免疫组化

免疫组化 第一抗体就是能和非抗体性抗原特异性结合的蛋白。种类包括单克隆抗体和多克隆抗体; 第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。二抗是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，去免疫异种动物，由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白。用抗AIV H5亚型血凝素单克隆抗体为包被抗体,兔抗AIV IgG为第二抗体。 免疫组化 是融合了免疫学原理(抗原抗体特异性结合)和组织学技术(组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等)，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织(细胞)内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。 elisa(酶联免疫吸附试验) 用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，操作上 开始需要将抗原或抗体结合到固相载体面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。 免疫组化和elisa所用到的原理 大致相同，只是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上有所不同。Elisa多用于定量分析，其灵敏度非常高。 western bolt 先要进行SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。 免疫学三大工具，免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。 以下western和Elisa的区别不是原创，是找的资料。 western blotting 可以看到特异性的条带，但是定量比较烦 elisa可以直接读出浓度，但是如果抗体有非特异性结合，那得到的数值就不可信。 WB只能半定量,但是可以检测细胞膜蛋白,这点ELISA做不到 ELISA可用定量方法检测蛋白,也就是说可以观察不同浓度刺激物对目的蛋白的影响 WB所检测的一般是抗原， 而Elisa抗原抗体都可以检测。 WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体、降解产物等，一句话，WB可以确定所用抗体是与那种蛋白起作用的;而Elisa无能为力，一锅端了。 WB所适用的一抗一般是线性位点的， ELISA线性或构象型抗体都可以使用。 从另一个意义上讲，WB可以做抗体是线性位点还是构象型位点的补充判定，而Elisa不行。 WB一次处理量就是一块胶版，10-20个样品最多了。 Elisa一块96孔板一次可以处理96个样本，可以设置多个复孔、对照、梯度样等来提高检测的可信度。 WB操作常见的非特异性条带，膜本底差，显色不好等等缺点在Elisa上表现得要好得多。 应用逆转录PCR(PT-PCR)技术RT-PCR。RT-PCR 为反转录RCR和实时PCR的共同缩写。是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为通过PCR进行DNA扩增。 Western Blot Western Blot中文一般称为蛋白质印迹。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。 蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治?斯塔克(George Stark)。在尼尔?伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry) 中首次被称为Western Blot。 原理 Western Blot与Southern印迹杂交或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素膜NC膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 分类 Western Blot显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 其他 值得一提的是，western blot 这个名称的由来很有意思。最开始做印迹工作的是一个叫做Southern的科学家，但印迹的对象是DNA链，他把这种技术称为Southern blot，后来类似的出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对RNA，一个对蛋白质，人们分别把这两种技术的称为Northern和Western，与这两个技术的发明人没有关系了。 免疫组化 概念和常用方法介绍 1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学(immunohistochemistry)技术或免疫细胞化学(immunocytochemistry)技术。 2、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AKP)等的抗生物素(如链霉亲和素等)结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1)按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷 酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法 等。 2)按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)。与直接法相 比，间接法的灵敏度提高了许多。 3)按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法;亲和连接， 如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结 (SP)法等，其中SP法是比较常用的方法;聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤 其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1)免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理， 先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜 下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从 而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、 灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 2)免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理 是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或 具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行 定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。本方法与免疫荧光技术相比的主要优点 是:定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方 法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特 异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的有ABC 法、SP三步法、即用型二步法检测系统等。 3)免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶 体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的 影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球 菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。 由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合 于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进 行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。 5、被检测的物质 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、 酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 、特点 6 1)特异性强 免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论 上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白(keratin)显示上皮成分，LCA显示淋 巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉反应。 2)敏感性高 在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的 技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍;现在由于ABC法或SP三步法的出现，使抗 体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体 抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。 3)定位准确、形态与功能相结合 该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可 同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合 的研究，对病理学领域开展深入研究是十分有意义的。 7、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与Western blotting、ELISA的异同 1)Western blotting 蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技 术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能更加 准确;当然Western blotting也可定性和定位(通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别 检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位)，但敏感性远远低于免疫组化技术。 2)ELISA 酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织 匀浆中蛋白含量的检测。与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方 法之一。 下面介绍下免疫组化方法的具体实验流程步骤。 实验流程简介 一、SP三步法 1)石蜡切片，常规脱蜡至水。 2)0.3%或3%H2O2去离子水(无色液体)孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。 3)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟 4)候选步骤:采用抗原修复:微波(建议30分钟内4次中火)、高压、酶修复方法。自然 冷却，再用3分钟×3次. 5)血清封闭:室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。 6)滴加适当比例稀释的一抗，37?孵育2~3小时或4?过夜(最好复温)。PBS冲洗，3分 钟×5次。 7)滴加生物素标记的二抗，室温或37?孵育30分钟-1h。 8)PBS冲洗，3分钟×5次。 9)滴加SP(链霉亲和素-过氧化物酶)，室温或37?孵育30分钟-1h。 10)PBS冲洗，3分钟×5次。 11)显色剂显色(DAB等)。 12)自来水充分冲洗。 13)可进行复染，脱水，透明。 14)选择适当的封片剂封片。 二、即用型二步法 1)脱蜡、水化组织切片。 2)根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。 )0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS或TBS3 冲洗。 4)滴加一抗，室温或37?孵育30~60分钟，或4?过夜，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。 5)滴加enhangcer增强剂，3730min?，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。 6)滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体，室温/37?孵育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗，3 分钟×5次。 7)应用DAB溶液显色。 8)蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。 三、免疫荧光技术(略) 1、酶免疫组化的关键环节 1)标本固定 固定的目的是 ?防止标本从玻片上脱落; ?除去妨碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果; ?固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用4%多聚甲醛，但睾丸组织、眼可能要选 用Bouin’s液或mDF液效果较好。 2)脱水、石蜡包埋和制片 脱水用梯度乙醇(由低到高)充分脱水、对组织要完全浸蜡、 切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。 3)脱蜡和水化 这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以 先6020min?，然后立即二甲苯1-3分别10min(这个时间是由二甲苯新鲜程度和室温等 综合决定的)，但当天制好的切片一般先603?-4h。水化用梯度乙醇(由高到低)。若脱 蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。 4)抗原修复 由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及 醛基的封闭作用，从而失去抗原性;通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露， 提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶 修复。修复液也分为若干种(具体的可以查阅相关资料，大量的:中性的、高pH的等)。我们实验室一般用微波修复中火6min*4次，效果不错。注意微波修复后自然冷却30min左右(只要你觉得修复液的温度达室温即可)。 5)细胞通透 目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学(>10um厚切片)和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。同时也是一种去污剂，一般在PBS中加入后终浓度是0.05%即可，而前者终浓度是0.5%-1%。石蜡切片4um左右可以不通透，因为细胞已经被切开了。 6)灭活内源性过氧化物酶和生物素 在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min;用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片;现用现配，配好后4?避光保存。不过，现在已有“第二代即用型免疫组化试剂盒”避免内源性生物素的干扰，推荐使用。 7)血清封闭 组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性;封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合;也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室 -30min。但也要防止封闭过度 温10 8)一抗和二抗浓度和孵育时间 一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有几种:4?、室温、37?，其中4?效果最佳;孵育时间:这与温度、抗体浓度有关，一般371?-2h，而4?过夜和从冰箱拿出后37?复温45min。具体条件还要摸索。 二抗孵育条件:二抗一般室温或3730min?-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。建议一抗反应在4?最佳，反应温和，但时间最好超过16~24h。 9)抗体稀释液 其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可，但专用的抗体稀释液中除PBS成份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。正因为这种原因，我一直用国产的专用抗体稀释液，一段时间在更换新抗体稀释液时实验结果出现了阴性结果(提示可能一抗没有结合)，最后从抗体浓度和孵育时间、封闭时间等原因排除后，发现是新抗体稀释液的PH值偏酸，而使抗原抗体反应不佳，终而出现假阴性结果。 10)切片清洗(浸洗、冲洗和漂洗) 为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。 注意:?单独冲洗，防止交叉反应造成污染。 ?温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式; ?冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。 ?PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄(未见特异性染色)，建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。(中性及弱硷性条件(PH7-8)有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解) 11)DAB显色 背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色 时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较 浅时即可冲洗;DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深的棕褐色，这很可能 说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时 间;此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需 要延长封闭时间;DAB显色时间很长(如超过十几分钟)才出现阳性染色，一方面可能 说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短(最好一抗4?过夜);另一方面就是封闭时间过 长。 12)复染 目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用苏木素复染(胞 核染料)。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况， 一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋白则要短。不过这个如果染 色不理想可以补救的。方法是:染色深则分化时间稍长些即可;染色浅则再置于苏木素 中染色即可。盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后 置于盐酸酒精中数秒(一定动作要快)后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。 13)封片 为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载 玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角， 接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止;当发现液体接触面在不断弥散 时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。 2、免疫荧光方法中的重要环 1)冰冻切片制备 建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干 净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。 2)组织切片固定 切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时 间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。 3)血清封闭 为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清(与二 抗来源一致)封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。 4)一抗孵育条件 在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有 几种:4?、室温、37?，其中4?效果最佳;孵育时间:这与温度、抗体浓度有关，一 般371?-2h，而4?过夜和从冰箱拿出后37?复温45min。具体条件还要摸索。 5)二抗孵育条件 二抗一般室温或3730min?-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工 作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗 浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗随 着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行 适当的离心。 6)复染 目的是形成细胞轮廓，从而更好对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。 7)封片 为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止;当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。 8)切片清洗 为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。 注意: (1)单独冲洗，防止交叉反应造成污染。 (2)温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式; (3)冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。 (4)PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄(未见特异性染色)，建议pH在7.4-7.6浓度是0.01M。(中性及弱硷性条 件(pH7-8)有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解) 9)拍照 有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持 避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要 随意改变程序;应在暗室中进行检查;防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上 防护眼镜;检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧 光减弱;标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色;激发光长时间的照射， 会发生荧光的衰减和淬灭现象;所以最多不得超过2~3h;荧光显微镜光源寿命有限，标 本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开 始就使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避 免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后;标本染色后立即观察，因时间久 了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4?保存，可延缓荧光减弱时间，防 止封裱剂蒸发;使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油 镜，还必须保证镜油为无荧光镜油;电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯 的寿命，也会影响镜检的效果。 3、免疫组化和免疫荧光结果分析: 案例一 DAB染色后切片着色一片黄/背景深 背景:奥运会期间我们课题组研究生都在实验室做实验，许多从北京购买的试剂买不到，对我们的许多实验产生了很大的影响。我以前一直用中杉金桥的SP三步法染色试剂盒，效果不错，在奥运会期间我准备做同批实验分不同批次酶免疫组化实验，第一批组化实验结果很好，抗体浓度感觉比较合适(Santa Cruz公司1:200)，等做第二批时发现封闭血清不够了，为了保证实验顺利进行，我又从福州迈新顶了一个SP试剂盒，同时抗体稀释液也不够了，我又重新从博士德公司买了一小瓶10ml。从第二批实验开始，组化实验结果一直显示强背景着色，特异性染色很难辨别。后来我将标本拿到上海舜田生物去做，做了效果很不错，于是我就请教了他们公司从事病理30多年经验的老师，她告诉我应该如何去分析和解决问题，很快我就找到了思路，结果问题终于解决了。 问题及其解答:产生组织切片非特异性染色的原因有哪些,如何解决, 1、抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀 释抗体来控制。这是最重要的一条。 2、一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。 3、内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高(含血细胞多的组织)，需要通 过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色; 4、非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增 加浓度来加强封闭效果; 5、 DAB孵育时间过长或浓度过高; 6、 PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤为重要; 7、 标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。 我的实际解决:以上的分析可能对于初学者还是不容易的，下面我就把我的排除实验的具体过程与大家进行分享、交流和讨论。 1、首先排除抗体孵育条件。一般来说，着色效果的好坏与抗体的孵育条件是密不可分的， 由于用SP法已经做出来过一次且效果不错，因此对于同样组织的同一抗原进行分析， 这种因素可以先排除。 2、其次，DAB孵育时间是否太长,做出来那一次我是孵育8min，后来也是8-10min，我单 独做了一次实验来排除该因素。结果孵育2、5min时先出现背景，而特异性染色较浅， 故这不符合常理，一般先出现特异性染色，然后随着时间的延长，会出现非特异性背景 着色。 3、最后，血清封闭的问题,以前我一般孵育15-30min，所以我单独做了一次实验用血清封 闭室温1h，其它条件同做出来的那一次，结果也一样背景着色很深。 4、此外，我在改进的同时，也对PBS清洗不断地延长时间和增加次数，甚至完全参照试剂 盒说明书来进行操作(我以前一般一抗4?过夜且室温复温45min、二抗3730min?、SP 反应37 30min?)，以及过氧化氢灭活加强等等均未起到效果。我冷静地分析了一下整 个实验流程，与第一次做出来相比，只有两个地方做了改动:因血清不够而更换了不同 厂家试剂盒、因抗体稀释液用完而重新买了抗体稀释液。 5、我用PBS替代一抗稀释液(我以前还回收抗体，自我觉得抗体稀释液中含防腐剂和蛋白 稳定剂)，其它步骤和组织切片完全与第一次做出来的一致(包括血清也是老试剂盒内剩 余的一点)，奇迹出现了:结果很好。因为抗原抗体反应除温度、抗原/抗体浓度外，然 后就是pH值，于是我测了新抗体稀释液、老抗体稀释液和PBS的pH值，结果是前者 偏酸性(<6、0)，而后两者均在7、5左右。 6、看来主要祸根是抗体稀释液的pH值出问题了，于是我又用PBS替代抗体稀释液和新试 剂盒内的试剂对组织切片做了免疫组化，结果还是没有做出来:背景很深。这真把我搞 惨了。难道还有什么原因吗,通过仔细分析:一抗一定是结合上去了(老SP试剂盒结 果很好)，问题是二抗没有结合上去也不对(因为最后背景很深，这说明二抗可能也结合 上去了)，DAB孵育时间现在只用1、5min也是背景深而特异性染色浅，那我又怀疑封 闭血清了。 7、我做了两张切片:一张用老试剂盒内还剩下一点的血清而另一张用新试剂盒内的封闭血 清，其余试剂(二抗、SP)均用新试剂盒提供的，结果是前一张效果很好，而后一张能 够看到特异性染色，但背景太深，拍照效果不佳。看来封闭血清也是罪会祸首之一。结 果分析显示:抗体稀释液的PH值偏低和封闭血清的失效导致了我的免疫组化结果的不 佳，望大家在以后的组化实验中也要注意这两个不太引人注意的关键问题。惨痛的教训， 值得引以为鉴。 案例二DAB染色后切片着色呈阴性结果 背景:其实免疫组化在DAB染色后一般有四种情况:阳性染色效果很好、阴性染色、非特异性染色很深、阴阳脸(染色不均匀)。而阴性染色是许多初学者经常遇到的头疼问题。我身边有个研究生同学在我们实验室初次涉入免疫组化，听说步骤不难，跟我后面做了几次之后，就自己开始做了，连续做了三次，结果均是阴性染色。很扫兴，不知是什么原因导致的，后来我还是请教了上海舜田生物老师，她免费提供给我我很大的帮助，解决问题的思路也逐步清晰。 问题及其解答:免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些, 1、抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不知抗体是进口的还是国产的工作液，怎 么这么高稀释度也没能做出阳性结果,另外，不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果， 抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索最佳浓度。 2、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗 体结合;建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。 若不行，还可高压修复。 3、组织切片本身这种抗原含量低; 4、血清封闭时间过长。 5、DAB孵育时间过短。 6、细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。 7、开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。 我的实际解决方案: 1、首先，排除组织切片内的抗原有无丢失及其含量多少。免疫组化中两个最重要的因素是 抗原和抗体。 (1)抗原有无丢失主要看组织切片的新鲜程度，一般切片室温保存超过3-6个月，可能切 片内的抗原丢失很严重(有文献支持)，此时可以通过重新用石蜡块切片来进一步验证 (蜡块需要低温保存)。 (2)石蜡切片在制作过程中可能因醛基对抗原决定族的封闭，这需要通过抗原修复来充分 暴露，从而增加抗原抗体结合反应，提高阳性率，我一般用6min*4次中火微波抗原 修复，用枸橼酸钠缓冲液。 (3)组织切片中本身抗原含量的多少,这方面我有教训的，我做胎鼠睾丸间质细胞鉴定， 用1:200一抗效果很好;但我用1:200一抗孵育成年睾丸间质细胞检测，几乎呈阴 性，后来证实是因为两者抗原含量相差甚远，则一抗也要适当提高浓度。 2、其次，检查抗体有无选择错误和抗体孵育条件是否不适。 (1)一抗选择单克隆抗体易出现阴性结果，因为灵敏度低但特异性好;一抗的species reactivity中无检测组织的种属，这是比较常见的错误;一抗选择rat，而二抗是抗 mouse/rabbit等均有可能出现阴性结果。 (2)抗体孵育时间过短，容易导致阴性结果。一般一抗我建议4?孵育过夜和37?复温 45min;二抗我一般3730min?。我不喜欢参照二抗染色试剂盒说明书。 (3)抗体浓度过低。这是阴性结果的最可能原因。必须提高稀释度，我一般初次做一种新 抗体，喜欢先用说明书建议的低浓度和高浓度做一次，然后决定是向高还是低方向摸 索。一般先决定二抗的浓度(工作液就好办了，直接滴加)，重点摸索一抗的最适浓度。 注意:免疫反应中存在前带和后带效应，这提示不是浓度越高，阳性率就越高，反之 亦然。 (4)重要原因排除之后，也不要忽视抗体的质量:原装抗体一般比较稳定，效果较好;而 进口分装次之;工作液可能要注意质量问题。 3、同时，DAB的孵育时间可能要适当延长，在镜下观察，有时可延长至30min。但一般3-10min最好，此时背景也较浅。否则，说明抗体浓度不合适。 4、最后，血清封闭时间也可相应缩短。一般10-30min，但这个时间可以调整，封闭主要是 降低切片的总体背景着色。 5、此外，细胞通透也不可忽视。许多战友认为石蜡切片一般不需细胞通透，因为切片时可 能已经把细胞切开了，但对于胞核蛋白，建议还是通透一下，促进抗体等试剂充分进入 参与反应。 6、以上原因，都是针对实际中常见原因来进行分析的，前提是排除操作者的操作错误而引 起阴性结果，这就需要新手还是要设置阳性对照以排除方法的问题。还有抗体稀释液的 pH值过低等其它原因的干扰。总之，要想把免疫组化做好，可能每一个环节都很重要， 但也存在主次之分，出现问题了，需要通过先排除主要的，再依次排除次要的--这是衡 量你对免疫组化原理掌握与否的关键所在。 案例三石蜡切片免疫荧光染色呈阴性结果或非特异性结果 背景:因实验需要，于2008年07月04日初次做肝脏组织ZO-1(一种胞膜蛋白，紧密连接蛋白)免疫荧光染色，以前我对酶免疫组化非常熟悉，在丁香园子内也有不少置顶贴和精华帖，但免疫荧光一直还没做过(原理知道，但细节不太了解)。我先用石蜡切片做了5次，结果一直不理想(表现为未见特异性强染色);近几日，在舜田生物老师的帮助下，我又切了冰冻切片，做了2次，终于基本成功了。在这个过程中，我对免疫荧光染色技术有了 全新的认识，而前些天发出免疫荧光求助贴，回复的很少，所以有必要加强对免疫荧光方面的讨论)，不妥之处敬请指正。有人会问酶免疫组化做的好好的，为何要做免疫荧光,其实，这也是我以前思考的难题，现在我认为可能胞膜蛋白含量不高，用普通免疫免疫组化可能做不出来，需要敏感的免疫荧光方法来进行蛋白检测(我是看许多外文文献都是这样做的，因此选择免疫荧光染色。) 问题及其解答:如何降低非特异性荧光染色和避免阴性着色, 1、非特异性染色产生原因及其解决方案: (1)游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物， 而不能被透析除去。二抗配置时用透析法或层析法分离荧光素标记的二抗和游离的二 抗。购买高质量、高纯度的荧光素二抗。 (2)抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。 (3)组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原(如Forssman 氏抗原)，可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。延长血清封闭时间。 (4)从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分 的抗体，以致容易混淆。 (5)抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸 附于正常组织上而呈现非特异性染色。 (6)荧光素不纯、标本固定不当等。 (7)一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。调整一抗和二抗孵育条件和浓度至最佳。 8)一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清洗时间。 ( 2、阴性染色产生的原因有: (1)一抗和二抗浓度不合适或孵育条件不妥。 (2)荧光素提前衰退。荧光素质量不佳或操作过程中没有注意避光等防止荧光素衰退的事 项。 (3)血清封闭时间过长。 (4)抗体稀释液PH值不合适，影响抗原抗体反应。 (5)组织切片不平、裂片或脱片很严重，易引起大块阴性着色。 (6)组织标本不新鲜或已经冷冻组织制成的切片中抗原易弥散，易引起本来表达的部位阴 性染色或弱着色。 (7)荧光显微镜不会使用，激发波长选择错误。