雕牌洗衣粉对泥鳅血清同工酶表达的影响

雕牌洗衣粉对泥鳅血清同工酶表达的影响 学生:来艳萍 指导老师:张晓红 张虎芳 (太原师范学院生物系021班 学号:2002131107 ) 摘要: 为探讨雕牌洗衣粉对泥鳅血清同工酶表达的影响～采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶,PAGE,电泳法研究了雕牌洗衣粉对泥鳅血清酯酶(EST)～过氧化物酶,POD,表达的影响。结果表明:在18.25 mg/L ～29 mg/L～39.75 mg/L和50.5mg/L四个处理组急性中毒下～与空白对照组相比～两种同工酶均有特异性酶带出现,各种酶活性也有显著变化。说明泥鳅血清同工酶标记用作环境生态毒理学指标具有可行性。 关键词: 雕牌洗衣粉,泥鳅,血清,同工酶,生态毒理学指标 1. 引言 随着各种洗涤剂的大量生产和使用极大地方便了人民的生活，但也带来了环境污染问题，造成了对人类或其他生物体的危害。其中人们最常用的洗衣粉其主要成份是烷基磺酸钠，一旦进入动物 [1][1][2][3]体，可能对动物体细胞内酶的表达有影响。早在70年代，Hope、薛京伦、丁恬等先后研究 [4]了烷基苯磺酸钠的毒性、致变性和致癌性;Momura研究了脂肪醇硫酸盐和直链苯磺酸盐对动物胚 [5][6]胎的致死效应;苏浣芬、贺维顺等运用小鼠骨髓细胞微核试验法检查洗衣粉，餐具洗涤剂的致突变性。 泥鳅隶属于鲤形总目，鲤形目，鳅科。具有较高的敏感性，有取材容易，室内易养活等优点。本文就雕牌洗衣粉对泥鳅血清同工酶表达的影响进行了研究，以探究应用泥鳅血清同工酶表达作为生态毒理学标记监测环境污染的可行性。 2. 与方法 2.1 材料 2.1.1 实验用鱼 供实验的泥鳅购自太原市花鸟虫鱼市场，体重约5.0?0.5g,体长8.0?2.0cm。实验前，将实验用泥鳅暂养在实验室经曝气的符合饮用的自来水中，实验时挑选健康的、体表无损、大小相近的个体进行染毒处理。 2.1.2 洗衣粉 雕牌洗衣粉 纳爱斯集团有限公司 2.2 方法 2.2.1 染毒 染毒试验在2升容器中进行，洗衣粉用经晾晒24小时的自来水配成浓度分别为18.25mg/L、 [7]29mg/L、39.75mg/L、50.5mg/L的溶液，以晾晒24小时的自来水作为对照组，每组放5条泥鳅，染毒24小时，试验期间不投饵。 1 2.2.2 取样 染毒24小时后，中止试验，取样。离心管内装8U/mL的肝素钠1mL,断尾取血法取血，每个试验组5条泥鳅，血取全部，装入离心管，摇匀，1500r/min离心10min,取上清液，按2:1的比例加入40%的甘油和0.1%的溴酚蓝指示剂，用于电泳。 2.2.3 电泳和染色 同工酶电泳采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳法，分离胶浓度为6%，浓缩胶浓度为 3;采用DYY-2C型稳压稳流电泳仪，DYCZ-24D型垂直板5%，电极缓冲液为Tris-甘氨酸，TG，pH=8. 电泳槽，均产自北京六一仪器厂;用50μL微量进样器点样，每孔点样量为20μL，点样后将电泳槽移至4?冰箱中进行电泳。电泳时，指示剂在浓缩胶内时用80,90V电压，当指示剂完全进入分离胶后，将电压升高到120V，总电泳时间为4小时。 [8][9、10]凝胶的制备参照文献，凝胶染色参照文献。 2.2.4 结果与酶谱分析 凝胶用7%的醋酸溶液脱色固定后，利用数码照相机观察、拍照，对凝胶测量后按酶带迁移率手工记录。各位点命名以各酶谱的相对R迁移率由小到大依次命名，即向阳极运动的酶谱带开始依次F 命名为1，2，3……，R=1/L，1为阴极端至各谱带中点的距离，L为阴极端至指示剂终点的距离。 f 3 结果 3.1 过氧化物酶(POD，E.C.3.1.1.1) 雕牌洗衣粉染毒后泥鳅血清过氧化物酶表达的电泳图谱如图1: ( 1:50.5mg/L组 2:39.75 mg/L组 3:29mg/L组 4:18.25mg/L组 5:对照组 )。在对照组5中，POD同工酶没有检测到活性，可能是POD同工酶不表达或酶活性低于检出值;在低浓度组4中，检测到POD-1一条主酶带，且活性较高，一条亚酶带，活性不强;在浓度组2和3中，分别检测到POD-1一条酶带，活性较低;在高浓度组1中，能同时检测到两条酶带，且两条酶带均为超显性表达。 POD-2 POD-1 1 2 3 4 5 图1 雕牌洗衣粉染毒泥鳅血清过氧化物酶表达的电泳图谱及模式图 Fig.1 Patterns of the influence of laundry powder on the expression of POD isozyme in blood of Misgurnus anguillicaudatus in the situation of acute toxicosis 表1 各浓度组POD同工酶的迁移率 Table1 Moving rate of group POD isoenzyme of every density 2 浓度 1 2 3 4 5 POD-1 X 1.25 1.25 1.25 1.25 — R 0.33 0.33 0.33 0.33 — f POD-2 X 0.7 — — 0.7 — R 0.19 — — 0.19 — f Fig.1 Patterns of the influence of laundry powder on the expression of POD isozyme in blood of Misgurnus anguillicaudatus in the situation of acute toxicosis 注:X 代表从分离胶到酶带的距离 Y代表从分离胶到指示剂的距离 R=X/Y Y=3.75 f 3.2 酯酶(EST，E.C.3.1.1.1) 雕牌洗衣粉染毒24小时后，泥鳅血清酯酶表达电泳图谱如图2所示:( 1:对照组 2:18.25mg/L 组 3:29mg/L组 4:39.75 mg/L组 5:50.5mg/L组)。对照组中，泥鳅表现为2条酶带EST-1 和EST-2，且两条酶带均为超显性;在低浓度组2中，也有两条酶带出现，与对照组相比，酶带活 性减弱;在浓度组3中，同时出现两条酶带EST-1和EST-2，较对照组活性都有减弱，以EST-1为 更弱;在39.75mg/L组，仅出现一条酶带EST-2，活性较强;在高浓度组5组，出现两条酶带EST-1 和EST-2，但活性进一步减弱。 EST-1 EST-2 1 2 3 4 5 图2 雕牌洗衣粉染毒泥鳅血清酯酶表达的电泳图谱及模式图 Fig.2 Patterns of the influence of laundry powder on the expression of EST isozyme in blood of Misgurnus anguillicaudatus in the situation of acute toxicosis 表2 各浓度组EST同工酶的迁移率 Table2 Moving rate of group EST isoenzyme of every density 浓度 1 2 3 4 5 EST-1 X 0.85 0.85 0.85 — 0.85 R 0.2 0.2 0.2 — 0.2 f EST-2 X 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 R 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31 f 3 注:X 代表从分离胶到酶带的距离 Y代表从分离胶到指示剂的距离 R=X/Y Y=4.25 f 4(讨论 4.1 雕牌洗衣粉对泥鳅血清同工酶表达的影响 当用不同浓度的洗衣粉溶液对泥鳅进行相同时间的急性染毒处理后，四个处理组的同工酶酶带显示出显著不同。 POD同工酶能利用HO氧化供氢体，它对HO要求专一而对供氢体要求广泛，能够反映生物体2222 [11]产生和消除自由基的能力以及细胞代谢的强度 ，在对照组中没有检测到POD酶活性，在处理组18.25mg/L、29 mg/L、39.75 mg/L中，均出现一条POD-1酶带，而在高浓度50.5mg/L组中，有POD-1，POD-2两条酶带表达，且活性显著增强。表明，随着洗衣粉浓度增大，血清POD同工酶的解毒功能显著增强。在正常生活环境，POD酶不表达或只有微弱表达，但在洗衣粉染毒处理后，该酶即表现复杂的表型和较强的酶活性，以强化解毒功能，是生物体中一种重要的保护性酶。 EST酶能水解大量非生理存在的酯类化合物，包括某些药物，因此认为具有解毒作用。对多种 [12]动植物来说，在环境毒物存在的情况下，EST酶的表达会有显著的变化，与对照组相比，各处理组EST酶带逐渐减弱，在39.75mg/L组中，EST-1消失。由此推测，当洗衣粉浓度较低时，EST有着重要的解毒作用，而当洗衣粉浓度较高时，EST酶逐渐丧失了有效的调节能力。 4.2 雕牌洗衣粉对泥鳅血清两种同工酶表达影响的比较 对比图1和图2可发现，雕牌洗衣粉在半致死浓度50.5mg/L组中，对两种酶的影响最大，酶带活性出现显著异常情况。在半致死浓度50.5mg/L组以下的各浓度中，随着浓度的升高，异常情况愈显著。相比之下，雕牌洗衣粉对POD酶表达的影响胜过对EST酶的。 4.3 泥鳅血清同工酶标记作为生态毒理学指标 在生态毒理学研究中，经常采用酶活力等作为生态毒理学指标，它能够对环境中的污染物产生灵敏变化，但是在实际环境污染检测时，如果根据酶活力值的变化来推断环境污染物存在与否，仍 [13，14]然缺乏一个通用的，而且温度、pH值等自然因素也会对酶活力值产生明显的影响。如果同工酶技术指示的一些具有特异性的酶带来定性地指示环境中的污染物，从方法上来说，更加简单有效。如在本试验中，POD酶在染毒后才表现出活性，在相当大的浓度范围内，毒性越强活性越强;EST酶随着浓度的增大，活性逐步减弱。因此，应用同工酶标记作为生态毒理学指标检测环境污染，具有深入研究的价值。但在实际应用时，必须考虑到某些因素的干扰作用，如动物的同工酶酶谱也 [15][16]随着个体发育产生变化，在患病状态下也会产生。 参考文献: 1 Hope J.Absence of chromosome damage in the bone marrow of rats fed detergent activies for 90 days.Mutat.Res,1977,56:47。 2 薛京伦。烷基苯磺酸钠和烷基磺酸钠诱变能力的测定及其在中国仓鼠细胞中抑制由丝裂霉素诱 发,,,频率的观察.复旦学报，1985，24(2):121。 3 丁恬等。合成洗涤剂潜在危害的研究I。山东医学院学报，1982，(2):7。 4 Nomura Tetal.Killing of preimplantation mouse embryos by ingredrents of cleaners AS and LAS .Mutat Res ，1987，190:25。 5 苏浣芬等。合成洗涤剂潜在危害的研究II。山东医学院学报，1982，(3):7。 4 6 贺维顺等。合成洗涤剂对人和哺乳动物的诱变性研究。动物学研究，1988，(1):7。 7 李媛等。洗衣粉对泥鳅血细胞微核遗传毒性的影响 8 周宗汉，林金榜，朱婉华。介绍鱼类组织中蛋白质及同工酶的电泳方法[J]。淡水渔业，1983， (2):35-40。 9 相建海。海洋动物细胞和种群生化遗传学[M]。济南:山东科学技术出版社，1999:70-80 10 王中仁。植物等位酶分析[M]。北京:科学技术出版社，1996，140-163。 11 罗曼，蒋立科，刘颖，站广琴，夏守芝。野生与养殖长吻鳜血液及不同器官同工酶的比较。应 用与环境生物学报，2000，6(5):447-451。 12 王兰，杨秀清，王茜，王定星。镉在河蟹5种组织器官的积累及对酯酶同工酶的影响。动物学 报，2001，47(专刊);96-100 。 13 宋连生，季延宾，蔡中华，方敏，苏建国，崔朝霞，李太武。 温度骤升对中华螯蟹(Eriocheir sinensis)几种免疫化学指示剂的影响。海洋与湖沼，2004，35(1):74-77 14 马广智，唐玫，徐军。低pH对草鱼鳃和肝组织超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响。中国水产 科学，2001，8(1):23-25。 15 李纯厚，钟振如，陈敏。斑节对虾个体发育早期的同工酶变化。水产学报，1994，18(1):62-64。 16 曾伯平，陈吕福，纪国晾。草鱼病理学研究 III 。草鱼出血病苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶相 对活性的变化。中山大学学报(自然科学版)，1995，34(1):76-80 。 The Effects of Laudry Powder on the Expression of Two Varieties Isozymes in Blood of Misgurnus anguillicaudatus Name:Lai Yan-ping (Department of Biology, Taiyuan Teachers College) Abstract The effects of laudry powder on the expression of two varieties of isozymes(EST and POD) in blood of Misgurnus anguillicaudatus were examined using SDS-polyarylamide gel electrophoresis. The results indicated that compared with the control group, two varieties of isozymes in four treatment groups with the concentration levels:18.25,29,39.75and50.5mg/L respectively appear particular expression patterns in the situation of acute toxicosis. Emzyme activity variations of two varieties of isozymes at four levels were significant. The effect of laudry powder on the expression of isozymes and feasibility of using isozymes as biomarkers of ecotoxicology were discussed. Key words Laudry powder; Misgurnus anguillicaudatus; Blood;Isozymes Ecotoxicology indicators 5