五指山猪精液冷冻保存研究

五指山猪精液冷冻保存研究 五指山猪精液冷冻保存研究 第29卷第4期 2007年8月 江西农业大学 ActaAgricuhuraeUniversitatisJiangxiensis Vo1.29,No.4 Aug.,2007 文章编号:1000—2286(2007)04—0612—04 五指山猪精液冷冻保存研究 李玉芳,徐芹伟,张文昌,冯书堂h (1.北京畜牧兽医研究所,北京100094;2.黄淮学院农林科学系,河南驻马店463300;3.福建农林大学动物科 学学院,福建福州350001) 摘要:试验利用液氮熏蒸法进行颗粒冻精,以1组冷冻保护液为对照,2组,3组冷冻保护液以氨基酸代替部分 糖类物质,以解冻后的精子活力,活率和顶体完整性为判断标准,比较了4种冷冻保护液及不同冷冻一解冻程 序对五指山猪精液冷冻的影响.结果表明:解冻后精子2组,3组的3个判断标准均显着高于1组(P<0.05); 4组(2.5mLDMSO)冷冻保护液解冻精子的活力和活率显着低于2组(2mL甘油)和3组(1.25mLDMSO+ 1mL甘油)(P<0.05).精清保留量为0mL/10mL时解冻精子的活率和活力显着低于0.5mL/10mL和 1mL/10mL(P<0.05).干解法解冻后精子活率显着高于湿解法(P<0.05). 关键词:五指山猪;精液冷冻;活力;顶体完整性 中图分类号:$828.821.34文献标识码:A AStudyonCry0preserVati0nTechniquesforWISPSemen LIYu—fang,XUQin—wel一,ZHANGWen—chang,FENGShu—tang (1.BeijingInstituteofAnimalScience,Beijing100094,China;2.DepartmentofAgricutureandForest Science,HuanghuaiUniversity,Zhumadian463300,China;3.CollegeofAnimalScience,FAFU,Fuzhou 350001,China) Abstract:Inthisexperiment,semenpelletswerefrozenonthefluorineplant.Thespermmotility,viabil— ityandacrosomeintegritywerestudiedinthisexperimenttoselectabetterfreezingdiluentfrom4diluentsand freezing— thawingprotocols.Theresultswereasfollows:(1)Botheffectsofthegroup2andgroup3diluents withaminoacidweresignificantlybetterthanthatofthegroup1withoutaminoacid(P<0.05);thesperm motilityandviabilityofgroup4diluent(with2.5mLDMSO)afterfrozenweresignificantlylowerthanthose ofthegroup2(with2mLglycerin)andthegroup3(with1.25mLDMSO&ImLglycerin)diluents(P< 0.05).(2)Thespermmotilityandviabilitywith0mL/lOmLsemenplasmaweresignificantlylowerthan thoseoftheother2groupswith0.5mL/10mLand1mL/lOmLrespectively(P<0.05).(3)Theeffectsof driedthawingweresignificantlybetterthanthoseoutofthawinginsolution(P<0.05). Keywords:WZSP;semeneryopreservation;motility;acrosomeintegrity 动物的冷冻精液已经在农业,生物,医学以及物种保存等诸多领域广泛应用,包括 牛,羊等动物的冷 冻精液已经在生产和保种工作中发挥了很大作用.五指山猪(WZSP)已经被列为" 国家二级实验动 物",其近交体系具有遗传稳定性和基因高度纯合性,在器官移植和实验动物模型 等方面具有重大的利 用价值,因此该猪种的种资保存有着重要的社会效应和经济效应….本试验拟对精 液颗粒冷冻的条件 收稿日期:2006—12—21修回日期:2007—05—08 ? 项目基金:科技部"十五"中国实验用小型猪资源开发与研究应用项目 (2004BA717B)和北京市社会公益研究专项 (2003DEB6J078) 作者简介:李玉芳(1980一),女,硕士生,主要从事动物遗传育种与繁殖研究;通讯作 者:冯书堂,研究员. 第4期李玉芳等:五指山猪精液冷冻保存研究?613? 进一步探索,改进,使五指山猪精液长期保存得以实用. 1与方法 1.1冷冻保护液 共选用4种冷冻保护液, 对保护液均采用改进的配方, 其中1组冷冻保护液参照 Hammitt等,2组参照实验室 以往基础加以调整,3组,4组 在冷冻剂选择上加以调整,具 体成分见表1. 1.2精液采集和处理 本试验从五指山猪保种场 选择繁育能力正常,18月龄, 身体健壮的公猪(NO.321). 采用手握法采精,4层纱布 过滤.采精后进行常规检查, 并根据精液浓度用BTS稀释, 表14种冷冻保护液的配方 Tab.1The4kindsoffreezingdiluents 注:一表示不含此成分. 在37?下静置30min,而且每10min检查1次,最后取密度在1×10./mL以上,活率80%以上的精液 用于冷冻保存研究. 加入PBS液洗涤精液,10mL离心管800r/min离心3min,根据分组需要,分别保留1mL,0.5mL 和0mL的上清液,加入设计所需的冷冻保护液,用滴管重悬精子沉淀,混合均匀,置于4?冰箱中平衡 2.5h. 1.3冷冻与解冻 1.3.1冷冻程序试验前在冷冻槽内倒人1/3体积(深度3cm)的液氮,将氟板浸入液氮平衡3min 后,取出放在特制的冷冻架上(液氮上方3cm处),盖上槽盖平衡至一90,一110?之间(低温温度计 测定,UNTEC一111),进行滴冻,控制在30S内完成.滴冻结束,迅速盖上槽盖平衡3min,至颗粒迅速 冻结,顶部出现白色],将氟板投入液氮中,平衡5rain后,抽样进行解冻检查. 1.3.2解冻采用干解法与湿解法两种方法解冻,解冻温度均为45?.干解法:从液氮内随机取 出1粒冻精放人充分预热至45?的玻璃试管中并迅速在水浴内摇动试管,将要融解完全时迅速离开 水浴,借助余热融化.解冻结束后立即镜检.反复进行5次,并统计.湿解法:解冻液使用BTS,每个试 管0.5mL的BTS液预热致45?,液氮内随机取出1粒冻精放人试管中,水浴内快速摇动试管,将要融 解完全时迅速将试管离开水浴,借助余热使其完全融化.解冻结束后立即镜检.反 复进行5次,并统 计. 1.4精液品质的检查 1.4.1精子活率的测定取50L精液用1mLBTS稀释,37?下平衡20rain.然后取20L滴在 保温37?的血细胞计数板上,盖上盖玻片,在相差显微镜下(40X)观察中心和四角的5个视野,每次 检测200个精子并计算精子活率. 1.4.2精子活力的测定取鲜精50L滴于载玻片上,玻璃棒蘸取少量1%的伊红液,混合均匀,做涂 片.静置使其干燥后,在普通光学显微镜下(400X)计数200个精子,计算精子活力.红色为死精子, 活精子无色. 1.4.3顶体完整性的测定多聚甲醛溶解考马斯亮蓝G250,冷却后使用.取解冻精液50L滴于载 玻片上,盖上盖玻片.将考马斯亮蓝溶液滴于盖玻片一端,于吸水纸另一侧吸取,直至考马斯亮蓝均匀 地遍布于盖玻片下,静置染色10min,荧光显微镜(400X)观察顶体着色情况,顶体被染成蓝色者为顶 体完整,不着色者为顶体破损.每次计算精子数目为200. ? 614?江西农业大学第29卷 1.5数据处理 应用SAS软件中的ANERAGE和T—TEST对数据进行统计学. 2结果 2.1冷冻保护液的筛选 以第1组冷冻保护液为对照,2组,3组,4组冷冻保护液以氨基酸代替部分糖类物质.第2,3组解 冻后精子3个判断标准显着高于1组(P<0.05);而第4组(2.5mLDMSO)解冻精子的顶体完整性显 着高于第1组,但活力和活率均显着低于2组(2mL甘油)和3组(1.25mLDMSO+1mL甘油)(P< 0.05).推测由于第4组完全采用二甲基亚砜(DMSO)为冷冻保护剂,其分子量较小,可能对精子有更 大毒害作用],结果见表2. 表2冷冻保护液对精子的活力,活率和顶体完整率的影响 Tab.2Effectsoffreezingdiluentsonspermmotility-viabilityandacrosomeintegrity 注:a,b,c,P<0.05. 2.2精清保留量对精液冷冻的影响 使用第2组冷冻保护液进行试验,设置了3个组,在精液采集,离心处理后,每个离心管10mL精 液分别保留精清的体积分别为0mL,0.5mL,1mL.结果无精清(0mL)组的精液,解冻精子的活力和 活力均与精清保留量为0.5mL,1mL的组差异显着(P<0.05),说明精清内存在有利于精子存活的成 分,结果见表3. 表3精清保留量对精液冷冻的影响 Tab.3Effectsofsemenplasmaremnantsonsemencryopreservation 注:a,b,P<0.05. 2.3不同解冻方法对解冻效果的影响 干解法解冻后精子 活率显着高于湿解法 (P<0.05);干解法精 子活力和顶体完整性与 湿解法无显着性差异, 结果见表4. 3讨论 表4不同解冻方法对解冻效果的影响 Tab.4Effectsofthawingmethodsonthawingresult 注:a,b,P<0.05. 通常冷冻精液质量 的检查标准包括精子活力,活率等,顶体完整性也是精子质量的一项重要内容.顶体完整性对于解冻精 子进行人工授精,体外受精有重要意义.顶体内蛋白是发生顶体反应,帮助精子穿透卵母细胞的关 第4期李玉芳等:五指山猪精液冷冻保存研究?615? 键],在冷冻一解冻的过程中结晶与重结晶的形成会对顶体构成直接的危害. 本试验比较了几种常用的猪精液冷冻保护液的冷冻效果,发现甘氨酸替代部分糖类物质有利于提 高精液冷冻的效率.氨基酸在精液冷冻一解冻过程中对精子的保护作用早以引起的重视,人们已经发 现在羊精子的保护液中加人氨基酸能使精子内部结合比较松的络合物的损失大大降低,其效果比糖类 要好].同时,糖类也是保护剂的重要组成部分,它是一种重要的低温保护剂,同时也能够为精子提供 能量,低浓度的葡萄糖和乳糖混合使用其冷冻效果将大大提高?引. 本试验比较了不同精清保留量对精液冷冻效果的影响,结果表明精清在冷冻过程中的作用显着,与 Eriksson[4的结果一致.精清中含有糖类,氨基酸等营养物质和一定的激素,能够满足精液代谢的需要; 精液冷冻过程中保留一定量精清,在能够提供营养作用的同时,也改善了精液的pH值和渗透压环境 等. 本试验比较了两种解冻方法,结果表明冷冻精液采用干解法效果要好于湿解法.这也与李青旺 等n叫的实验结果一致.于解法可以避免溶液内部的受热不均而出现复凝现象.., 对精子造成伤害. 参考文献: [1]冯书堂,王雅春,王瑞云,等.中国五指山猪[M].北京:中国农业科技出版社,1999. 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