肠道病毒71型全基因组序列分析及VP1基因毒力位点的研究(可编辑)

肠道病毒71型全基因组序列分析及VP1基因毒力位点的研究(可编辑) 肠道病毒71型全基因组序列分析及VP1基因毒力位点 的研究 单位代码: 弓 分类号: 学 号:?雕了 密级: ?‖/?菇办誊 硕士学位论文 ?柄良 论文题目:勿道氟驾/型今冀团育; 叩,卷闯毒力,五乓、研衫 锄呦但兔如砰澌胁。叫‘于锄伽胁’’ 字 莎一必托?汐‖小叼中 一曲咄册 作者 姓 名习每荔. 学 院 名 称 ,分复彦够多陟 专业 名 称 卫谚检始葶 指导 教 师 至盔至垫亟 厶胙 口 导 师 予参?砼易殷搜 卜 加心年一月沙旧原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论 文不 包含任何其他个人或集体已经发或撰写过的科研成果。对本文 的研 究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本 声明 的法律责任由本人承担。 日 期: 竺:型 论文作者签名: 司望奎 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的,同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允 许论 文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或 部分 内容编入有关数据库进行检索,可以采用影、缩印或其他复制手 段 保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定 日飙蚋 论文作者签名:盟导师签名:目 录 中文摘要?.......? 英文摘要... 符号说明??.??..?.??..??..... 前言??. 刖舌??. 材料与方法?.....?.??........?....?. 一、材 料................................................. 二、方法......?....?..?................?..??.... 结果...?...?......?.... 一、病毒的分离鉴 定........................................ 二、基因组全序列扩增及分析........................... 三、基因扩增及序列分析............................ 四、单氨基酸位点突变对 蛋白引起的细胞损伤的影响....... 五、全长感染性克隆的构建?..?..??。.?.. 讨念??...?..?......................... 一、病毒的分离鉴定?............................?... 二、 基因组全序列的分析................................ 三、基因扩增及序列分析.?.四、单氨基酸位点突变对蛋白引起 的细胞损伤的影响......??. 五、全长感染性克隆的构建.....?.....??.?........ 结 论............................................................ 创新之 处............................?......................... 附录、附 图................................?..............?.. 参考文献.......?..........?.??.............?.......... 致谢......?.....?....................??....?. 攻读学位期间发表的学术论 文..................................... 学位论文评阅及答辩情况表.........?... :’ .................................................. ................................................................?.........................?.........?.............................................. .................................................................................................?. ......................................................................................: .?. ..........................??..........?..?.........?.?.?.............................. . ...........................。........................ ......。.。... ............................. ......................................... . ,...??.... . .?.??...?....??....??. .....?..??.?.?..?.....?.....?...?............?........?............?......?... ..??.?.. .......................................................................... .?......?.. . ............................?.,..? ? .?..??.?..?.?..?..?.?..?...??..?.?.?.??..??.??..?. ?......??...??.?.?...?.....?.?.....??....?...?...?.....?.?..?....?... .................................。........。。。....,... ...................。。....。.........。。。..。..。.........。..。 .......?,.....?.....?......?......?.................................,..............?................... .....?.......?....?.......?......?....?......?.......??..?...........?....?..??...?山东大学硕士学位论文 肠道病毒型基因组全序列分析及基因毒力位点研究 专业:卫生检验学 硕士生:司鲁莹 导师:王志玉教授 温红玲副教授 中文摘要 肠道病毒型 ,是、病毒科肠 道病毒属成员,是引起手足口病... , 的主要病原体之一。此外,还可侵犯呼吸系统、中枢神经系统及 心 血管系统而引起脑炎、心肌炎、肺水肿和弛缓性麻痹等症状。近 年来亚洲地区的 流行呈上升趋势。 目的 .扩增毒株基因组全序列,筛选神经毒力位点; .构建蛋白的表达载体及突变体,从基因上寻找可疑毒力位点, 比较突变前后其引起的细胞损伤的变化情况。 方法 .设计对首尾相接的引物扩增株.、、 基因组全序列,将此株毒株的基因组全序列与本实验室扩增的株 ?、 、及中的株临床类型叫确的 毒株的基因组全序列进行序列比对。 .设计引物扩增株毒株的基因并测序,以 .和 .软件对测序结果进行分析。 .设计引物扩增及株的基因,构建表达载体 .”及.”。将株?、 、和株?、 、的 序列进行比对,筛选出个可疑氨基酸位点、及,设计突变引物, 以.?为,同源重组法构建个单个氨基酸突变的表 达载体/、/、/。上述个表达载体转染 细胞后,染色、间接免疫荧光、 进行细胞病变程度的定山东大学 硕士学位论文 性检测,乳酸脱氢酶法细胞毒性检测法进行细胞病变程度的定量 检测。 .从已测知全序列的株毒株中,选取分离自死亡病例的株,采 用多种方法构建全长质粒,构建失败后合成全长质粒 ./,将全长质粒酶切线性化,进行体外转录制备 转录本,转录本转染细胞。 结果 .扩增出、及株的基因组全序列,将此株毒 、 株的基因组全序列与本实验室扩增的株?、 及中的株临床类型明确的毒株的基因组全序列进行序列比对, 共筛选出个有意义的位点,这三个位点分别为/、 /川和 / 。 / .扩增出株毒株的基因。将此株毒株的序列与各基因型代 表株的序列进行比对,发现此株分离株与、基因型同源性较 低;与亚型的群代表株的核苷酸和氨基酸同源性分别为.%.% 和.%.%,明显高于其他亚型代表株的同源性。 .构建了表达载体.、.及突变体 /、/、/。染色显示转染了种表 达载体的细胞均有不同程度的细胞损伤;问接免疫荧光显示转染 了种表达载体 的细胞均有亮绿色荧光信号产生: 显示转染了种表达载体的细 胞 均可表达的 蛋白,法细胞毒性检测结果显示 .川、/、/引起的细胞损伤程度最大 且基本相同,.川引起的细胞损伤程度最小,/引 起的细胞损伤程度介于中间。 .由于构建全长质粒失败,将其序列送公司合成全长 质粒.一,将其酶刀线性化,制备转录本转染 细胞。目自仃尚未观察到细胞病变,细胞培养物提取后鉴定也未 获 得相应片段。 结论 .全基因组序列比对筛选出个可能与神经毒力相关或与基因型相 关的山东大学硕士学位论文 / 位点,分别为位于的/、位于的 和位于 ? 。 的/ .株毒株的序列与各基因型代表株的序列进行比对,发现此 株分离株属亚型的群。 .蛋白的第位氨基酸基因组全序列第位氨基酸是可疑毒 力位点,?突变后其引起的细胞损伤程度降低。 关键词:肠道病毒型:毒力位点;基因山东大学硕士学位论文 ? : : : , ,, ,, , ., , , ,, .. ,. ., .? . , , .? 、 , 、, . . , ... ./ ./ , 山东大学硕士学位论文 . ? , , ? , , ,, . . , /,/,. . , , . .? . ,? ./ ../..? . .? ? , /‘./’. / / . . . . .%.%.%~。%. . .. ,.,/,// . . ,.山东大学硕士学位论文 . / ,.//,./ / , .../. .. , . / , ,/ . / . , .. , : ; ;山东大学硕士学位论文 符号说明 英文缩写 英文全称 中文名 肠道病毒型 核糖核酸 手足口病 , 柯萨奇病毒型非编码区开放阅读框架碱基对 致细胞病变效应 聚合酶链式反应 反转录一聚合酶链式反应 ? 人横纹肌肉瘤细胞 : 单克隆抗体 磷酸缓冲盐水 ?分离自重症病例的毒株 .分离自轻症病例的毒株互补 脱氧核苷三磷酸 溴化乙锭 三羟甲基氨基甲烷乙酸电泳缓冲液乙二胺四乙酸 ? 栖热水生菌聚合酶 免疫球蛋白 乳酸脱氢酶 山东大学硕士学位论文 肠道病毒型全基因组序列分析及基因毒力位点研究 专业:卫生检验学 硕士生:司鲁莹 导师:王志玉教授 温红玲副教授 刖 罱 .肠道病毒型病原学研究概况 肠道病毒,包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、致肠细胞 , 病变人孤儿病毒及新型肠道病毒共个血清型。肠道病毒型 是小?病毒科肠道病毒属的成员,基因组全长.,基因组中仅一个不 放读码框,型病毒基因组编码含个氨基酸的多聚蛋白,多聚蛋 白可进一步被水解成、、三个前体蛋白。蛋白可被蛋白酶切割为, ,矛,为组成病毒粒子的结构蛋白,而与贝被切割为有活性的 功能蛋白,负责病毒的复制与蛋白组装【。病毒颗粒为无包膜的球形 病毒,衣壳为正面体对称,由个相同的亚单位构成,每个亚单位均包含~ 四种结构蛋白,其中一暴露在病毒颗粒表面,因而抗原决定出主要 集中在一上【。 .肠道病毒型流行病学研究概况 臼年在美国首次被分离后,在世界各地都不断有报道【。在世界范 围内广泛分布,没有地域性。多流行于夏秋季节,但全年均可发生。可引 起手足口病、疱疹性?丙峡炎和严重的呼吸系统及神经系统并发症,该病 多发生于儿章,尤其是岁以下的婴幼儿,少数病情较重,严重的会引起死亡、】。 自年等首次报道以来,全世界很多国家和地区,如本、台湾【、 韩国【、新加坡‘、法国】、澳大利亚【】、马来西亚】均的流行, 且流行趋势逐年增加。其中有次大的流行:年保加利亚大流行,年马 来西亚大流行及年我国台湾地大流行】。近年来,在亚太 地区的流行有上升趋势,年的山东临沂及年的安徽、广东的大规 模流行,上万名婴幼儿感染,几十名婴幼儿死亡。现在,己取代脊髓灰质山东大学硕士学位论文 炎病毒成为最主要的中枢神经病毒病原。 基因组共编码种蛋白,其中蛋白是主要的衣壳蛋白,具有最多的 特异性中和表位,因此基因与病毒血清型具有较高的相关性,被用于型别鉴 定和基因进化分析‘】。年,等首次将戈分为、、基因型, 型间差异在.%~.%之间,各基因型内部的差异为%~%】。根据亲缘 性分析,又进一步将、、基因型划分为不同的亚型,基因型只有原 型株 株,、基因型又被分别戈分为~、一亚型。其中与基因组毒株 具有相同的进化来源,亲缘关系较近【 。目前我国的主要流行株属于亚型的 分支。 早期研究者受脊髓狄质炎病毒的启发,推测在的’序列中可 能存在神经毒力位点【。病毒的’折叠成特殊的空间结构,这种空间结构通 过与宿主细胞表面某些蛋白因子的结合,在病毒核酸合成的起始阶段以及蛋白翻 译过程中发挥重要作用,此外,还涉及宿主范围及毒力等多个方面的内容。 另有研究发现,如果减少脊髓灰质炎病毒基因组尾端的长度,病毒的感染 性会降低,提示病毒基因组尾端的长度与病毒的感染性可能有关。 ?】等报道,在同为基因亚型的分离株中,只表现手足口症状的分 离株与具有神经毒性的分离株的主要区别在于位氨基酸,可能正是这种不同 导致蛋白空问结构的改变,使得病毒与宿主细胞结合能力下降,进而使其毒 力发生改变。但等【】的研究表明,基因与疾病的严重程度无明 显关 联,的毒力位点并非单,一位点,可能受到多个位点的共同作用。 不;亚型的出现与分离的地区及时间有关。根据现有报道,年之 ,.,病毒兰要流行二美国和澳大利亚,之后在亚太地区流行。型的唯一成 员株是最早分离到的毒株年于美国加利福尼亚州?】。亚型流行于 ~ ~ 年,亚型流行于 年,从世纪年代起,报道的, 亚型感染很少,分离到的毒株只有//【】。亚型最早出现于年, 并于~年成为主要的流行亚型怛引。亚型最早出现于年,主要流行 于~年。种新亚型、、与、在同一时期出现共同 流行。矛亚型~年流行于东南亚,其中亚型为~年东南 亚的主要流行株?,但年以后再也没有分离到该亚型,亚型曾于年 山东大学硕士学位论文 在中国台湾和新加坡小规模流行。亚型仅流行于韩国,而亚型只流行于中 国和日本。和亚型年流行于中国台湾幽。 同一地区不同时间流行的常发生基因型转换。最早在美国发现的 。 为型,而~年在美国流行的主要为型,年后型开始流行【 ~年马来西亚主要为、、和亚型的混合感染,年则以 和亚型感染为主【。年在韩国、日本、新加坡等地的感染主要以亚型 为主,趋势是、基因型共存,之后基因型逐渐取代基因型,年又转为 以亚型为主【】。年上半年,越南南部分离到、、三种亚型,而下 半年时仅能检测到亚型【】。俐报道澳大利亚悉尼地区~年主 要为型,而该地区既往感染主要是型。年至今,中国大陆地区流行的 主要是,与其他国家和地区相比,基因型变化小。目前,对同一地区 频繁发生基因型转换的现象尚无确切解释。 的基因变异及重组可能导致新亚型的产生。病毒复制需要依赖 的聚合酶,这种聚合酶缺乏校正功能,突变频率高【。在同一地区 如存在两种或两种以上基因型病毒流行时,可能发生病毒的基因重组。基因重组 可以导致不同毒株问基因信息的直接转移或交换,且转移或交换后的重组病毒具 有较强的进化适应性,可能成为某一阶段的流行株【。年在马来西亚分离到 的基因型即为与的重组株【。年在台湾出现区重组的基 因型,并且该重组株年成为主要流行株【。中国大陆分离到的株和 株均为重组株,前者为基因型、/、的重组株;后者为 的亚型与/重组株【】。 .肠道病毒型感染的预防控制 由于目自仃缺乏有效的抗病毒药物,因此疫苗控制是阻断流行最为有效 的策略。曾经报道过的疫苗包括灭活疫苗【川、重组蛋白的疫苗 九和转基因疫苗‘等,保护效果都差强人意。将脊髓狄质炎病毒疫苗株的温度 敏感突变位点引入原型株的基因组而构建的减毒株感染猕猴后仅出 现轻度的神经系统症状。其后研究显示,接种了减毒株的猕猴血清对多个 基因型具有广谱的中和作用,是一种有前景的候选疫苗,但减毒效果仍需进一步 探索【。等【?用病毒样颗粒疫苗接种/小鼠后,小鼠体内 山东大学硕士学位论文 能产生高滴度的特异抗体,且发生脾细胞增殖及细胞因子的高度表达。接种 的母鼠生产的小鼠在倍感染剂量下,可获得.%的保护率, 不但可以产生相当广泛的免疫应答,而且更具安全性,因此有希望作 为疫苗候选,但是目前仍缺乏高效的提纯方法。多肽疫苗作为一 种新兴的候选疫 苗,可以刺激机体产生高效的特异性免疫应答,且具有方便、安全、稳定等特点, 【。北京科兴生物制品有限公司研发的减毒活疫苗期临床研究已完成, 先后对万余名婴幼儿进行了疫苗接种,完成了长达一年的流行病学保护效果观 察,研究结果表明该疫苗不仅安全,而且对受试儿童具有显著的保护效果。 为探讨序列变异对流行和毒力变化的影响及目前山东流行株的遗传学 背景,本研究分别从基因组全序列角度和蛋白角度寻找可疑的毒力位点, 为致病机制和神经毒力候选位点的研究提供参考。山东大学硕士学位论文 材料与方法 一、材料 一标本、毒株和细胞 .标本 ~年,在山东省临沂市人民医院无菌采集患拭子标本,做好登 记,于冷冻条件下专人专车带回实验室。 .毒株 毒株由本实验室分离,经稳定传代和超速离心纯化,测序鉴定后 保存。 二细胞培养实验材料 . /.: . . 。. .,以上试剂均为国产分析纯。 加双蒸水至 .胰酶:公司,批号:.。 ..%溶液:,上海虹光化工厂,分析纯。称耿. 加 。 去离子水至 ,高压蒸汽灭菌 .胎牛血清:天津灏洋生物科技有限公司,生产批号:。 力.链霉素溶于 .双抗青霉素、链霉素:将万青霉素和 液中,抽滤后备用。 .完全生长液、维持液、冻存液 。 / :公司,货号:? 生长液营养液血清.谷氨酰胺双抗贮存液 山东大学硕士学位论文 混匀,?保存。 维持液:配制同生长液,加入%血清。 冻存液:配制同生长液,加入%血清,另外含有%.甲基亚砜。 .培养箱:公司,型号:。 .倒置显微镜:公司,型号:。 .超纯水制造系统: 公司,型号:?。 三病毒总提取实验材料.提取试剂盒,公司,.... ,型号: .。 组成: 只 只 骊 凳 .无水乙醇:天津市富宇精细化工有限公司,分析纯。 ..巯基乙醇:公司,货号:。 .微型离心机: 公司,型号:。 .一?低温冷藏冰箱:公司产品,规格:一。 .生物安全柜:上海力申科学仪器有限公司,规格:.一。 四引物设计合成 .鉴定引物 《手足口病预防控制指南年版》】所推荐人肠道病毒包括 、核酸检测通用引物序列,产物 : :’一一’ :’..’ 《手足口病预防控制指南年版》所推荐的引物序列, 山东大学硕士学位论文 产物 : .:.’ .:.’ .全序列扩增引物:在保守区设计出首尾重叠的对覆盖整条病毒 核苷酸 的序列 表全序列扩增引物 .基因扩增引物: ..上游:’.一 一 一下游:’.. .基因表达用引物扩增 山东大学硕士学位论文 . . ?上游:丛 .下游:鱼?黝.’ 下划线为引入的酶切位点,斜体为起始密码子和终止密码子。 .定点突变引物见表。倦、/、/ 表 同源重组所用定点突变引物 引物名称 引物序列 ? ’. . ’. 、一 ? ’一一 . ’..’ ’..’ 一 .全长质粒构建用引物见表 表全长质粒构建用引物 引物名称 引物序列 /// ?. ’。 、 一? 一 一 一一 ’一一 ?. ’一 一 / 一. ’一. / 一 ’一。 五及实验材料 . 试剂盒,公司,货号:。 组成: ?山东大学硕士学位论文 ? /木/木 / 木用上游引物:’一.’ 术用下游引物:’.’. .试剂盒,公司。 货号:,组成: / × 各. /肛货号:,组成: . . / . 各. .斗 / . × 。 .扩增仪:德国公司产品,规格: 六琼脂糖凝胶电泳材料 .琼脂糖:上海生工生物科技有限公司,货号:,以×缓冲 液配制成%浓度。 .溴化乙锭:公司,工作浓度为. /。 .电泳缓冲液贮存液,值约.: 碱:北京公司,货号:。 冰醋酸:天津市富宇精细化工有限公司,分析纯。 ?:上海工硕公司,分析纯。 山东大学硕士学位论文 配制: 嘶碱 . . 冰醋酸 .加 纯水溶解,最后定容至 。 .上样缓冲液:公司,货号:。 .: , ,公司。、、、、、、、 、、、 、、、、、 .稳压稳流定时电泳仪:公司,规格:。 .紫外透射反射分析仪:上海康华生物仪器厂,规格:。 .多功能数字图像分析仪:公司,规格:。 七基因克隆材料 . 连接酶及连接缓冲液:公司,货号:。 酶贮存溶液: . / ?. . / . / 一 . / %; . / ?. . / . / . / .大肠杆菌菌种:本室保存。 .培养基 低盐液体及固体培养基 山东大学硕士学位论文 . 胰蛋白胨公司 . 酵母提取物公司 . 青岛化学试剂厂,分析纯 。在上述培养基中加入 琼 以调约.,双蒸水定容至 。 脂粉,即为固体培养基,高压蒸汽灭菌 液体及固体培养基 在液体培养基中加入氨苄青霉素终浓度为 /,即为液体 培养基。将加热溶解的固体培养基冷却至。以下迅速倒入加有青 霉素终 浓度为/的平皿,即配制成平板。 .琼脂粉:公司。货号: .氨苄青霉素:公司,货号:?.。将 氨苄青霉素加 入 无菌去离子水中配制成 /的溶液,抽滤后?保存备用。 。 .紫外可见分光光度计:尤尼柯仪器有限公司,型号: .恒温振荡器:华美生化仪器厂,型号:.。 .电热恒温干燥箱:上海阳光实验仪器有限公司,型号:.。,货号 .质粒小量提取试剂盒:公司,.... .。组成: 诧. 只 .限制性内切酶 、 核酸限制性内切酶 及附带的×缓冲液:大连宝生物工程有 限公司,批号:及。 ,货号: .凝胶回收试剂盒:公司,.... ?。组成: 山东大学硕士学位论文 只 只.感受态细菌制备和转化的实验材料 / 。 . :,北京红星化工厂,分析纯,批号: 将. 双蒸水中,高压蒸汽灭菌 ,。贮存。 溶于 恒温水浴锅:上海医疗器械三厂,规格:... 八转染及检测实验材料 .公司,货号:?。 .细胞培养孔、孔、孔、孔板:美国公司,货号:、 、和。 .盖玻片:无水乙醇处理,烤干后于培养板中待用。 .染液 贮备液 粉:公司,货号:。 纯甘油:天津市富宇精细化工有限公司,分析纯。 甲醇:天津市富宇精细化工有限公司,分析纯。 粉 纯甘油甲醇 将粉置于研钵中加少量甘油充分研磨至无颗粒的糊状。再将全部 油加入,。孵育 ,加入甲醇,保存于棕色瓶中。 工作液:现配现用,将贮备液与值.的磷酸缓冲液按照: 混合。 .问接免疫荧光显微镜镜检材料 一抗:鼠抗单克隆抗体,公司,货号:。 二抗:标记山羊抗鼠抗体,中杉金桥生物工程公司,货号: 山东大学硕士学位论文 么。 固定液:甲醇,天津市富宇精细化工有限公司,分析纯。 使用液为二者等体积混合液。 %.溶液:.,公司,货号:。 .以去离子水稀释至既为%.溶液。 , %封闭液:,公司,批号:。称取 溶解在 去离子水中,震荡溶解,。保存。 .细胞裂解液 :公司,批号 。将粉末溶解在异 丙醇中,配成 /浓度的贮存液,一。保存。 / ? .的配制: ./ . 去离子水 至. 细胞裂解液的配制:/ .. . . . 去离子水 至。 混匀,。保存。 ..聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹实验材料 / ? 分离胶缓冲液配制. .:在少量水中溶碱 . 。 ,加调.,加双蒸水至 /? 浓缩胶缓冲液配制. .:在少量水中溶碱. 。 ,加调.,加双蒸水至 %将 加双蒸水至 ,常温保存。 %丙烯酰胺/.%亚甲双丙烯酰胺? 将 丙烯酰胺和. 亚甲双丙烯酰胺溶于 双蒸水中,避光?保存。其中丙烯酰胺为国 产分析纯,亚甲双丙烯酰胺为公司产品。 双蒸水中,?可 %/过硫酸铵将. 过硫酸铵溶于 ,山东大学硕士学位论文 保存可使用周。过硫酸铵为国产分析纯。 蛋白上样缓冲液: . 浓缩胶缓冲液 % . . 巯基乙醇 甘油 . . %溴酚蓝 双蒸水 至. %分离胶的配制: . . /分离胶缓冲液 % . . . % . . 至. 双蒸水 %浓缩胶的配制: . . /分离胶缓冲液 % . . ? % .? . 至 . 双蒸水 电泳缓冲液.的配制: . . 甘氨酸 . 加单蒸水至 ,用完后可重复利用次。 转印缓冲液的配制: . 山东大学硕士学位论文 . 甘氨酸甲醇 加去离子水至 ,用完后可重复利用次。 垂直电泳槽:北京六一仪器厂生产,规格:.。 转印槽:上海六一仪器厂,规格:.。 硝酸纤维素膜:武汉博士德生物工程有限公司,货号:。 储存液: . . 浓 . 加双蒸水至 调至.。 洗涤液: 中加入. ..%,加双 蒸至 ,调至.。 。 封闭液:.脱脂奶粉中加至. 一抗:鼠抗单克隆抗体。 二抗:辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠,中杉金桥生物工 程公司,货号:。。 显色液:北京中杉令桥生物技术有限公司,货号:.。 .乳酸脱氢酶法细胞毒性检测实验材料 乳酸锉:公州,货号:。 硝基氯化四氮唑:圈药集团化学试剂有限公司,货号:. 吩嗪::甲酯硫酸盐:公司,货号:。 氧化型辅酶 :公司,货号:。 配制: 乳酸锂 . . . . / 现配现用,加. ?至 。 . 细胞凋亡检测实验材料:江苏碧云天生物技术有限公司, 山东大学硕士学位论文 货号:。试剂盒内容: . “.结合液 碘化丙啶染色液九转录本的制备材料 . 试剂盒: 公司,货号:。组成: , ? , “ / / . ? . . ....。 试剂盒:公司, 货号:?。组成: ? 个 】 个?二、方法 一病毒分离、鉴定 】.细胞传代培养 将长成致密单层的细胞的培养液倒掉。 山东大学硕士学位论文 用液洗涤细胞~次。 ,待细胞消化好之后将 加入. 胰酶,置培养箱消化~ 胰酶倒掉。 加入 培养液,将细胞吹打分散至单个细胞。 加入适量细胞培养液,分至个细胞瓶,置?%培养箱培养。 .病毒的接种及病变观察 将预处理后的标本接种至刚长满单层、形态良好的细胞上,同时 设置正 常细胞对照,置?%培养箱内培养,以倒置显微镜逐日观察正常细 胞 ,达到时收获,一 及细胞病变形态,当细胞病变效应 ?封口冻存。以下列符号表示其病变程度: 一 为无; 为%%的细胞出现; 为%%的细胞出现; 为%%的细胞出现; 为%%的细胞出现; 士 为可疑。 当达以上时收获病毒,即为阳性分离物;若连续传代仍无出现,, 取上 则判为阴性。将收获的阳性分离物反复冻融次后, 离心 日冻存备用。 .病毒的鉴定 病毒的提取 按照公司提取试剂盒说明书程序进行病毒提取,具体 步骤如下: ,. ?取? 和“的一巯基乙醇于 . 的离心管中混匀。 。 ?取?的阳性分离物上清加入上述离心管中,最大速混合 ?室温孵育~ ,短暂离心收集盖上的液体。 。 ?加 无水乙醇于样品中,最大速混合 ,弃掉滤液及收集管。 ?取?中混合液体“于柱子中, 离心 山东大学硕士学位论文 ?重复步骤?,直到上述溶解产物均入柱。 , ?加 ,弃掉滤液及收集管。 离心 , ?加 ,弃掉滤液及收集管。 离心 。 ?将柱子转入新的收集管中, 离心 离心管中,加 ,室温放 , ?将柱子转入. 提取的保存于一?冰箱。 离心 检测 将人肠道病毒核酸检测通用引物和核酸检测引物稀释至工作浓 度 /,采用的一步法试剂盒进行扩增,每次实验 要设立空白对照和细胞对照样品。 ?按试剂盒说明书配置 反应液:.“ . × .“ . 一 . . 一 . . . 将上述液体混匀。 反应条件为: ? ? .眦 .肌 ? 反反活 转转及 录录预 酶变 失陛 ? 如 ? 如 娩个 环 循 ? ? .眦 、?? ? ..、,、,.:.肌 终末延伸 山东大学硕士学位论文 琼脂糖凝胶电泳实验 以 产物上样,用 缓冲液配制%的琼脂糖凝胶,取“ 后,取出凝胶用染色~ ,紫外透 稳流电源进行电泳,电泳 射仪下观察电泳结果并用凝胶成像系统拍照分析。 基因组全序列扩增及分析 .将各分段扩增引物引物稀释至工作浓度 /,采用的 一步法试剂盒进行扩增。 ?按试剂盒说明书配置 反应液:. .’ . ’ . .. . 将上述液体混匀。 反应条件为: ?反转录 反转录酶失 ? 活及预变性 癌仪坝父任 ? 、 ? 个循环 ?? 终术延伸 .琼脂糖凝胶电泳实验 以 缓冲液配制%的琼脂糖凝胶,取 产物上样,用 稳流电源进行电泳,电泳 后,取出凝胶用染色~ ,紫外透 射仪下观察电泳结果并用凝胶成像系统拍照分析。 .产物凝胶回收山东大学硕士学位论文 采用公司凝胶回收试剂盒回收,具体步骤如下: 将段序列的产物上样电泳,用干净的手术刀在紫外投射反射分 析仪中迅速切割含目的片段的凝胶块,放入. 离心管中。 称量凝胶重量,按每 琼脂糖凝胶加入 结合缓冲液计算, 加入相应量的结合缓冲液。 ~?水浴直至凝胶溶化,期间每~ 振荡一次。 凝胶完全融化后,检查混合物颜色是否为亮黄色,若为橙色或紫 色则 /“,混匀。 应加入值.的 将混合液转移至 结合柱内,并将其放入收集管中, 。 室温离心 弃废液,将柱子放回同一 中,加入“ 洗涤柱子一次。 到柱中, 弃废液,将柱子放回同一收集管中,吸取“ 。 室温放置 后, 室温离心 重复上步骤一次。 以去除残留的 弃废液,将柱子放回收集管中, 室温离心 液体。 将柱子放入新的. 离心管中,向柱子的膜中央加?洗脱液, ?放置~ 后, 。管中液体即为回收的。 离心~ 取凝胶刚收液 电泳检测凝胶回收效果。 .序列测定及拼接 将述个回收片段送往上海博尚生物技术有限公司测序,将发回的 测序结 、 软件进行分析。 果进行拼接并以以 三基因扩增及序列分析 .基因扩增 将基因扩增引物稀释至工作浓度/,采用的 一步法试剂盒进行扩增。 反应液: ?按试剂盒说明书配置.“山东大学硕士学位论文 .肛 .“ .. . .. .斗. . 将上述液体混匀。 反应条件为: ?反转录 反转录酶失 ? 活及预变性 ? 、 ?个循环 ??终末延伸 .琼脂糖凝胶电泳实验 以 缓冲液配制%的琼脂糖凝胶,取?各产物点样,用~ 稳流电源进行电泳,电泳~ 后,取出凝胶用染色~ ,紫外 透射仪下观察电泳结果并用凝胶成像系统拍照。 . 产物凝胶回收 凝胶回收各产物,具体步骤见上。 .序列测定及分析 将上述各回收片段送往上海博尚生物技术有限公司测序,测序结 果以 、 软件进行分析。 四单位点突变对蛋白引起的细胞损伤的影响 .基因表达载体及突变体的构建 及株基因扩增 将基因表达用引物扩增稀释至工作浓度 /,采用的 一步法试剂盒进行扩增。山东大学硕士学位论文 反应液: ?按试剂盒说明书配置.“. . . . .“ 国 . . . .“ .“ 将上述液体混匀。 反应条件为: ?反转录 反转录酶失? 活及预变性 ? 、 ? 个循环 ??终末延伸 琼脂糖凝胶电泳实验 以×缓冲液配制%的琼脂糖凝胶,取“各产物点样,用 , ~ 稳流电源进行电泳,电泳 后,取出凝胶用染色~ 紫外透射仪下观察电泳结果并用凝胶成像系统拍照分析。 产物凝胶回收 凝胶回收两产物,具体步骤见上。 .基因表达载体的构建 基因片段及载体.双酶切 分别将 、株基因及载体.进行双酶切。 反应体系: 基因或. .“ . . 山东大学硕士学位论文 × . . ? . 总计 反应条件:混匀,?反应。 双酶切产物的凝胶回收及回收产物浓度测定 凝胶回收各酶切片段,具体步骤见上。 基因片段与.的连接 反应体系: .? .载体片段 基因片段 .“ . 连接酶 . 连接缓冲液 ? . 总计 . 。 反应条件:混匀,?反应 感受态细菌的制备 ?将接种在平板上,。培养过夜。 ?取单个菌落接种于 液体培养基中,。培养过夜。 ?取.~. 菌液加入到~ 的液体培养基中,。摇床培养~ ,此时细菌彳删在.~.之问细菌数约为× 个/。 ?取. 菌液于预冷的. 离心管中,冰浴 。。 。 /离心 ,弃上清,倒置 ?加入 / 。 悬浮细菌,冰上置 冰预冷的. ?? /离心 ,弃上清。 / 内用于转化。 ?加入“冰预冷的. 悬浮细菌,在~ 转化及阳性克隆的筛选 ?在感受态细菌中加入~“中的连接混合物,轻轻混匀,置冰上 ,每~ 摇晃一次,同时设个对照组:?阳性对照:已知的超螺旋闭 环质粒;?阴性对照:不加任何的感受态细菌。 。 ??热冲击~ ,迅速放回冰中~ 山东大学硕士学位论文 。 力 培养液,? /摇床培养 ~肛 ?将平板涂布“ /和 /,置。孵 ? 箱约 ,待液体完全吸收后取出。 ?观察菌落颜色,每个连接转化产物分别挑选若干株已长出的白 色饱满单菌 落接种于 培养液中,?振荡培养过夜。 碱裂解法提取质粒 将上述步骤中过夜培养的菌液提取质粒,具体步骤见上。 表达载体的双酶切鉴定 将上述提取的质粒分别进行双酶切以初步鉴定。 反应体系: 质粒.?.“.山. 总计 . 混匀后,。反应 。取?进行琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。 测序 根据琼脂糖凝胶电泳鉴定结果,阳性克隆送上海博尚生物技术有 限公司测 序, 与 测序无误后两表达载体分别命名为. .”。 .突变体/、、/的构建 .?单酶切 将提取的质粒.单酶切,回收后作为模板进行下一步的 扩增。反应体系如下: : . 质粒 / .. . . 总计. 山东大学硕士学位论文 : 质粒 .斗 .“ × . . 总计.“ 。 反应条件:。反应 凝胶回收单酶切产物 凝胶回收上述两单酶切片段,具体步骤见上。 扩增所需片段 以、分别作为模板,扩增得到带有同源末端的长度近似的两个产 物,如以.、 .分别作为上下游引物扩增突变体/的 一个片段,以.胁,.、.分别作为上下游引物扩增突变体 /的另一个片段。以同样的方法扩增其它两个突变体的两个片段, 其 中引物设计时包含了所需的突变位点。 扩增体系如下: . 模板或 . .儿 一国 ? .. . . . . . 总计 . 反应条件: 。预变性 ?? 弛 环 个循 ? .一 、厂 山东大学硕士学位论文 ? 终末延伸 转化及阳性克隆的筛选 在感受态细菌中加入成对的两段产物各~?,以上述方法进行转 化 及阳性克隆筛选。 碱裂解法提取质粒 将上述步骤中的菌液提取质粒,具体步骤见上。 突变体的双酶切鉴定 将上述提取的质粒分别进行双酶切以初步鉴定。 测序 根据琼脂糖凝胶电泳鉴定结果,阳性克隆送上海博尚生物技术有 限公司测 序,测序无误后三突变体分别命名为/、/及 /。 .表达载体及突变体细胞病变程度的定性检测 表达载体及突变体转染细胞 ?提取质粒 碱裂解法提取.”、.?、/、 /及/,具体步骤同上。紫外分光光度计法测核酸浓度 及纯度。 ?针对不同的细胞培养板转染用量如下: 细胞培养 每孔加入 每孔质粒 每孔培养 每孔 每孔 板 质粒的量 稀释液体 稀释液体积 川量 基总量 积 . .. . ..每次均设立.空质粒对照组,转染具体步骤同上述转 染。 染色 ?采用孔板进行转染,具体步骤见上。 ?转染~ 后,将孔中的液体吸干,每孔加入.~. 甲醇,室温固 定~ 。山东大学硕士学位论文 。 ?弃甲醇,干燥后加入应用液,室温染色 ?弃染色液,用蒸馏水洗涤干净后,于显微镜下观察、拍照,观察 细胞病变 情况。 间接免疫荧光 ?采用孔板进行转染,具体步骤见上。 ?转染 后,将细胞孔的液体吸干,每孔加入.~. 甲醇,室温固定 。 。 ?弃甲醇,干燥后每孔加入. %.,室温反应~ ?弃%.,洗涤 ,每孔滴加 %封闭液,室 温封闭~ 。轻甩,不干。 ?每孔滴加一抗:稀释鼠抗单克隆抗体“,置湿 盒~ 。回收一抗,洗涤~ 次。 , ?每孔滴加标记山羊抗鼠二抗 ,置。湿盒~ 洗涤~ 次。 ?荧光显微镜下镜检、拍照。 ?及免疫印迹 ?采用孔板进行转染,具体步骤见上。 . / ?样品处理:转染 后,将细胞孔的液体吸干,每孔加入. 的,室温消化 ,用吸管将细胞吹打下来,收集液体, /离心 , ,弃上清。每管. ,。放‘酣 裂解液及 离 心 , ,收集上清。每管上清中加入上样缓冲液弃,混匀,沸水浴 自然冷却。 ?灌胶:将玻璃板组装并用%琼脂糖封边。用吸管将刚配制的分离 胶灌注 左右, 至距阴极侧玻璃板顶端 处,加蒸馏水封在胶表面,聚合~ 至胶面出现一条整齐的折射线时,表示分离胶已经聚合。倾去蒸 馏水,用吸管从 左右,拔 边侧灌注刚配制的浓缩胶至玻璃板上端,插入加样梳,聚合~ 出梳子,加入电泳缓冲液,去除所有气泡。 ?上样:将样品加入上样孔中。上样包括个样品、低分子量蛋白标准、 .空质粒对照。 ?电泳: 稳压,直至低分子量蛋白标准各条带分不,约 左右。 山东大学硕士学位论文 ?转印:电泳结束后,将胶取出,切掉多余部分。按塑料板一滤纸一硝酸纤 维素膜光面朝向凝胶一胶一滤纸一海绵垫一塑料板的顺序组装膜,小心排去 其中的气泡,其中硝酸纤维素膜和滤纸均提前 用转印缓冲液浸泡。将塑料夹 。 板扣紧,按正确方向放入转印槽中,小心倒入转印缓冲液。 稳压电泳约 ?封闭:将膜放入装有 封闭液的盒中,室温振荡封闭 。倒掉封 。 闭液,用振荡洗涤膜次每次 ?一抗孵育:将膜放入装有 一抗鼠抗单克隆抗体,: 。 稀释的盒中,?过夜。回收一抗,用振荡洗涤膜次每次 ?二抗孵育:将膜放入装有 二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠, :稀释的盒中,室温振荡反应 。倒掉二抗,用振荡洗涤膜 。 次每次 ?显色:加入显色液,室温显色~ ,至出现棕色蛋白带。 晾干膜,扫描图象保存。 .表达载体及突变体细胞病变程度的定量检测??乳酸脱氢酶法细 胞毒性 检测 ?采用孔板进行转染,每样品设平行孔,具体步骤见上。 ?转染 后,将细胞孔的液体吸干,个样品组、.空质粒对 照组及自然释放组细胞对照组每孔加入新鲜的无血清培养液, 。 最大释放组每孑入%一 “,?%培养箱培养 ,吸取上清于另一新孔板中,每孔加入 ?将孔板离心/ 终止 肛新鲜配置的释放试剂,反应 后,每孔加入 反应。 ?将孔板于处测定么。 ?计算各组细胞毒性测得的各组均应减去背景空白对照孑幽 细胞毒性%各转染组一自然释放组彳/最大释放组一自然释放组 彳、× ?将个样品组、.空质粒组进行单因素方差分析,并进行两两 比较。 五全长感染性克隆的构建 .全长质粒的构建