声明 本人完全了解西南大学关于对研究生在本校攻读学位期间撰写论 文的知识产权保护规定。本人撰写的论文是在导师具体指导下,并得 到相关研究经费支持下完成的。具体数据和研究成果归属于导师和作 者本人,知识产权单位属西南大学。本人保证毕业后,以本论文数据 和资料发表论文或使用论文工作成果时,需征得导师同意,并且署名 第一单位仍然为西南大学。 /一\ 学位论文作者签名: 彳川卜钆 签字日期:易年三月、日两南火学硕十学位论文 第章文献综述 第章文献综述 .国内外研究现状 随着化学工业的快速发展,人工合成有机物的种类不断增多,物质生产得到 极大丰富的同时,也带来了严重的环境污染问。年美国环保署公布法令, 规定了种重点监控的环境污染物,其中就包括氯酚类化合物, 。 氯酚类化合物作为重要的化工原料,被广泛应用于医药、农药和合成材料等 多个行业,其特点是毒性较强,难以被微生物降解,且容易穿越常规水污染控制 的屏障,进入自然环境后,存留和富集时间长【】。目前,氯酚类化合物主要来 源于木材杀菌剂、溶剂、防腐剂、除草剂和热交换剂等。随着造纸工业的快速发 展,产生大量含氯酚类化合物的纸浆漂白废水,造成废水的毒性、致突变性和致 畸性强,对河流污染严重:飞机等交通工具释放的氯酚类化合物还将污染传播到 世界各地【】。此外,在饮用水的加氯消毒中,酚可转化为氯酚及其衍生物, 高浓度 氯的存在可加快其转化速率【】 由于氯原子和酚环结构的存在,氯酚类化合物具有很强的抗降解能力和毒性, 对任何生物体都具有毒害作用,而且毒性随着含氯度的增加而明显增强。 评定,.二氯苯酚,、,,.三氯苯 酚,,.和五氯苯酚属于可能的人类级致癌物,同时证明 ,是引起老鼠皮肤瘤的前导物。年,美国 在报告中指出对动物也是致癌物质。氯酚化合物具有对水生生物的 耐降解、高毒性和潜在的生物累积性而受到世界范围的广泛关注【,中、美两国也 一致认定,是水环境中的优先监测污染物。例如在肌体组织中的浓度 达到 时,人、鼠、鱼等生物都将有致命的危险。尤其严重的是氯酚类化 合物可通过食物链在生物圈中积累,加剧它们对环境的污染【。 .. 的物理化学性质 为含有一系列不同数目的氯原子和一个羟基取代苯坏的一类化合物。 分子中氯取代基的数目直接影响其溶解度和正辛醇.水分配系数。研 究表明,的熔点、沸点、密度、脂溶性和生物毒性都随着氯化程度的增加而增 加,且其毒性也会因氯原子所在位置的不同而有所差异,通常以对位的氯酚 化合 物毒性最强,间位次之,邻位最弱【】。 ..水环境中的来源 天然腐殖酸是水环境中的来源之一【。等】的研究证实,氯化物过两南人学硕十学位论文 第章文献综述 ................................................................. ................................????,................................ .....................,...,一.????.??????????.??.?????????? 氧化物酶能够催化腐殖酸等含芳环结构和酚类物质的氯化反应。工业排放和污染 是水环境中的主要来源,石油、化工厂生产的排放废水可能是导致水环 境污染的主要途径【。如,作为造纸工业中漂白过程的副产物,直接从造 纸厂排放到淤泥。污染水环境中还可以发现的广泛存在【】,其原因是,, 作为生产其它氯酚化合物主要是的化学中间体,被排放到工业废 水和饮用水中。的生产和应用是环境中该产品的主要来源,它既可由酚和氯 直接氯化生成,又可由六氯苯水解产生。和的生产均可产生大量含 和其它酚的废气和废水,而造成环境污染。 ..水环境中的迁移转化 随着苯环上取代氯原子数目的增加,的值减小。天然水的值在 ..时,氯酚化合物的值在..。研究表明化合物的存在形式、水相 的值是影响传输的主要因素。当和环境的值接近时,一般以 离子形式存在。随着其水溶性和流动性的增加,吸附在固定相不包括带有相 反 电荷的固相中的越少,挥发性也减少。在中性形式下,尽管含羟基的酚组 分趋向于形成氢键,但是氯酚化合物的水溶性较低,一般它们具有中等或强的吸 附性、高的挥发性【 。在环境中一般以其共轭碱的形式存在,如的钠盐 五氯酚钠易溶于水,进入人体内可分解为。在环境中降解,可形成 其它相关的有毒污染物,如,,一三氯酚,,、五氯苯甲醚和五氯愈创 木酚,甚至氯化程度更高的二恶英类化合物,从而限制了的使用。 .. 的结构与毒性 在水中具有一定的溶解性,但其正辛醇.水分配系数较大 ...,具有明显的脂溶性,能够通过食物链在生物圈中积累,大大加剧其环 境污染。目前,研究表明对鱼类、原核生物、甲壳类动物和体外细胞有毒, 使用不同细胞模型发现的毒性影响没有明显的差异【?。 瑞典环境保护局主持的“环境/纤维素”研究发现,含有的造纸废水严重 影响鱼类的正常生长发育,使鱼体长和体重增长速度减慢。典型症状为肝变大、 生殖腺生长缓慢、肝中乙氧基..羟基异酚.脱乙基酶, ..的活性大幅度下降,糖类代谢机制发生改变,刺激 红细胞增殖,干扰血液中的离子平衡,造成免疫功能下降。应用分子生物学技术 对兔肝线粒体的呼吸作用进行细胞毒理实验,发现荧光假单胞菌的生长、脱 氢酶 和酯酶的活性受到抑制。等研究了暴露于浓度为~ /五氯酚中的 种水生生物的半致死浓度, ,发现鱼类比藻类、植物、其它软体动 物敏感,是急性毒理实验中较敏感的水生生物,并指出种间敏感性是造成其 差异 的重要原因。 撕南人学硕士学位论文 第章 文献综述 尹大强等【】估算了种中国水生生物对,的最终慢性毒性值、 最终急性毒性值和最终植物毒性值分别为。、.和。 ‖, 最终急性慢性比为..。在,,的急性毒性实验中,尹大强等【 】使用 种中国特有的水生生物,如 的生存繁殖实验使用对大型蚤, 的胚胎幼 虫实验使用鲫鱼, 的幼鱼实验使用草鱼, 的生命早期实验使用中华蟾蜍,的 生长抑制实验使用斜生栅藻,发现在鲫鱼和中华蟾蜍中,,在 和 的分别为.和. /;,,的、和分别 为.、.和. /;最终急性慢性比为.?.。 现有研究表明在低盐浓度下,鳝为对敏感的鱼类【,, ,高盐浓度使得 鱼的值变小。杨霓云等【】在单一毒性实验的基础上,采用相加指数法,研究 的联合毒性。结果表明,, 了,和对斑马鱼 与的联合毒性效应表现为协同作用,使的毒性加剧。、,或 一、,.与共存时,在斑马鱼中暴露 的值由“‖分别 下降至.、和“叽。和中国制定的标准中规定.、,. 和在组织中的浓度应低于、.和.斗玑。 李静等【‘】研究表明,苯酚、一氯酚、,,.对金鱼的毒性属于高毒,五氯 酚对金鱼的毒性属于剧毒,这一毒性范围与卢玲等【 】的报道相符。用,, 和五氯酚做毒性实验,发现高浓度组鱼出现反应迟钝、侧游、表皮有黑斑形成等 现象;解剖死鱼发现鱼的鳃部发黑、出现部分水肿、肠肿胀并有透明趋向。种受 试酚类化合物对金鱼的毒性大小排序为:五氯酚三氯苯酚一氯酚苯酚【】。 此外,聂晶磊等【】也发现氯酚对水生生物的毒性随其氯化程度的增加而增加。其 中用,.二氯酚、,,,.四氯酚和五氯酚做毒性实验,高浓度组鱼也出现侧游、 反应迟钝、表皮有黑斑形成等现象;解剖死鱼发现鱼的鳃部出现水肿、肝脏部分 破碎,但囊肿大并趋于透明,肠内容物少等现象。 随着苯环上取代氯原子数目的增加,氯酚类化合物的突变率没有明显的变化 趋势。一氯酚与二氯酚的突变率相近,均高于三氯酚与四氯酚,这可能是异构体 不同引起的致突变性不同【。王连生等【】用四唑盐比色法法研究了种 多氯酚对小鼠结缔组织成纤维细胞、人肝癌细胞的急性毒性效应,结 果表明,、,,均可引起细胞凋亡,而更趋向于引起细胞坏死。 .. 的累积 王芳等【】研究表明,随着取代氯原子数目的增加,的毒性和在鱼体内的富 集作用增加,但其增加趋势随的上升而下降。当危时,活鱼体内 的毒性和富集性不变:瞄时,随着的增加,其毒性和富集量却在减少。 随着取代氯原子数目的增加,的亲脂性逐渐增强,越趋于在鱼体内累积。矾南 火学硕十学位论文 第章 文献综述 通过计算生物浓缩因子衡量在鱼组织中的生物富集效率,在脂溶相 分配达到一定程度时,值与存在~定的相关性【引。通过摄取食物,鳟鱼 对,的是.,金鱼和藻类对,的分别是. 和.。,,在鱼和海鲜中的值一般为? ,也有报道在中 国鲤鱼的胆汁中,,的为。通过食物链的传递,普遍具有更 高的累积能力,对一些鱼类其达到,对金鱼、贻贝和牡蜊则分别是、 。 和 .. 的降解 氯酚分子中含有芳环和氯原子,具有很强的毒性和抗生物降解能力。同时, 氯原子的存在会抑制苯环裂解酶的活性,其活性随氯原子取代位置的不同而 变化。 。 因此,氯酚的生物降解过程中最重要的步骤是氯取代基的去除,即脱氯过程【 研究发现,菌株. .降解酚类化合物存在两种途径,如苯酚 的降解是经儿茶酚降解的,,,和,的降解首先是对位氧化形成醌 类化合物】。等【】报道经,,诱导的 菌株 可将含对位氯的酚转化成相应的氯醌;而经诱导时,该菌株能将邻 位缺氯的氯酚经氯代儿茶酚的途径降解。 在多氯酚的微生物降解过程中,人们发现邻位氯取代基较间、对位氯取代基 容易还原脱除。等【】研究了三氯酚类化合物对微生物的毒性、其 稳定产甲烷菌培养液对,,的降解,结果表明,,的转化路径是一 次脱去邻位氯生成,.和;种对微生物的毒性由小到大依次为 ,,,,,,。 刘兴平【】研究发现,在好氧条件下一些氯代程度较低的氯酚较易生物降解, 降解速率也较快,而一些氯代程度较高的氯酚如五氯酚,往往难以生物降解。 只 有当苯环断裂成代谢中间产物、有机氯矿化为无机。时,氯酚生物降解才被 认为 是完全的。一般认为,分子内相邻两个碳原子问的直接脱或.而形成双键 的反应只能发生在直链烃类化合物上,而不可能发生在芳香环上,因芳香环 上的 .键是化学惰性的,对亲核取代反应具有极强的抗性。其脱氯作用通常只有在 伴随其它系列反应、削弱了.键后才能进行。氯酚好氧生物降解中的脱氯作 用 包括芳香环断裂前的脱氯和芳香环断裂后的脱氯两类。 在厌氧或缺氧条件下,氯酚的脱氯是~个还原过程。化合物得到电子的同时 去掉一个氯取代基并且释放出一个‘。由于氯取代基阻止了氯酚的苯环断裂和环 断裂后的脱氯,许多氯酚特别是多氯酚在环境中几乎是不可降解的,而许多氯酚 在厌氧环境中则易于还原脱氯,形成氯代程度较低、毒性较小、更易被好氧微生 物氧化代谢的产物,甚至在一些特定环境中,多氯酚也可以直接矿化为或 两南大学硕十学何论文 第章文献综述 和。增加易被微生物利用的有机物质,可以刺激脱氯降解,其还原脱氯速率和 范围也随之扩大。 .. 的吸收与代谢 空气中的,.可通过动物的呼吸道黏膜进入血液循坏,美国认定空 气中,、,,和的含量应分别小于. 班、 ‖和“叽。 动物暴露于高浓度的,可以导致肝脏、肾脏、血液、肺、神经系统、免疫系 统和消化道的损伤【。根据浓度和暴露情况,的纯度影响其毒性。在体 内代谢相对较快,但它并不像亲脂性更强的和在体内积累。吸附 在土壤和底泥中,不被微生物降解而形成其它化合物。在空气和地表水中, 在光照下降解。可在鱼中检出,但在组织中浓度水平很低,因为它能被鱼和 其它脊椎动物代谢和排泄。 在生物体内,在羟化酶,一 作用下,形 成两种羟化代谢产物:.氧己二酸和,.二氯儿茶酚, 。,,和在加氧化酶的作用 下,分别形成中间体,.二氯对苯二酚,和,,, 四氯对苯二酚,,,。在空气中根据其羟基化的反应 、 。表面水体中 速率不同,,、,,的半衰期分别为. ,的半衰期为. 夏季和. 冬季;海水中分别为 夏季 和 冬季;地下水中,半衰期的变幅较大,达到~ 。,.在 月、 底泥中的半衰期接近 月;,,在土壤中的半衰 期为 ,的半衰期为 。光降解和生物降解是转化的主要 途径。 同其它亲脂性化合物一样,通过两相反应快速代谢为极性化合物,排泄到 胆和肾脏中。两相反应包括葡萄糖苷酸结合、硫酸结合、乙酰化、甲基化、 甘氨 酸结合和谷胱甘肽结合等,主要有葡萄糖苷酸结合和硫酸结合【。在鱼肝 内经代谢后,主要以游离物和共轭物形式葡萄糖苷酸共轭物和硫酸酯共轭物 存在于胆和肾中,两者在物理化学性质、微生物反应和毒性方面均有不同。 由于 在胆中生物浓缩性很高,因此人们把鱼胆作为测定的一个重要器官。王 芳【的研究也证实,鱼胆中葡萄糖苷酸含量大于%,其含量也随取代氯原子数 目的增加而增大,共轭物所占比重比有所下降,与共轭物所占比例 相同。 叶雪平等】研究发现,水生生物的代谢水平可以通过测定排泄物在水体中溶 解后产生的氨氮或亚硝酸盐含量来反映。在低值的水体中,鱼类的生理代谢会 发生如下变化:鳃组织损伤引起的气体交换受阻、血酸离子调节机制丧失、渗透两南人学硕十学付论文 第章 文献综述 压调节机制失调掣?。进入鱼体内,经过肝脏主要以游离物和共轭物形式 存在于胆囊、肾脏,共轭物主要是葡萄糖苷酸和硫酸酯的共轭物,在胆囊中生物 浓缩性较强】。 ...的毒性 目前还缺乏数据来评价氯酚化合物对水生生物的急性或慢性毒性。尹大强等刀 估算了种中国水生生物对,的最终急性毒性值、最终慢性毒性 值和最终植物毒性值,它们分别为.、.和. /,最 终急性慢性比范围是..。在,,急性毒性实验中,尹大强等【 】在实 验中使用了种中国特有的水生生物,如 的生存繁殖实验使用对大型蚤 , 的胚胎幼虫实验使用鲫鱼 的 , , 的生命早期实验使用中 幼鱼实验实验使用草鱼 的生长抑制实验使用的是斜生栅藻 华蟾蜍 , 。结果表明在鲫鱼和中华蟾蜍中,对,,的 和 在 的分别为.和.把/。,,的、和 分别为.、.和. ,最终急性慢性比的范围是.~.。 污染的水环境中可以对慢性水相毒性实验作出反应【。之前的研究表明 是对敏感的鱼】。而盐浓度对 尽管在低盐浓度下,鲻 鱼的值影响变小。等】调查了对丑的毒性作用,发 现其和再生值在静水条件下分别从和 ,减少到和 、翠 /。而对鲶鱼 、塘虱 鳢 的慢性毒性值是。/。和】发 现在大鳞大麻哈鱼、虹鳟鱼 、斑点叉尾回 、斑马鱼和大鳍鳞鳃太阳鱼中, 在 的分别是、、、和“班,而在淡水印度囊鳃鲶且, 胡鲶 、刺整库蠓 和乏库蚊 .的 值分别为.、.、.和 。 杨霓云等在单一毒性试验结果的基础上,采用相加指数法,研究了, 的联合毒性。结果表明,,与 与对斑马鱼 的联合毒性效应均表现为协同作用,使的毒性剧增。由于、,或 .和,的存在,使得在斑马鱼中在 的值由原来的 ./, 分别下降到.、和肛/。和中国制定的标准中规定.、, 和在组织中的浓度应低于、.和.?‖。 ..致畸性、遗传毒性和致癌性 无论有无代谢活化,,对鼠伤寒沙门氏菌 两南大学硕十学位论文 第章文献综述 ;;一一一一..;.; ?一.一??鼍曼皇曼曼曼篡 、 、 和 菌株没有潜在的诱变能力删。其它的实验结 果也表明没有显著的致畸性和遗传毒性。在使用 逆向突变 试验中,,.在淋巴瘤细胞和使用细胞的姊妹染色单体的试验结 果呈阴性。,在细胞的染色体异常实验中表现为阳性和阴性 、 、 .,;,;。在试验中使用了个标准菌株 和 进行了直接致突变作用体外研究杨丽等,。除,. 外,其余酚类化合物均对 菌株具有致突变性,为直接致突变剂,其突变机 理是移码突变。国内外家组织、、、、和日本职业健 康安全协会没有对,.致癌性的作出评定/,和;,; ,;,;日本职业健康安全协会,,而,一在所有 的物种也没有发现显著的致癌性。没有足够的证据表明.氯酚和,.具有致 癌性,尽管在分子结构上有和个氯原子,但是有三个氯原子的,,.三氯酚 被、和定义为致突变物。评定,的致畸性实验中发现, ,.在细菌的逆向基因突变实验中没有致畸性,但是在其它实验中其结果是 阳性的,也无充足的数据表明,.具有致癌性。在,一对内分泌系统的 潜在影响实验中,其结果往往是相互矛盾的。一些研究表明,不能和雌激 素受体健合,也不能引起相应的雌激素受体调控的活化基因转录,但是也有 实验 表明它可以和雌激素受体键合。然而,多代的生殖毒性研究还不能确定, 对生殖行为和后代发育的影响。 氯酚类化合物的致突变率与取代氯原子个数没有直接的相关关系。总体来说, 随着取代氯原子个数的增加,氯酚类化合物的突变率有下降的趋势。一氯酚与二 氯酚的致突变率相近,均高于三氯酚与四氯酚,这可能是异构体不同引起的致突 变性不同所致【捌。王连生等用四唑盐比色法法研究了种多氯酚对小鼠 结缔组织成纤维细胞,人肝癌细胞的急性毒性效应。结果表明, 一、,,均可引起细胞凋亡,而更趋向于引起细胞坏死。 第章引言 两南大学硕十学位论文 引言 第章 .立题背景及依据 氯代苯酚类化合物是化工生产中的一类重要原料,其特点是应用范围广、生 产量大。其广阔的市场给我们带来了巨大经济效益,同时也对环境造成了潜在的 影响。其中多氯酚类化合物对水生生物的毒性和“三致效应研究已经成为目前 人们关注的热点问题。近年来,国内外学者在多氯酚对鱼类、藻类、发光菌、 蚯蚓、哺乳动物、离体细胞等多种生物体的毒性效应和定量结构.活性关系等方面 进行了大量研究,取得了一些有意义的研究成果。但是,有关,,.三氯酚对 水生生物的致突变性、致畸性和生殖毒性研究减少,特别是其慢性暴露对鱼体的 生长和生殖影响还未见报道。 ,,.三氯酚,,,别名,,.三氯苯酚,,, 分子式为,分子量为.,其密度为.,熔点.,沸点。, 为无色针状结晶或黄色固体,有强烈的苯酚气味,溶于水,易溶于醇、醚、氯仿, 甘油、石油醚和二硫化碳,具有强烈的刺激性气味,稳定性强,身体和衣物接触 后很难清洗。化学结构式如下: 图 ,,.三氯酚的化学结构.? ,, ,,主要用作染料中间体、杀菌剂、防腐剂,也用在合成聚醋纤维时用 作溶剂,在造纸厂、印染行业使用较多,并且在垃圾渗滤液、化工厂排放的废水、 污水处理厂排放的废水、农药废水、河水和饮用水中都检测到它的存在‘们。德国 已将其列入有毒物质,美国、中国等也将其列入优先监测污染物,关于,,一三两南人学硕士学位论文 第章引言 氯酚的污染排放标准如表.所示。 表 ,,.三氯酚的污染排放标准 尘堕呈:里塑旦望坐尘丝壁璺塑垒型呈:兰鱼:婴 类型 一级 竺蒌 三级 ,,的污染途径很多,可以通过工业废水污染河流湖泊、通过农药污染 水果和蔬菜、通过一些日常用品与人类接触,而且可以通过迁移将污染范围进一 步扩大。吸入、摄入或经皮肤吸收的三氯酚对身体有害,对眼睛、皮肤、粘膜和 上呼吸道有刺激作用。,,还影响鱼类和微生物的生长,并可在体内残留和 富集。所以,加强对,,的检测显得尤为重要,主要有方法高效液相色谱 、法【.、气相色谱法【】和法【】等。特别是研究三氯苯酚对水生生物的致毒 机理,对于保护水环境和人类健康都具有十分重要的意义。 .研究内容与目的 ..研究目的 以,,.三氯酚为研究对象,通过两代活体暴露实验,研究对鱼类的生理、 生殖活动的毒理学影响,评价,,一三氯酚在鱼体内的累积特性和毒性,探讨,, .三氯酚的内分泌干扰效应,为水环境中,,.三氯酚的污染控制和保护人类健 康 提供科学依据。 ..研究内容 .通过第一代活体暴露实验,研究,,.三氯酚对青鳓生长发育、成熟指数、 性腺和肝脏功能的影响。 .通过对青鳝子代的清水恢复和继续暴露实验,研究,,.三氯酚对青鳓个 体繁殖的影响。 .比较,,暴露对青鲻胚胎发育和幼鱼的影响。 .技术路线两南人学硕士学何论文 第章引言 图研究技术路线图 。 篓:茎丝丝耋至耋 ::查尘::至耋尘堡丝圣 第章材料与方法 受试鱼种 青鲻口埘,属脊索动物门一脊椎动物亚门?鱼纲一硬骨鱼亚纲? 鳓科。青鳓体侧扁,背部平直,头略平扁,眼大,口上位,横裂,无侧线,背、 腹鲭均小.背鳍位于体后部,几与臀鳍相对,尾鲒近裁形,生活于池塘、稻和 湖泊的上层。青鳓性活泼、喜集群、繁殖力强,几乎一年四季都可繁殖,分批 产 卵,卵膜具丝状物。 本研究选取的实验鱼种青鳝,已经在实验室实现循环水养殖系统养殖,鱼龄 为个月、发育良好且性成熟,体长一般为和 ,体重在. 左右见图 .。 图受试鱼种 札实验用水 . 实验用永为经活性炭过滤井曝气的自来水 :硬度为 面 水温控制在?.光周期为: 昼夜.溶解氧币低于/。 饲养期每天投喂饲料孜,即小颗粒商品饵料次和刚孵化的丰年两南大学硕学 位论文 第章材料与方法 虫幼虫 次,并及时清除排泄物和多余饲料。 .主要仪器与试剂 . ..主要仪器 蠕动泵://型,美国; 活性炭过滤器:.型,中山市日胜电器有限公司; 型,梅特勒.托利多仪器上海有限公司; 测定仪: 溶解氧测定仪:.型,上海精科雷磁仪器公司; 游标卡尺:.型,日本公司; 光学显微镜:型号,日本公司; 电子分析天平:型,北京赛多利斯仪器系统有限公司。 微量移液器: 、 、此和 ; 循环水养殖方形玻璃鱼缸: ; 。 挥发性有机污染物样品瓶: ..主要试剂 ,,.三氯酚:分析纯,公司,德国; 二甲基亚砜:级,公司,美国; ,,.三氯酚储备液:分别称取适量的,,.三氯酚,用二甲基亚砜溶解后, 配制成浓度为、、 的储备液,于。避光保存。 其余试剂均为分析纯或者级,购自公司或北京化学品试剂公司。 .暴露毒物配置 暴露时稀释至所需要的浓度,二甲基亚砜浓度小于.%。 ..暴露浓度组设置 浓度设置分别为、、、、班,每个浓度组设个平行。 ..暴露方式 /。 采用流水暴露系统,水流速为 /,,,.三氯酚流速为. .研究方法 在不同浓度水平的,,暴露下,研究青鲻的世代生长特性、生殖能力 和子代质量。 .实验步骤 两南人学硕士学传论文 笫章材料与方法 .曼曼皇 ???。?? 曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼量曼鼍曼曼曼舅量鼍曼鼍皇量曼皇曼毫 一 ..预备实验 的圆形玻璃烧杯, 通过预备实验以确定实验浓度的大致范围。实验用容器是 采用静水暴露,隔天人工换水。根据青鲻的毒性实验数据,先估计被试化合物 的 个浓度,、、、和“‖,以二甲基亚砜作为溶剂。根据试验液浓 度和试验溶液体积,计算出所需,,储备液的体积,加入到烧杯中,用玻璃 棒搅匀后,在每一浓度的容器内放入实验鱼条,观察一周,各个烧杯内鱼 的生长状态。 ..成鱼暴露实验 根据预实验的浓度范围设个浓度梯度,一组试验设置个空白对照。在 流水暴露中,选取性成熟的青鳝雌雄鱼暴露在不同浓度的,,、、、 和此,每组暴露雌、雄鱼各条。.%/用作溶剂对 照。 暴露条件为流水暴露系统,通过蠕动泵以. /的流速加样,水流速为 /。暴露 后,取鱼进行分析。 ..性成熟青鳐个体繁殖实验 每组选取对成鱼暴露在,,中,暴露 后开始收集鱼卵,每天上 午:~:收卵,连续收集 ,统计每天产卵鱼的配对个体数、产卵数,计算 每天每对鱼的产卵个数;将未受精的鱼卵挑出,计算受精率等。 ..幼鱼清水孵化与继续暴露实验 青蝣正常产卵时间为上午:左右,雌雄追尾后 开始产卵,所产卵由 卵膜丝附着在雌鱼臀部,容易收集,每尾鱼产卵量为~颗,所有卵都由卵膜 丝相连,需使用滴管将其分开孵化。 每天收集鱼卵后,取一部分放入清水中孵化,一部分继续暴露在,,溶 液中,与..的处理一样,每天更换,,和水,统计死亡的鱼卵数目和孵出 的鱼苗数,计算孵化率和畸形率等。 ..胚胎发育实验 将枚刚受精的日本青鲻卵,放置到含 测试溶液的培养皿中,每 观察并记录卵的胚胎损伤、发育和死亡情况,并及时清除死亡的卵,直到所有 能 孵出的卵全部孵出,观察并记录胚胎孵化时间和孵出数。两南火学硕十学位 论文 第章材料与方法 幼鱼孵出后,观察并记录畸形状况,将所有成功孵化的幼鱼转入含 测试溶液的烧杯中继续暴露,直到幼鱼能辨别雌雄结束。实验过程中,观察和 记 录游动过程中不能保持平衡鱼的数目平游失败率、幼鱼生长与死亡状况,及 时 清除死亡幼鱼。暴露结束,测定鱼的体长和体重,并通过性别特征如颜色确 定雌雄比率。 .组织指数分析 性腺指数系数的计算公式:性腺成熟指数性腺重/体重 肝脏指数系数的计算公式:肝脏成熟指数肝脏重/体重 .组织病理学分析 解剖分离性腺和肝脏,在’液中固定,按照常规程序脱水、石蜡包埋, 切片机切片,切片厚度为.岬,苏木精和曙红染色染色后使用显微镜 观察,并且用数码相机拍照。 .数据统计方法 实验数据分别通过.单样本检验和’检验确定其是 否符合正态分布和方差齐同。若两者均满足,则进行单因素方差分析 并以’检验进行后续的多重比较。反之,则进行非参数.检验。 检验产卵次数、孵化率、孵化天数和畸形率的 利用方差分析. 显著性,用最小极差法进行多重比较,.为差异显著。有关性别比 .。 的数据则以贮检验进行统计,统计学差异设为 .程 所有的数据分析均通过 .,,,和 序,完成,图中的数据点均用平均值?标准差 ?表示。 西南火学硕十学位论文 第章 结果与讨论 一 第章结果与讨论 . ,,.三氯酚暴露对青鲻体长和体重的影响 性成熟的青鲻鱼暴露于,,.三氯酚周,其间没有发现行为异常现象或死 亡。,,.三氯酚暴露对青鳝体长和体重的影响如图.所示。 图. ,,暴露对青鲻鱼体长和体重的影响,, .? ? 从图可以看出,总体来说,雌鱼体长随,,浓度的增加呈现下降 趋势,但在和 ; /浓度时略有反弹,在 /浓度时体长达到约 在/浓度中体长再度下降,达到最低值,约为 。反观雄鱼,其体长两南大学硕 士学位论文 第章结果与讨论 随,,浓度的增加一直持续下降,呈现出明显的剂量一效应关系;在浓度为 ,比雌鱼最低体长略短。从体重 /的,,溶液中,体长约为 变化看,雌鱼在 ‖浓度组以下变化不明显,在“‖浓度中体重增长较为 显著,并在?‖达到峰值;随后,在和 ‖浓度组中略有下滑, 并基本保持不再变化。雄鱼体重在“‖浓度组以下呈交替变化, / 浓度体重有较明显增长,并在和“/浓度组中基本保持不变。 . ,,.三氯酚暴露对青鲔成熟指数的影响 后,成熟雌雄鱼的肝脏指数和性腺指数 ,,暴露 的变化见图.。 从图?可以看出,在,,浓度低于 /时,雌鱼的肝脏指数都无 明显变化;从/浓度组到./浓度组呈现明显下降趋势;,, 浓度为“/时,雌鱼的肝脏指数与浓度为 ‖的肝脏指数基本持平, 趋于稳定。 雄鱼肝脏指数在各浓度组中表现出基本平稳的趋势,未见有明显的剂量.效 应 关系,但高于浓度“/后肝脏指数呈现略微下降的趋势。因为青鲻精巢很小, 所以称量和取样误差比较大,故精巢指数未显示。 从图还可以看出,与空白对照组相比,青鲻卵巢指数从到 ‖浓 度组略有增长,但无显著性差异;‘从到“‖浓度组中,肝脏指数随这浓度 的增加几乎无增长。与空白对照组相比,在和 班浓度组中卵巢指数显 著下降妇.;到 /浓度组与 ‖浓度相比,卵巢指数也有 明显下降。西南火学硕士学位论文 第章结果与讨论 图. ,,暴露对青鲻雌雄鱼肝脏指数、性腺指数的影响 ,, .. ,,对青鲻性腺发育和肝脏组织病理学的影响 暴露后青鳓性腺的典型组织切片如图.所示。 塑霍尘茎錾圭兰耋圣 薹耋彗量耋呈兰 空白 “剖 国 ,,三氯酚暴露后青鳓雌鱼卵巢的影响 ,,随着,,暴露浓度的增加,青鲔卵巢的卵巢损伤程度逐渐加剧。空白 对照组的卵巢中古有处于不同成熟期的卵母细胞,排列紧密,发育良好。在 “叽 浓度组中,可以明显地观察到卵细胞排列紧密性明显降低,呈分散状态,但每 一 个卵母细胞完整性保持相对较好。在?,浓度组中,单个卵细胞不始出现萎 缩情况,卵细胞排列越加松散,细胞不再是那么饱满,且成熟卵细胞发育情况 不 好,卵黄数量明显减少。在最高浓度组“以中,雌性青鳓的卵巢中未发 现有正常的成熟卵母细胞,细胞萎缩严重,排列无规则,紧密性受到严重诎 坏, 细胞挤压或变形,甚至出现破裂情况。 研究发现细胞出现了排列不规则、被挤压变形的现象,整体呈现萎缩退化状 态,这可能是暴露于,,三氧酚的雌鱼降低的原因。西南人学硕士学位论文 茄 章结果与讨论 。? :二,、 .‘/ 罄? .‘。 ?.一、? ; 、? 雌鱼对心组 雌鱼哪 图 .,暴露后的雌鱼肝脏组织切片 ,, 满鏊 图和图分别给出了,,暴露后的雌雄鱼肝脏组织切片。从这两 个图可以看出,在正常的青鳝肝脏组织中,肝细胞排列有序,细胞核位于细胞 中 间,而在暴露后的雌雄青鳓鱼肝脏中,细胞捧列紊乱,细胞膨胀,而且出现大 量 不规则油滴.细胞核明显偏离中心,细胞核聚集在一起,最高浓度“, 暴露还出现了明显的组织损伤, . ,,暴露对性成熟青蛸个体繁殖的影响 表给出了.,暴露对配对成鱼的繁殖影响。从表中可以看出, 在暴露组中每天产卵对数的个体数到 /都呈下降趋势,但是在“以这 第章结果与讨论 两南.火学硕十学位论文 个浓度组,却略有升高,但总体仍保持较明显的下降趋势。 表. ,,暴露对配对成鱼的繁殖影响,, 注:“”表示显著性差异. 每天每条雌鱼的产卵量下降,其原因可能是由于,,对卵巢造成伤害, 导致雌鱼的怀卵量下降,使得产卵量下降。同时也与,,对性成熟雌鱼卵 巢指数的影响一致。 . 鱼卵的受精率在,,暴露中也下降,特别是在最高浓度组./, 存在显著性差异.。这可能是,,对雄鱼的伤害,使精子的质量 和数量下降,导致受精率的下降。,,对鱼卵的伤害还导致鱼卵的存活数下 降,尤其是和 /这两个浓度组中显著下降.。 从表还可以看出,在“/的,,存在时,雌鱼的产卵量与对 照相比有所增加,但不显著。当,,暴露浓度继续加大时,雌鱼的产卵量 逐渐减少,在 /时实验组雌鱼的产卵量明显少于对照组.。 青鳓性腺的良好发育是繁殖成功的基础,鱼类性腺发育始终是在内分泌系统 调节控制下进行的。因此,环境内分泌干扰物的存在会对鱼类繁殖产生较大 的影 响。大量研究也证明,水体中三氯酚的存在,可对鱼体产生弱的类似雌激素的 效 应,可干扰正常的内分泌激素的效应【】。 . ,,暴露对青鲔胚胎发育及幼鱼的影晌两南大学硕十学位论文 第章结果与讨 论 表.给出了,,暴露后其子代受精卵在清水中的孵化率和畸形率。 从表.可以看出,在清水饲养后,总体来说,随着,,暴露的增加,青 鲻的孵化天数逐渐增加,孵化率逐渐下降,畸形率逐渐升高。暴露浓度为和 ./时,与空白对照,孵化率和畸形率无显著差异。 加? ,、 术 、一, 槲 皋 踟?们 禁 ???盈 加 一“ 浓度/ 表.暴露后其子代受精卵在清水中的孵化率和畸形率,, 注: 表示未检出. “”表示显著性差异. 图表示了,,暴露对子代孵化率的影响。从图所示,放入清水 中继续孵化的鱼卵,孵化率从和“/浓度组中没有显著下降,在和 /浓度组中明显下降.。 图 ,,暴露对子代孵化率的影响 ,, . 结果与讨论 两南人学硕士学佗论文 第章 如图.,放入清水中继续孵化的鱼卵畸形率也是在高浓度组中都显著增加 。。 /、 辞 、/ 褂 陕 留 工? 工 工??? 。 工囵阻日 浓度“/ 图. ,,.三氯酚暴露对青鲻子代畸形的影响 . ,,表.暴露后子代受精卵继续暴露的孵化率和畸形率 ? 哳 ,, 注: “”表示显著性差异. 表?给出了,,暴露后子代受精卵继续暴露的孵化率和畸形率。从 表.中可以看出,继续暴露在,,溶液中的鱼卵,在孵化天数上仍然没 有显著的变化。但是鱼卵的孵化率,从叽向上到摄高浓度 /浓度 组,均显著性下降.。 在,,浓度为和 /溶液中,受精卵的畸形率也呈显著性增 加.。 些里尘兰堡圭茎堡丝耋 量:茎篁星兰翌薹 镱 ’? 峨 图畸形幼鱼和正常幼鱼的对照 注;空心箭头为正常,实心箭头为畸形 畸形幼鱼和正常幼鱼的对照如图所示。从图可以看出,与清水中饲养 的鱼卯相比,继续暴露的鱼卵孵化率下降,畸形率均上升,且幼鱼在不同程度上 出现了大量的畸形,畸形的幼鱼游泳能力和摄食能力很差,出生后不久就死亡。 随着.,暴露浓度的增加,青喜幼鱼的死亡率逐渐增加,同样是在和 ?扎时死亡率较高,在最高浓度组?见死亡率达到.%。 孵化时间、孵化率、畸形率等指标可以反映受精卵及幼鱼的质量。其中,孵 化时阃与卵母细胞的营养储备有关,孵化率、畸形率与受精卵的遗传物质有关。 三氧酚暴露还影响青鳓的生殖能力 高浓度暴露会使雌鱼生殖力下降:对青 鳝子代有强烈的致畸性,影响子代质量 三氯酚可能具有遗传毒性,对于生物的 伤害不只持续一代。两南火学硕士学何论文 第章 结论与建议 皇皇 曼曼曼曼皇寡皇曼暑曼曼鼍??一???? 一 一 一?一 第章结论与建议 .主要结论 本文以,,一三氯酚为受试化合物,对青鲻的整个世代进行暴露,较为系统地 研究了长期暴露下青鳓一个世代中多项重要生命活动受到的影响,获得如下 结论: 总体来说,随着,,.三氯酚暴露浓度的增加,青鲻的体长和体重均下 降,但雄鱼在高浓度水平有回升现象;雌鱼的肝脏指数下降,而雄鱼在各浓度 水 平无明显影响。在低浓度组中,青鲻卵巢指数无显著变化:在高浓度组中,卵 巢 指数显著下降.。 随着,,.三氯酚暴露浓度的增加,青鳊的每天产卵对数没有明显变化, 但每条雌鱼的产卵量下降;鱼卵的受精率下降,特别是在 班浓度水平,存 在显著性差异.;鱼卵的存活数在和?/浓度水平也显著下降 .。 子代孵化率在清水饲养后其孵化天数没有明显变化。孵化率在矛 /浓度组中显著下降。畸形率在、矛彬各浓度组中都显著增加。 继续暴露的子代,在孵化天数上仍然没有显著的变化。孵化率和畸形率在、 并肛/浓度组中均有显著性上升。与在清水中饲养的鱼卵相比,孵化率下降, 畸形率均上升。 暴露后,幼鱼在不同程度上出现了大量的畸形,出生后不久 就死 亡。 .建议 本研究通过对青鲻两代不同浓度的暴露实验,分析了在不同浓度的,, 暴露下,生物一个世代中多项重要生命活动受到的影响。在,,的暴露环 境中,它对生物的毒理作用和机理研究也同样重要,在以后的研究中,应该进一 步加强,,对生物的毒性作用和机理、生物对,,的解毒作用和机 理等研究。这对于科学评估和降低毒物对于生物的危害,保护生态环境和人体健 康都具有重要的指导意义。 艏南人学硕士学何论文 参考文献 参考文献 】.,...【】..., ,:. 】邹桂香,戴友芝.氯酚类有机物的厌氧生物降解性】。杭州化工,,:.. 董爱明.氯酚类化合物生物降解的研究现状及其应用前景】.净水技术,,:. 】姜梅,牛世全,展惠英.氯酚类化合物的微生物降解研究进展】.应朋生态学报,,: . . 【】..,.,.., 】.,,:. 】..,..,.... 】. , ,: 】....:.。.】. : ,, .. .,.,., . 川. ,,: . 【】..,.. ‘ . 】. , ..,.,..,..:【】.....,,: .。 【】. , .: //./// ..【】..,..,.., . ,】. ,:. 【】..,..,.., . ,, 】.,,:..两南火学硕士学位论文 参考文献 ...... 一一????。鼍曼曼苎曼 . ,, ..,..,..,/./ . . ,,, 【..,... 】.: :, , .: ,,.. 【杨霓云,刘征涛,王宏.五氯苯酚与邻氯苯酚和,二?苯酚对斑马鱼的联合 毒性】.环 境科学研究,,:.. 【】李静,吴端生,彭放.硝基苯类、氯酚类化合物对金鱼的急性毒性研究】. 湖南环境生物 职业技术学院学报,,:. 】卢玲,沈英娃.酚类、烷基苯类、硝基苯类化合物和环境水样对剑尾鱼和稀有驹鲫的急性 毒性】.环境科学研究,,:.. 【】聂品磊,刘锋,周春玉.氯酚类化合物对金鱼的急性和亚急性毒性研究】.环境科学研究, ,:?. . 【】.,.,., 【】..。.,,:. 【】王连生,张峻峰,张峰.多氯酚类化合物对离体培养细胞的研究及毒性机理初探】. 科学通报,,:.. 】王芳.水及鱼胆中氯酚的化学测定】.国外医学卫生学分册,,:.. 【】王芳,林少彬,陈亚妍.鱼组织中氯酚及其共轭物的分离与测定【】.卫生研究,,: ‘ .. 】.,..,... ?. 【. ,, .【】..,..,. ,】.,,:.. 】. /, , ,,, . 王建龙.微生物群落对多氯酚的脱氯特性及机理研究】.中国科学辑,,: ..【】..,.. . ? 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