淀粉酶活性测定实验报告2

淀粉酶活性的测定 一、研究背景及目的 酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到 淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的作用方式，可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的两种，存在于禾谷类的种子中。β-淀粉酶存在于休眠的种子中，而α-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的。 α-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标,α-淀粉酶活性低的品种抗穗发芽,反之则易穗发芽。目前,关于α-淀粉酶活性的测定方法很多种,活力单位的定义也各不相同,国内外测定α-淀粉酶活性的方法常用的有凝胶扩散法、3 ,5-二硝基水杨酸比色法和降落值法 。这3 种方法所用的分别是新鲜种子、萌动种子和面粉,获得的α-淀粉酶活性应该分别是延迟(内源)α-淀粉酶、萌动种子α-淀粉酶和后熟面粉的α-淀粉酶活性。 测定方法 优点 缺点 DNS 灵敏、准确、精确度高,适宜精确测量小样品α-淀粉酶活性大小 测定步骤较繁,不便大量样品,测定范围较窄 凝胶扩散法 简便、快速、省时、省力,消耗材料和药品较少,不需要特殊仪器,测定范围较宽 边界不清晰,灵敏度与准确度较低,不适宜精确测量α-淀粉酶活性的大小 降落值法 快速、省时、重现性好、平行性好、消耗的药品少,适宜于测量大量样品 消耗的材料多,间接测定α-淀粉酶活性大小       本实验的目的在于掌握α-淀粉酶和β-淀粉酶的提取和测定方法。 二、实验原理 萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是α-淀粉酶和β-淀粉酶，β-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6下则发生钝化。本实验的设计利用β-淀粉酶不耐热的特性，在高温下（70℃）下处理使得β-淀粉酶钝化而测定α-淀粉酶的酶活性。 酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的，淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定，由于麦芽糖能将后者还原生成硝基氨基水杨酸的显色基团，将其颜色的深浅与糖的含量成正比，故可求出麦芽糖的含量。常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性。实验中为了消除非酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。 在实验中要严格控制温度及时间，以减小误差。并且在酶的作用过程中，四支测定管及空白管不要混淆。 三、材料、试剂与仪器 实验材料： 萌发的小麦种子（芽长1厘米左右） 仪器： 722光栅分光光度计(编号990695)  DK-S24型电热恒温水浴锅(编号L-304056)  离心机(TDL-40B)  容量瓶：50ml×1，100ml×1 小台秤 研钵 具塞刻度试管：15ml×6 试管：8支 移液器 烧杯 试剂： ① 1%淀粉溶液（称取1克可溶性淀粉，加入80ml蒸馏水，加热熔解，冷却后定容至100ml）； ② pH5.6的柠檬缓冲液： A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L） B液（称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L） 取A液5.5ml、B液14.5ml混匀即为pH5.5柠檬酸缓冲液； ③ 3，5-二硝基水杨酸溶液（称取3，5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml 1M氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖保存）； ④ 麦芽糖液（称取0.100克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，小心移入100ml容量瓶中定容）； ⑤ 0.4M NaOH 四、实验步骤 1. 酶液的制备 称取2克萌发的小麦种子与研钵中，加少量石英砂，研磨至匀浆，转移到50ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，混匀后在室温下放置，每隔数分钟振荡一次，提取15-20分钟，于3500转/分离心20分钟，取上清液备用。 2.α-淀粉酶活性的测定 ① 取4支管，注明2支为对照管，另2支为测定管 ② 于每管中各加酶提取液液1ml，在70℃恒温水浴中（水浴温度的变化不应超过±0.5℃）准确加热15min，在此期间β-淀粉酶钝化，取出后迅速在冰浴中彻底冷却。 ③ 在试管中各加入1ml柠檬酸缓冲液 ④ 向两支对照管中各加入4ml 0.4M NaOH，以钝化酶的活性 ⑤ 将测定管和对照管置于40℃（±0.5℃）恒温水浴中准确保温15min再向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5min后取出，向两支测定管分别迅速加入4ml 0.4M NaOH,以终止酶的活性，然后准备下步糖的测定。 3. 两种淀粉酶总活性的测定 取上述酶液5ml于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度（稀释倍数视样品酶活性大小而定，一般为20倍）。混合均匀后，取4支管，注明2支为对照管，另2支为测定管，各管加入1ml稀释后的酶液及pH5.6柠檬酸缓冲液1ml，以下步骤重复α-淀粉酶测定的第④及第⑤的操作。 4. 麦芽糖的测定 ⑴标准曲线的制作 取15ml具塞试管7支，编号，分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml)0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0毫升，用蒸馏水补充至1.0ml，摇匀后再加入3，5-二硝基水杨酸1ml，摇匀，沸水浴中准确保温5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至15ml，摇匀后用分光光度计于520nm波长下比色，记录消光值，以消光值为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。 ⑵样品的测定 取15ml具塞试管8支，编号，分别加入步骤2和3中各管的溶液各1ml，再加入3，5-二硝基水杨酸1ml，摇匀，沸水浴中准确煮沸5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至15ml，摇匀后用分光光度计于520nm波长下比色，记录消光值，根据标准曲线进行结果计算。 五、数据整理及计算 麦芽糖标准液浓度mg/ml 0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.0   OD520                 项目 α(测) α(测) α(对) α(对) α+β(测) α+β(测) α+β(对) α+β(对) OD520                 平行组数据均值OD520         样品麦芽糖浓度mg/ml                           上表中前4行数据为实验的原始数据。以表中前两行数据绘制标准曲线（见下页），计算上表中第4行数据（各样品的OD值）均值，填入上第5行中，根据标准曲线的方程，计算第5行OD值所对应的麦芽糖浓度，填入最后一行，如上表。 根据以上的数据整理的结果，结合以下公式计算两种淀粉酶的活性： A——α-淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度 A’——α-淀粉酶对照管中的淀粉酶的浓度 B——(α-+β-)淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度 B’——(α-+β-)淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度 计算结果如下： α-淀粉酶活性=                （毫克麦芽糖?克-1鲜重?分钟-1） (α-+β-)淀粉酶活性=              （毫克麦芽糖?克-1鲜重?分钟-1） β-淀粉酶活性=              （毫克麦芽糖?克-1鲜重?分钟-1） 六、结果分析 七、思考题 1、酶活力测定实验的总体设计思路是什么？实验设计的关键你认为是什么？为什么？ 答：利用酶的专一性或酶活力的影响因素抑制除待测酶以外的其它酶活性，通过测酶促反应的产率推算酶活力大小。 关键在于抑制其它酶的活力而不影响测定酶，这样可以减小或避免其它酶产物给测定结果带来的误差。 2、本实验最易产生对结果有较大误差影响的操作是哪些步骤？为什么？怎样的操作策略可以尽量减少误差？ 答：①浸提步骤。70℃温度或15min时间控制不严格不准确则可能导致β淀粉酶未完全钝化使测得活性偏大。应严格控制温度和时间。②70℃水浴后需要立即冰浴，否则β淀粉酶复性使测得α淀粉酶活性结果偏大。③向测定管中加入NaOH时应迅速，否则酶与底物继续反应使结果偏大。 3、-淀粉酶活性测定时70℃水浴为何要严格保温15分钟？保温后为何要立即于冰浴中骤冷？ 答：由于-淀粉酶不耐热，在70℃下处理一定时间可以钝化，严格保温15分钟可以达到理想的钝化效果，时间过长，-淀粉酶活性也会受到影响；时间不足，-淀粉酶钝化不完全。保温后立即骤冷是为了通过剧烈的温变改变-淀粉酶的结构以防止在随后的反应中复性，这样就保证了在随后的40℃温浴的酶促反应中-淀粉酶不会再参与催化反应。此外我认为冰浴使酶迅速降温，便于严格控制高温处理时间的长短。 4、pH5.6柠檬酸缓冲液的作用？各管于40℃水浴准确保温15分钟的作用？ 答：酶实验体系的pH值变化或变化过大，会使酶活性下降甚至完全失活。加入pH5.6的缓冲液调至酶促反应的最适pH，同时稳定溶液的pH不至于在反应过程中大幅波动。 40℃水浴准确保温15分钟为调整酶促反应的最适温度 5、众多测定淀粉酶活力的实验设计中一般均采取钝化-淀粉酶的活力而测-淀粉酶和测总酶活力的策略，为何不采取钝化-淀粉酶活力去测-淀粉酶活力呢？这种设计思路说明什么？ 答：β淀粉酶与α淀粉酶的催化特性是有差异的。β淀粉酶主要作用于直链淀粉的α-1，4-糖苷键，而且仅从淀粉分子外围的非还原性末端开始，切断至α-1,6-键的前面反应就停止了；而α淀粉酶则无差别地作用于直链淀粉与支链淀粉的α-1，4-糖苷键，所以β淀粉酶需要α淀粉酶淀粉支链的α-1，4-糖苷键后才能完全体现其催化能力。 此外我认为在实验中温度比酸度更易控制，钝化α淀粉酶难度远远高于β淀粉酶，而且若提高酸度钝化α淀粉酶，则回调最适pH时α淀粉酶也有可能由于复性恢复活力。 这种设计思路说明在测定酶的比活力时要综合考虑各种可能出现的酶的性质以及它们之间的联系，也要考虑到实验操作的可行性。 6、本实验中所设置的对照管的作用？它与比色法测定物质含量实验中设置的空白管有何异同？本实验可否用对照管调分光光度计的100%T？为什么？ 答：消除非酶促反应（如淀粉酸性环境下加热水解）和非测定时间内的酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差。 两种都是为了消除非测定部分对光的吸收，空白组是为了消除溶液中溶剂等其它组分对光的吸收，而对照管是为了消除非测量所需反应所得的多余溶质对光的吸收。 不可，因为标准曲线的确定是在空白的基础上的，得到的是OD值与麦芽糖含量的关系 7、我们所测定得到的总酶活力减去所测定得到的-淀粉酶活力是否就等于-淀粉酶活力？为什么？你的结论说明什么？ 答：不等于。因为β淀粉酶和α淀粉酶作用于α-1,4糖苷键，但二者都不能水解支链的α-1，6-糖苷键，而我们所测定得到的总酶活力是二者在与R酶的共同作用下测得的酶活力，R酶能够降解支链淀粉，断裂α-1,6-糖苷键，从而增大了β淀粉酶和α淀粉酶可水解的底物浓度，使测得的总活力大于β淀粉酶和α淀粉酶单独作用的酶活力之和。 我的结论说明实验时要考虑各种酶协同作用的综合因素 七、参考文献 [1]生物化学实验指导  中国农业大学生物化学实验室  中国农业大学自编教材 [2]基础生物化学 赵武玲 中国农业大学出版社 [3] 岳海凤1 ,2 , 郜庆炉2 , 薛香2    小麦α-淀粉酶活性测定方法比较(1.河南农业大学, 河南郑州　450002 ; 2.河南科技学院, 河南新乡　453003) [4]百度百科  淀粉酶 [5]艾志录等  不同品种小麦发芽过程中淀粉酶活力变化规律的研究  中国粮油学报  2006年6月 第21卷第3期 [6]马永强等 玉米萌发过程中淀粉酶性质的研究  食品科学  294~297，    2007, Vol. 28, No. 11