血红蛋白的提取和分离

血红蛋白的提取和分离 血红蛋白的提取和分离 ?课目标 1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白 2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理 3、体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤 ?课题重点 凝胶色谱法的原理和方法 ?课题难点 样品的预处理;色谱柱填料的处理和色谱柱的装填 1、基础知识――蛋白质提取和分离原理 蛋白质的 、大小、 、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取 和分离各种蛋白质。 提取和分离的方法: 、 1)凝胶色谱法(分配色谱法) ?原理:分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的 ，路程 ，流动 ;分子量小的分子穿过 ，路程 ，流动 。 多孔凝胶颗粒 ?凝胶材料: 化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 ?分离过程: 混合物上柱?洗脱?大分子流动快、小分子流动慢?收集大分子?收集小分子 , 洗脱:从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 注:相对分子量较大的蛋白质 流出，相对分子量较小的 流出。 ?缓冲溶液(洗脱剂) 组成:由酸和相应的强碱盐组成(如HCO,NaHCO，HC,NaC，NaHPO4/NaHPO等) 233224 配制:调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。 缓冲液作用:抵制外界、 对溶液pH的干扰，而保持pH稳定。 2)凝胶电泳法: ?原理:不同蛋白质的 不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不 同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 决定运动形成库形成决定运动 方向 仑力 阻力 速率 电荷 ? 性质 电荷? ? 量 分子? ? 形状 分子? ? 大小 ?分离方法: 、聚丙烯酰胺经胶电泳等。 ?分离过程:在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电;加入带负电荷多的SDS，形成 。 “蛋白质,SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于 2、实验设计(分离血红蛋白) 蛋白质的提取和分离一般分为: 、粗分离、 、纯度鉴定。 1)样品处理 有关本实验材料的知识 你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白,为什么, 血液。因为该细胞中 。 血液由 和 两部分组成。 血细胞中 细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是 。 该化合物是由 和 构成的，其中每条肽链中都含有一个能与O和CO结合的 基团。 22 ?洗涤红细胞 ?洗涤红细胞的目的是 ?红细胞的洗涤过程为: 血液，柠檬酸钠? 离心?吸出上层血浆?红细胞，5倍体积 ?缓慢搅拌? 离心?吸出上清液?反复洗涤直至上清液无黄色 注意加入柠檬酸钠有何目的,为什么要低速、短时离心,为什么要缓慢搅拌,洗涤次数不能过少, ?释放血红蛋白 思考:释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质, 为了加速释放过程，采取了什么, 目的分析: 1. 蒸馏水的作用是______________________________。 2. 加入甲苯的作用是____________________________。 3. 充分搅拌的目的是____________________________ ?分离血红蛋白 此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢,由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法: 红细胞 ( ) 混合液 脂类物质等 ( ) ( ) ( ) 滤纸过滤 高速离心 离心管 烧杯 分液漏斗 ?透析血红蛋白 目的: 思考:为何使用pH,7的磷酸缓冲液,为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量, 维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。 2)粗分离 通过以上四个基本过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子(如呼吸酶等)。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢,我们来研究蛋白质提取和分离的第二个步骤――粗分离(凝胶色谱操作)。 凝胶色谱分离蛋白质包括:制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。 ?制作色谱柱:准备材料?加工橡皮塞?安装色谱柱(了解一下) ?凝胶色谱柱的装填过程: ? 步骤 操作要求 ? 操作要求 色谱柱垂直固定在支架上 ? 计算称量凝胶 根据色谱柱体积计算凝胶用量 凝胶颗粒，蒸馏水?充分溶胀 ?配制悬浮液 ? ?凝胶颗粒，洗脱液?沸水浴 ?装填悬浮液 一次性缓慢倒入;轻轻敲打 ? ? 缓冲液洗涤平衡 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h，使凝胶装填紧密 注:步骤?中沸水浴加热，可加速凝胶膨胀，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除凝胶内的空气。 装填的凝胶要尽量紧密，降低凝胶颗粒之间的的空隙;还有装填凝胶柱时，不得有空气。都是因为(如 果装填不紧密，使本该进入凝胶内部的样品分子从空隙中或空气通过，)搅乱洗脱液的流动次序，影 响分离的效果。 ?样品加入和洗脱 基本过程是: 调节缓冲液面(打开下端流出口，使缓冲液下降到与凝胶面平齐后关闭出口)?加入蛋白质样品?调节缓冲液面(使缓冲液下降到与凝胶面平齐后关闭出口)?洗脱(色谱柱上端连接缓冲液洗脱瓶，打开下端流出口)?收集分装蛋白质 至此，血红蛋白即可得到粗分离。在整个操作过程中，应当注意以下事项: (1)红细胞的洗涤: 洗涤次数不能过少;低速、短时离心。 (2)凝胶的预处理: 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡 (3)色谱柱的装填: 装填尽量紧密，降低颗粒间隙;无气泡;洗脱液不能断流。 4)色谱柱成功标志:红色区带均匀一致地移动。 ( 跟踪练习 1 利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来( ) A.相对分子质量大的 B.溶解度高的 C.相对分子量小的 D.所代电荷多的 2 蛋白质提取和分离分为哪几步( ) A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳 B.样品处理、凝胶色谱操作、纯化 C.样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定 D.样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定 3用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质( ) A路程较长，移动速度较慢 B路程较长，移动速度较快 C路程较短，移动速度较慢 D路程较短，移动速度较快 4凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是( ) A. 糖类化合物 B. 脂质 C. 蛋白质 D. 核酸 5选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料，有何好处( ) A. 血红蛋白是有色蛋白 B. 红细胞无细胞核 C. 红细胞蛋白质含量高 D. 红细胞DNA含量高 6将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是( ) A. 甲苯 B. 血红蛋白水溶液 C. 脂溶性物质的沉淀层 D. 其他杂质的沉淀 7血红蛋白因含有( )而呈红色 A. O2 B. CO C. CO2 D.血红素 8下列操作正确的是( ) A. 分离红细胞时采用低速长时间离心 B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可 C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D. 透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h 9样品的加入和洗脱的叙述正确的是( ) A. 先加入1ml透析后的样品 B. 加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出 C. 如果红色带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功 D. 洗脱时可以用缓冲液也可以用清水 10下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是( ) A. 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液 B. 通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取 C. 可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化 D. 可通过SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度 11凝胶色谱法操作正确的是( ) A. 将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴 B. 将橡皮塞下部切出凹穴 C. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面 D. 将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片 12样品的加入和洗脱的操作不正确的是( ) A. 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 B. 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内 C. 等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 D. 用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面