头孢西丁扩散法检测耐甲氧西林葡萄球菌异质性耐药菌株的评价

头孢西丁扩散法耐甲氧西林葡萄球菌异质性耐药菌株的评价 头孢西丁扩散法检测耐甲氧西林葡萄球菌 异质性耐药菌株的评价 中南大学(医学版) JCentSouthUniv(Medsci)l79 头孢西丁扩散法检测耐甲氧西林 葡萄球菌异质性耐药菌株的评价 陈颖,周建党,郭建军,许薇 (中南大学湘雅三医院检验科,长沙410013) [摘要]目的:评价头孢西丁扩散法检测耐甲氧西林葡萄球菌异质性耐药菌株的可靠性和临床实 用性.方法:将临床分离得到的葡萄球菌310株,按美国临床实验室化委员会(NCCLS)标准操作规 程进行苯唑西林纸片扩散法,头孢西丁纸片扩散法,苯唑西林琼脂稀释法实验,并以PCR检测葡萄球茵 mecA基因为判断标准,比较4种方法的敏感性及特异性.结果:经mecA基因检测,耐甲氧西林金黄色葡 萄球菌(MRSA)为57.1%(1l3/198),耐甲氧西林的凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)为62.5%(70/ ll2).头孢西丁纸片扩散法检测MRSA的敏感性和特异性均为100%,检测MRCNS敏感性为98.6%, 特异性为100%.结论:头孢西丁纸片扩散法操作简便,结果可靠,可作 为临床实验室检测耐甲氧西林 葡萄球菌的常规方法. 【关键词】头孢西丁纸片扩散法;耐甲氧西林葡萄球茵;异质性耐药 [中图分类号]Q93-332[文献标识码]A[文章编 号]1672-7347(2007)01.0179.04 CefoxitindiskdiffusiontestinthedetectionofMRS heterogenicdrug?resistantstrains jun,XUWei CHENYing,ZHOUJian—dang,GUOJian— (DepartmentofClinicalLaboratory,ThirdXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha41O013,China) Abstract:ObjectiveToevaluatethereliabilityandclinicalpracticabilityofcefoxitindisk diffusiontestinthedetectionofmethicillin—resistantstaphylococcus(MRS )heterogenicdrug—resistant strains.MethodsThreehundredandtenstrainsofstaphylococcusisolatedfromclinicsweredetec— tedbytheoxacillindiskdiffusiontest.thecefoxitindiskdiffusiontestaswellastheoxacillinagardi— lutiontestaccordingtothestandardoperationproceduresofNCCLS.andthedetectionofmecAgene ofstaph)lococcuswasusedas,acriterion.Thesensitivitiesandspecitivitiesof the4methodswere compared.ResultsBythedetectionofmecAgene,theratioforMRSAwas57.1%(113/198) andtheratioforMRCNSwas62.5%(70/ll2).Boththesensitivityandspecificityofcefoxitin diskdiffusiontestinthedetectionofMRSwere1O0%.andthoseinthedetectionofMRCNSwere 98.6%andl00%.ConclusionCefoxitindiskdiffusiontestisreliable.simpleandconvenient. anditcanbeusedasaconventionalmethodforthedetectionofMRSinclinicallaboratories. Keywords:cefoxitindiskdiffusiontest;methicillin—resistantstaphylococc us;heterogenic drug—resistance [JCentSouthUniv(MedSci),2007,32(1):0l79—04] 收稿日期(Date0freception)2005-11-09 作者简介(Biography)陈颖(1974-),女,湖南长沙人,主管技师,主要从 事临床微生物学研究. 通讯作者(ColTeSpolulin~author)陈颖,E-mail:eutey@163.com l8O中南大学(医学版),2007,32(1) 葡萄球菌是引起医院感染的常见病原菌,文 献报道葡萄球菌在阳性标本分离率中所占比例最 高…,其中耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin-resist- antstaphylococcus,MRS)有逐渐上升的趋势,并具 有多重耐药性.MRS耐药性的表达分为同质性和 异质性,大部分MRS菌株为异质性耐药菌株,苯 唑西林纸片扩散法,琼脂稀释法测最低抑菌浓度 (MIC)和MRS筛选试验都不能很好检测出异质性 耐药的菌株,mecA基因PCR检测被公认为是判 断MRS的”金标准”,但在临床实验室难以常规 开展.2004年版美国临床实验室标准化委员会 (NCCLS)推荐用头孢西丁纸片扩散法检测 MRS,我们将苯唑西林纸片扩散法,苯唑西林琼 脂稀释法和头孢西丁纸片扩散法与mecA基因的 PCR检测法进行比较,评价它们的可靠性和临床 应用价值,以寻找适合医院实验室检测MRS的简 单而可靠的方法. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌株湘雅三医院2004年3月至8月 临床分离葡萄球菌310株,其中金黄色葡萄球菌 198株,表皮葡萄球菌47株,腐生葡萄球菌36 株,溶血葡萄球菌29株,标准菌株为湖南省临检 中心提供的金黄色葡萄球菌ATCC25923. 1.1.2试剂头孢西丁(30g/片)和苯唑西 林(1g/片)纸片以及M-H琼脂均购自OXOID公 司;苯唑西林购自中诺药业有限公司;PCR扩增所 需试剂均为上海生工公司产品,上游引物 P1:5-TGGCTATCGTGTCAC从TCG-3,下游引物 P2:5-CTGGAACTYG1-rGAGCAGAG-3,扩增片段 为31Obp. 1.2方法 1.2.1纸片扩散法按NCCLS标准操作规程 进行,菌液制备采用孵育18,24h的单个菌落, 均匀涂布接种于M-H琼脂表面,然后将1fl,g苯唑 西林纸片及30g头孢西丁纸片贴于含菌琼脂表 面,置于35?培养箱中24h后观察结果,同时检 测各菌株对10,g苯唑西林纸片及3Og头孢西丁 纸片的敏感性,以ATCC25923为标准质控菌株, 判断标准根据NCCLS(2004年)制定的标准. 1.2.2琼脂稀释法苯唑西林琼脂稀释法按 NCCLS推荐的琼脂稀释法进行,菌液制备采用孵 育18,24h的单个菌落,接种于含有苯唑西林的 M.H琼脂平板上,其药物浓度是一组递减的浓度 (分别为8,4,2,1,0.5,0.25,0.125g/mL),然 后置于35?培养箱中24h后观察结果,以 ATCC25923为标准质控菌株,判断标准同上. 1.2.3mecA基因检测 1.2.3.1模板制备将液体培养基中适量的 指数生长期细菌(最多可达1×10CFU/mL),离 心后弃净上清液,用上海生工细菌基因组DNA抽 提试剂盒提取DNA作为PCR的模板. 1.2.3.2反应体系总体积25,其中含 10×PCR缓冲液2.5L,25mmol/LMg”2.5L, 10mmol/LdNTP0.5L,TaqDNA酶2.5U,25 pmol/L的引物1和引物2各1L,DNA模板5 L,无菌双蒸水7L. 1.2.3.3反应条件94?5min预变性,94? 30s,57?30s,72?100s循环30次,72?延伸 5rain.扩增时以ATCC25923作为阴性对照. 1.2.3.4结果判断5LPCR产物点人含EB 的2%琼脂糖凝胶,0.5×TBE为电泳缓冲液,用 水平式电泳槽稳压100V,电泳45min,凝胶成像 系统观察结果,成像. 2结果 2.1mecA基因检测结果临床分离的葡萄球 菌310株,经mecA基因检测,其中耐甲氧西林金 黄色葡萄球菌(MRSA)为57.1%(113/198),耐 甲氧西林的凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)为 62.5%(70/112).mecA基因检测结果见图1. 2.24种方法检测结果比较198株金黄色葡 萄球菌mecA基因阳性为113株,苯唑西林纸片扩 散法阳性112株,阳性检出率为99.1%(112/ 113),假阴性率为0.88%(1/113),头孢西丁纸 片扩散法,苯唑西林琼脂稀释法阳性率均为 100%(113/113);阴性检出率3种方法均为 100%(85/85)(表1).112株凝固酶阴性葡萄 球菌mecA基因阳性为7O株,苯唑西林纸片扩散 法阳性68株,阳性检出率为97.1%(68/70),假 阴性率为2.86%(2/70);头孢西丁纸片扩散法阳 性69株,阳性检出率为98.6%(69/70),假阴性 率为1.43%(1/70);苯唑西林琼脂稀释法阳性检 犯J埘illiq林埘蹦蛛蕾唾fl=埘曲株帕H价l? …率为IO0%(70,/70):堆呻旧竹纸片扩做法刚. 4l株,舱m半为976%(4I/42),似i一半 为238%lI/42),-J也_J|ir纸H’扣f法雄I 杯琼’g坫仃虹In敛 典验q,州标111~(-AH:m啦lIttq{,水拉r墩感旧 CNS林,Ji}i徘化I儿ir一业被感.--f谴址 IlI丁蚌l—.耐药n々M[iS.培养祭什听f’lSJIff日帆 t-求的球崖平?种楚牡『t时J耐约旧刑.;株 ItleJ.APl-呐ts.,翘IFl=fr纸m’敞池世}如 M.s,1Il般林{l!晰暂,返rlr能址IIIJIf 索弁监ll『IP)l)n0J.f’突坚.E奸址B—I呲 胺胁j立l达 他阿r抑蒲i住1j.,…IT.J逃彳】 rfl中?戈r#,町能垃又弛J’Jl…?2Ii技他 孙PBI卡?什们缩’谴…1l:4.ilJ 他眯雎_ll『选并jff订嫂的药物,世述控制?I 昕造I止n悠染.;fillJ[-捕,M时il『l减少抗1. 寮的/t】.减缓对19_lf雌类=l_屯I-采敞感性下降 耐药俪翱球l自々m 火孢丁比砖敞江撮n怔.『E率低蠊, 敏感r{:特r}:郇较雀limp:林纸J;扩;谈法商.址 临床椅0川in川山法,遁合J临床做,蜘 史骑Jt扦仨J’直川 图1mn{…犄洲纳I0 rI):I2I—I22 Zt[ANG.Iin-xiang.LIDai-qian.YIJi.n-w?-nlttlnnLii. 182中南大学(医学版),2007,32(1) [2] [3] [4] [5] [6] nalysisandcultivationresultsof3160bloodspecimen[J].J 122. 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