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共显性RAPD标记的检测及应用

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共显性RAPD标记的检测及应用共显性RAPD标记的检测及应用 第 18 卷无 锡 轻 工 大 学 学 报V o l. 18 第 1 期1999 . 1JOU RNAL O F U W X IU N IV ER S IT Y OF L IGH T INDU ST RY N o 共显性 标记的检测及应用RA PD 李春丽 郑康乐 () ()无锡轻工大学, 无锡 214036中国水稻研究所, 杭州 310006 摘要 将 42 个 RA PD 标记应用于杂交稻组合的 F 2 群体的 108 个单株进行检测, 结果表明: 在 2 个座位分别有 2 对...
共显性RAPD标记的检测及应用
共显性RAPD标记的检测及应用 第 18 卷无 锡 轻 工 大 学 学 报V o l. 18 第 1 期1999 . 1JOU RNAL O F U W X IU N IV ER S IT Y OF L IGH T INDU ST RY N o 共显性 标记的检测及应用RA PD 李春丽 郑康乐 () ()无锡轻工大学, 无锡 214036中国水稻研究所, 杭州 310006 摘要 将 42 个 RA PD 标记应用于杂交稻组合的 F 2 群体的 108 个单株进行检测, 结果明: 在 2 个座位分别有 2 对标记呈共显性分离。 这种共显性的 标记 RA PD 可以快速、准确地确定 代植株的基因型。F 2 关键词随机扩增多态性 共显性; 杂交稻; DN A 分类号753Q 0 前言 近年来, 随着水稻基因组和人类基因组研究的不断深入, 分子标记技术发展迅猛。 各种 ( 分子标记如 、和相继出现。其中随机扩增多态性R FL PRA PD A FL P DN A R an dom A m p li2 1 ) 是等在 1990 年创立的遗传标记。 它是利用含 , f ied Po lym o rp h ic DN A sRA PD W illiam s ( ) ( ) ( ) 有 10 或 9个碱基的随机引物 单引物, 通过聚合酶链式反应 对 进行随PCR DN A 机扩增, 通过对扩增的某一 DN A 片段的有无来比较不同基因组 DN A 的差异。目前, RA PD 7 已广泛地应用于植物遗传育种的各个领域, 主要有: 品种或品系遗传纯度的测定, 品种间 或品系间遗传关系的测定; 遗传图谱的构建与补充; 在基因定位中的应用。标记由于RA PD 其样品用量少, 灵敏度高, 检测容易等具有 R FL P 所无法比拟的优点, 因而比 R FL P 更易于 2 应用。 但 的一个明显的不足就是显性标记, 不能在分离群体中区别纯合显性和杂 RA PD 合显性个体, 找到呈共显性的 标记将有效地克服这一缺点。 笔者以衍生于强优势杂 RA PD 交稻组合的 群体, 找到了 2 对共显性的 标记, 从而克服了 本身的不足, 将F 2 RA PD RA PD 分离群体中个体的基因型区分开。 1 材料与方法 1. 1 试验材料 以生产上广泛应用的杂交稻组合汕优 10 号的保持系珍汕 97和恢复系密阳 46 分别作 B () () 母本 和父本 , 配置组合, 构建 群体。 对亲本 和 , 以及在 群体中随机选 P 1 P 2 F 2 P 1 P 2 F 1 F 2 取 108 个个体进行 。RA PD 1. 2 试验方法 3 4 的提取参照卢扬江等的方法。反应参照陆军等的方法。DN A RA PD 收稿日期: 1998205222 第一作者: 李春丽, 女, 1971 年 9 月生, 农学硕士 2 实验结果 2. 1 标记检测亲本多态性、1 的鉴定RA PD F 用 400 个 10 碱基的随机引物扩增 2 个亲本珍汕 97和密阳 46, 其中有 330 个引物B 扩增出清晰可辨的带型, 有 148 个引物的扩增产物在珍汕 97和密阳 46 间表现多态, 多态B 性高达 44. 85% 。有 33 个引物具有 2 条甚至 3 条多态性带。这些扩增反应所产生的带数为 2, 11 条, 大小为 0. 2, 3 .k b () 笔者共用了 32 个在亲本间表现多态性的引物检测 , 均证实了 为真杂种 图 1。这F 1 F 1 32 个引物在 代的分离也证明该 为真杂种。F 2 F 1 1 为母本珍汕 97, 2 为父本密阳 46, 3 为 代. , 分别为引物 215, 203, 487, 419, 112, 174,B F 1 AJ R P R P R P R P R P R P 218, 188, 296, 603. 由于 为显性分子标记, 所以 代的带型包括了父母本的所有条带。1 R P R P R P R P RA PD F 图 1 验证 为真杂种F1 2. 2 标记在 代分离规律的研究RA PD F2 选择 32 个多态性引物扩增出的 42 条清晰可辨的多态性带, 用来检测 植株的基因 F2 2型。在这 32 个引物中, 其中 扩增出 3 条多态性带, 8 个引物扩增出两条多态性带。x 238 RP 分析结果表明: 在这 42 个标记中, 40 个标记的分离比符合 3?1, 只有 1 个标记显著偏离这 一比例, 1 个标记极显著地偏离这一分离比, 共占 4. 76% , 说明这一群体适用于做遗传分析。 2. 3 标记的连锁情况RA PD 应用 根据 标记计算出这些标记间的连锁。 设置最小3. 0 M apm ak e r V e r sio n RA PD 值为 3. 0, 最大图距单位为 50. 0 , 结果见图 2。L OD cM 21, 21822, 23821, = 106, 112, 174, 176, 188, 196, 203, 215, 218U n link ed R P R P R P R P R P R P R P R P R P R P R P 23822, 244, 25021, 261, 28922, 296, 299, 42021, 42022, 433, 456, 625, R P R P R P R P R P R P R P R P R P R P R P R P 63422, 694R P R P 图 2 应用计算 标记的连锁情况 3. 0 M apm aker Ver s ion RA PD 2. 4 共显性 RA PD 标记的检测 这 42 个标记中有 17 个标记被分成 6 个连锁群, 另外 25 个标记不与任何标记连锁, 这表明该 42 个标记代表了水稻基因组 31 个以上独立的座位。 这 42 个标记中, 有 2 对标记呈 完全共分离。其中一对标记来源于 ( ) 同 一引物 图 3, 另一对标 160 R P ( 记 来 源 于 22 和 图212300 R P R P ) 4 , 表 明 R P 21222 和 R P 300、 21 和 22 分 别 在 同 一160160R P R P 21 为母本 扩增的带型, 16022 为父本 扩增的带型, 具有1601 2 R P P R P P 座位或紧密连锁的不同座位上。利 21 和 22 则为杂合体 代所具有的带型。160160R P R P F 1 用这些呈共显性的标记可推导出 图 3 RP160- 1 和 RP160- 2 呈共显性遗传 ()植株的基因型 表 1 和表 2. F 2 R P 21222 为母本 P 1 扩增的带型, R P 300 为父本 P 扩增的带型, 具有 R P 21222 和 R P 300 则为杂合体 F 代所具有 2 1 的带型。 图 4 - 2 和 呈共显性遗传 212300 RPRP 表 1 - 1 和 - 2 的共分离160160RPRP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 植株号 16021- - - - - - - - - - - - - - - - - R P 16022- - - - - - - - - R P - - - - - 基因型H H H P 1 P 1 P 1 H H H H H P 1 H P 1 P 1 P 1 P 1 P 2 P 2 P 2 P 2 P 2 表 2 212- 2 和 的共分离 300 RPRP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 植株号 21222- - - - - - - - - - - - R P 300- - - - - - - - - - - R P 基因型H P 1 P 1 P 2 P 1 P 2 P 1 P 2 P 2 P 2 P 1 H H H H H H 3 讨论 ) 1引物在这 2 个亲本间扩增的多态性片段的比例很高, 为 45% , 但并不是所有 RA PD 的检测到多态性的引物都可检测群体的。由于 所用的引物较一般的 引物短, 有 RA PD PCR 时产生的多态性 电泳图谱比较复杂, 会给实验分析检测带来一定的困难。为了避免引 DN A ( )起实验误差或错误, 我们不使用这类引物。 同样在扩增的多态性片段比较大 大于 1时K b 或较弱时, 的重复性差, 在这种情况下不能区分出未扩增出是由于样品本身的差异RA PD 还是扩增反应不稳定造成的, 这样的引物也不适用于 群体的检测。F 2 ) 2扩增片段的多少除与基因组的特性有关外, 同时也受反应体系严谨程度的影 RA PD 2+ 2+ 响, 游离的浓度的高低是重要因素之一。笔者采用游离浓度为 1. 5 ƒ的反M gM gmm o lL 应体系, 平均每个引物扩增片段为 5. 06 条。 因此使用严谨度较高的 反应体系, 获取 RA PD 虽然量少但相对稳定可靠的多态性片段。 2 ( ) ) 3对 标记的卡平方 X 测验表明, 本研究中的 标记绝大部分符合 3? RA PD RA PD 1 的分离比率, 发生偏离的标记仅为 4. 76% , 这一方面是由于所用的群体为籼稻×籼稻, 基 因 在 群体中分布较随机, 由配子选择所 引 起 的 基 因 异 常 分 离 较 少。 另 一 方 面 也 缘 于F 2 RA PD 标记本身。 通常 R FL P 只能检测基因组单拷贝序列的座位, 而在单拷贝序列中许多 是基因序列, 它们在基因组中的分布是不随机的, 而 不仅能扩增单拷贝序列, 而且能 RA PD 扩增基因组中的重复序列, 其检测的座位分布相对随机, 所以 标记更能反映出基因RA PD 组的一般特征, 较少地受选择的影响。 ) 4笔者所用的群体在 32 个引物中发现了来自不同引物的一对标记呈共显性遗传, 而 另一引物本身所扩增的即是共显性标记。因此, 可通过筛选具有 2 条以上多态性带的共显性 标记, 利用这种呈共显性的引物来克服 本身的不足, 揭示更多的遗传信息。RA PD 参 考 文 献 1 , , , . W illiam s J G K A nne R Kube lik e t a lDN A po lym o rp h ism s am p lif ied by a rb it ra ry p r im e r s a re u sefu l a s gene t ic ( ) . , 1990, 18 22: 6531, 6535m a rk e r sN uc le ic A c id s R e sea rch , . . , 1992, 10: 186, 1912 W augh R Pow e ll W U sing RA PD m a rk e r s fo r c rop im p ro vem en tT ib tech ( ) 卢扬江, 郑康乐. 提取水稻 的一种简易方法. 中国水稻科学, 1992, 6 1: 47, 483 DN A ( ) 陆军, 钱惠荣. 利用 技术检测水稻的基因组变化. 科学通报, 1993, 38 23: 2181, 21824 RA PD ( ) 5 陈洪, 朱立煌. 标记构建水稻分子连锁图. 植物学报, 1995, 37 9: 677, 684RA PD 6 ( ) 遗传学报, 1998, 25 1: 34, 39 李春丽, 郑康乐. 应用 RA PD 标记检测与水稻株高和抽穗期有关的 Q TL s. ( ) 7 李春丽. 应用分子标记差异性预测作物杂种优势的研究进展. 遗传, 1997, 19 1: 46, 48 - D e tec t ion an d A pp l ica t ion of Codom inan t RA PD M a rker s L i C h u n li (), 214036W ux i U n ive r sity o f L igh t Indu st ryW ux i Zh en g K an g le (), , 310006D ep a r tm en t o f B io tech no lo gyC h ina N a t io na l R ice R e sea rch In st itu teH angzho u A bstra c t In th e p ap e rΚ th e F 2 pop u la t io n w a s de r ived f rom th e m a in ta in e r Zh en sh an 97B 46 10 an d th e re sto re r M iyan g o f h yb r id r ice com b in a t io n Sh an yo u w h ich is w ide ly p lan ted . ; Γin So u th e rn C h in aR an dom A m p lif ied Po lym o rp h ic DN A s RA PD w a s u sed to de tec t th e ΚΚ. po lym o rp h isim s am o n g P 1 P 2 F 1 an d F 2T h e po lym o rp h isim s b e tw een p a ren t s de tec ted 44. 9 . 40 42 w ith RA PD w a s p e rcen tT h e seg rega t io n s o f m a rk e r s am o n g th e su rveyed 3Π1 2. w e re in acco rdan ce w ith in th e F 2 pop u la t io nTw o p a ir s o f co dom in an t RA PD m a rk 2 Κ. 17 e r s w e re fo u n d w h ich w e re a t th e sam e lo cu s o r a t t igh t ly lin k ed lo c iT h e m a rk e r s a2 Κ 42 25 m o n g w e re dev ided in to six lin k age g ro up san d th e o th e r m a rk e r s w e re u n lin k ed .w ith o th e r s Μ2ΜKey word s RA PD co dom in an t h yb r id r ice ()责任编辑: 陈 娇
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