人参总皂甙协同造血生长因子体外诱导CD34 造血干-祖细胞扩增与分化的作用

人参总皂甙协同造血生长因子体外诱导CD34 造血干-祖细胞扩增与分化的作用 人参总皂甙协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干/祖细胞扩增与分化的作用 作者: 王建伟，王亚平，王莎莉，姜蓉【摘要】 为探讨人参总皂甙(total saponins of panax ginseng, TSPG)协同造血生长因子体外诱导CD34+造血干/祖细胞 (HSC/HPC)扩增与分化的作用，收集人脐血、骨髓细胞并采用StemsepTM干细胞分选系统分离纯化CD34+ HSC/HPC，用不同剂量TSPG加入不同组合的造血生长因子进行培养，检测细胞总数、CD34+细胞和CD33+细胞比例及集落形成细胞 总数(CFC)、粒系祖细胞(CFU-GM)数量变化。结果显示: 10-70 μg/ml TSPG均可不同程度地提高脐血细胞总数、CFC数和CD34+细胞数， 50 μg/ml是最佳刺激浓度，可使细胞总数、CFC数和CD34+细胞数分别增至 (2470.5?79.96)×10 3、(53.96?4.29)×100%和(2 1.86?3.09)×100%; 20 μg/ml是液体培养诱导骨髓CD34+细胞向粒系分化的最佳浓度，可使细胞总数、CFU-GM和CD33+细胞分别增至(133.2?9.03)×10 3、(26.78? 1.91)×100%和(16.98? 1.73)×100%;甲基纤维素半固体培养检测显示，TSPG(10-50 μg/ml)均能提高CD34+细胞形成CFU-GM的集落产率，以TSPG 20 μg/ml效果最为明显。结论: 合适剂量的TSPG能够促进CD34+造血干/祖细胞体外扩增与定向诱导分化。 【关键词】 人参总皂甙;CD34+造血干/祖细胞;细胞扩增; 细胞分化 Synergistic Effects of Total Saponins of Panax Ginseng in Combination with Hematopoietic Growth Factor on Proliferation and Differentiation of CD34+ Cells Ex Vivo AbstractTo investigate the effects of total saponins of panax ginseng (TSPG) in bination with hematopoietic growth factors (HGF) on proliferation and differentiation of CD34+ cells ex vivo, the purified CD34+ cells from cord blood and bone marrow were expanded by various concentrations of TSPG with bination of cytokines in liquid culture systems and the expanded cell number, CD34+ cell number, CD33+ cell ratio, the numbers of total CFC and hematopoietic progenitor cell number were detected. The results showed that TSPG (10-70 μg/ml) could raise the expanded cell number, CD34+ cell number, and the numbers of total CFC, TSPG 50 μg/ml was identified as the most potent stimulating concentration, and increased total nucleated cells to (2470.5?79.96)×103 、 CFC to (53.96?4.286)×100% and CD34+ cells to (2 1.86?3.094)×100%; TSPG (10-50 μg/ml) could raise the colony formation rate of CFU-GM, TSPG(20μg/ml) induced the best effect on granulocytopoietic differentiation mitted of CD34+ cells. It is concluded that the optimal concentration of TSPG can promote CD34+ cells to proliferate and differentiate by cooperating with hematopoietic growth factors. Key wordsTotal Saponins of Panax Ginseng; CD34+ Cells; Proliferation and differentiation 造血干/祖细胞的体外扩增和定向诱导分化是造血干细胞工程研究的关键课题，其研究现状展示了它对临床医学研究领域具有重要的理论价值和应用 潜力，同时也为中医药现代化研究带来了新的切入点。人参是祖国传统医学的"补气"要药，人参皂甙是人参中主要的有效药物成分。我们前期工作研究明: 人参总皂甙(TSPG)是人参促进血细胞生成的有效成分。TSPG在体内外均能刺激造血干细胞(CFU-S)和造血祖细胞(CFU-GEMM、CFU-E、BFU-E、CFU-GM和CFU-MK)的增殖分化,1-3,。本研究将进一步采用造血细胞工程技术，以分离纯化的CD34+HSC/HPC为靶细胞，探讨TSPG对CD34+HSC/HPC扩增及诱导分化为粒系血细胞的作用，旨在阐述人参"补气生血"的现代生物学机理，为临床治疗血液学疾病提供指导。 材料和方法 主要试剂 RPMI 1640与IMDM培养基购自美国Gibco公司，淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂，马血清(HS)由军事医学科学院提供，胎牛血清(FBS)购自Sigma公司。FL、TPO、SCF和G-CSF购自美国Santa Cruz 公司，IL- 3、GM-CSF和EPO由军事医学科学院提供。小鼠抗人FITC标记的CD33抗体购自Santa Cruz 公司，小鼠抗人FITC标记的CD34抗体购自美国Bection Dickinson公司。StemsepTM分选系统购自加拿大StemCell Technologies公司，流式细胞仪FACS Vantage 购自美国Bection Dickinson公司。 药物 人参总皂甙(total saponins of panax ginseng， TSPG)由重庆中药研究所惠赠，纯度95%以上，用IMDM配成1 mg/ml的工作液，正压过滤除菌。 细胞来源 正常骨髓细胞取胸外科无血液疾病患者切除的肋骨骨髓，淋巴细胞分离 077)分离单个核细胞(MNC)，用RPMI 1640培养液洗液(Ficoll，相对密度1 涤，用4号针头制备单细胞悬液，并计数MNC。 脐血细胞取自足月妊娠正常分娩脐带血(重庆医科大学第一附属医院提供)，采集按Broxmeyer报道方法进行，细胞在12小时内经Ficoll(相对密度1 077)梯度离心，制成MNC悬液。 CD34+HSC/HPC的分离纯化 将(4-8)×107骨髓、脐血MNC悬浮于含2%胎牛血清的PBS缓冲液中，加入antibody cocktail 100 μl，0? 30分钟，再加入磁性胶体60 μl，0? 30分钟。采用CD34 StemsepTM分选系统，操作按进行。将标记后的骨髓、脐血MNC加入磁场中的分离柱内，加缓冲液冲洗，从流出道收集未标记的细胞群。离心洗涤后，流式细胞仪FACS Vantage (Becton Dickinson Immunocytometry System, USA)检测分离CD34+细胞纯度;采0.1 ml收集细胞进行台盼蓝染色以鉴定细胞活力。 TSPG对CD34+细胞扩增影响液体培养检测 以含有12.5% HS、12.5% FBS、5×103/ml脐血CD34+细胞的IMDM为基础体系。对照组: 在以上体系内加入FL/TPO/SCF/IL-3/GM-CSF/G-CSF/EPO(FL、TPO、SCF、IL- 3、GM-CSF、G-CSF和EPO的终浓度分别为40、 10、100、 2、50和20 ng/ml及2 U/ml)重组细胞因子组合。 TSPG组: 以对照组培养体系为基础条件，加入不同剂量的TSPG，终浓度分别为 10、 20、50、70和100 μg/ml。细胞因子每48小时加入体系1次，均连续加入5次;TSPG每周加入1次。上述体系接种于24孔板中，每孔1 ml，复种3孔，37?、 5% CO2及饱和湿度下培养18天，每周半量换液，取出细胞用于细胞总数、CD34+细胞比例及造血祖细胞检测。 TSPG对CD34+细胞分化影响的液体培养检测 骨髓CD34+细胞培养(细胞数、TSPG浓度以及培养条件均同脐血细胞培养)体系中加入重组细胞因子组合SCF/IL-3/GM-CSF/G-CSF，培养时间为2周。每周半量换液，取出细胞用于细胞总数、CD33+细胞比例及CFU-GM祖细胞检测。 CD34+、CD33+细胞的检测 将扩增的细胞经PBS洗涤后，用直接荧光法标记行流式细胞仪检测，每个样品细胞数?1×104，用PC-Lysys II软件在VAX3300微机(Digital， USA)上进行分析。 造血祖细胞培养 体系中含30% HS、10% BSA、SCF、IL- 3、GM-CSF、EPO及在此基础上分别加入5×103/ml CD34+细胞、 5×104/ml扩增细胞，IMDM及0.9%甲基纤维素。所有培养均在96孔板(每孔0.2 ml，复种3-5孔)进行，37?、 5% CO2及饱和湿度下培养6天后计数CFU-E，14天计数CFU-GEMM、CFU-GM和BFU-E，其总数即集落形成细胞总数(CFC)。 TSPG对CD34+细胞形成CFU-GM能力影响的甲基纤维素半固体培养检测 体系中含30% HS、10% BSA、SCF、IL- 3、GM-CSF、G-CSF及5×103/ml CD34+细胞，IMDM及0.9%甲基纤维素。药物组为在CD34+ 细胞培养体系中加入不同剂量的TSPG(剂量同前)，以不加TSPG为 行，37?，5% CO2及饱对照组。所有培养均在96孔板(每孔0.2 ml，复种3-5孔)进 和湿度下培养14天后计数CFU-GM。 统计学方法 显着性分析用t检验，P,0.05为差异有显着性。 结果 CD34+细胞的分选、纯化与鉴定 骨髓、脐血MNC中仅有少量细胞表达CD34抗原，CD34+HSC/HPC仅占1%-3%，用StemsepTM系统分离纯化可得到高纯度的CD34+细胞，经流式细胞术检测，其纯度为86%-92%。台盼蓝拒染测定，CD34+细胞活性为95%-99%。 体外扩增细胞的形态学观察 CD34+细胞经体外培养18天后，出现不同发育阶段的血细胞，形态各异(图1)。