从人源单链抗体库中筛出具有抗原结合活性的重链可变区和更小抗体片段

从人源单链抗体库中筛出具有抗原结合活性的重链可变区和更小抗体片段 ?分子与细胞免疫学? 从人源单链抗体库中筛出具有抗原结合活性的 ?重链可变区和更小抗体片段 胡志伟 段招军 朱建高 周国华 胡锦跃 孙去病 ()湖南医科大学肿瘤研究所免疫生物室 ,长沙 410078 中国图分类号 R730. 3 摘 要 目的 :用噬菌体呈现技术结合体外致敏法构建了人源单链抗体库 ,并用大肠癌相关抗原 CA2Hb3 筛选出抗大肠 癌噬菌体抗体克隆 EL5D 、EL6D 和 Ca12 ,测定 3 个克隆的核苷酸序列 ,并研究其免疫活性 。方法 : 采用抗体克隆扩增 、测序分 析 、免疫组化法测定活性 。结果 :抗体基因插入片段分别为 220 、500 、500 bp 。测序结果明 , EL6D 和 Ca12 属 VH52D2J H4 ,仅为VH 结构亚单位 ,而 EL5D 属 V的 J1 ,仅为 FR32CDR32FR4 结构 。三者均能与人结直肠癌细胞和组织反应 ,与其亲本鼠源单抗 κ κ Hb3 的结合特性一致 。3 个抗体克隆已列入国际基因库 ,序号为 AF0511652AF051167 。结论 : 短的人源抗体片段具有潜在临床 应用价值 。 关键词 人免疫球蛋白基因 单链抗体库 大肠癌靶向 重链可变区 互补决定区 VH and shorter fragments with antigen2binding activities biopanned from human repertoire single2cha in Fv libraries HU Zhi2Wei , DUAN Zhao2J un , ZHU J ian2Gao et al . L aboratory of Tumor Immunobiology , Cancer Research Institute , Hunan Medical University , Changsha 410078 Abstract Objective : Phage display technology is the best method for humanizing mouse2original monoclonal antibodies. Human reper2 toire single2chain Fv libraries had been constructed with phage display technology in combination of immunization in vitro ,and three phage ant2i ( ) body clones EL5D , EL6D and Ca12were biopanned with an colorectal2carcinoma associated antigen CA2Hb3. The object of this study is to de2 tect the sequence of these antibody clones and study immunological activity. Methods : The antibody sequences were stadied and it’s immuneactivities were detected by immunohistochemistry. Results : The inserts of EL5D , EL6D and Ca12 were of 220 ,500 and 500 bp ,respectively. The sequences of EL6D and Ca12 belonged to subgroup VH52D2J H4 and were just VH region. The sequence of EL5D ,however ,belonged to Vand κ just were Jl region containing partial FR32CDR32FR4 of kabba light chain. They could specifically bind with colorectal carcinoma cell lines and κ tissues ,which were identical with their parent mouse monoclonal antibody Hb3. The accession numbers of international genbank are AF0511652 AF051167. Conclusion : The shorter antibody fragments would have better clinical application. Key words Human immunoglobulin genes Single2chain Fv library Colorectal carcinoma targetting Variable region of heavy chain Complementarity determining region 近年来 ,我们用体外致敏法结合噬菌体表面呈 ,它们均与大肠癌组织反应 。测 隆经免疫组化鉴定 1 () 现技术构建了人源抗大肠癌单链抗体库,用固相 序结果显示 ,其中两个克隆仅为重链可变区 VH片 ( 抗原递减法经 3 轮筛选得到 90 个阳性克隆 。在噬 段 ,而第 3 个更短 ,仅为轻链可变区第三互补区 The ( 菌体 fUSE5 载 体 DNA 中 的 单 链 抗 体 Single2chain) third complementarity2determining region , CDR3。现报 ) variable fragments , scFv基 因 的 插 入 片 段 大 小 约 为道如下 。 5 0 0 和 2 2 0 bp 不 等 。挑 选A4 0 5 nm值 最 好 的 3 个 克 1 材料与方法 ()?本文受国家自然科学基金资助 39700054 1. 1 噬菌体抗体克隆的筛选和扩增 用 Hb3 抗体 作者简介 :胡志伟 ,男 ,27 岁 , 讲师 , 博士 , 主要研究肿瘤免疫学的免 亲和层析柱纯化的大肠癌抗原 CA2Hb3 包板的间接 疫诊断和抗肿瘤人源抗体库 ; EL ISA 筛出 90 个阳性克隆 ,其中 A405 nm 值最好的 孙去病 ,男 ,69 岁 , 教授 , 博士生导师 , 主要从事大肠癌和 EL5D 、EL6D 和 Ca12 3 个克隆 。挑取单菌落接种于 鼻咽癌的肿瘤免疫学研究 μ含 40 gΠml 四环素的 LB 培基中 ,37 ?,振摇过夜 ,离 2. 2 抗体片段的核苷酸序列分析 上述 3 个抗体 (心保留上清 含噬菌体颗粒 ,抗体片段表达于噬菌体 克隆的核苷酸序列和相应的氨基酸序列见图 2 , 其 2 ) μ衣壳蛋白 ?的 氨 基 端。取 2 l 上 清 作 模 板 用 中 EL6D 和 Ca12 两个克隆全长 384 个核苷酸 ,均为 重链可 变 区 序 列 , 属 VH52D2J H4 , 两 者 差 别 仅 在 第PCR 检查抗体基因在噬菌体 DNA 中插入片段大小 , ( ) ( ) PCR 引物及条件参照文献 3 。1 %琼脂糖凝胶电泳 177 位 A EL6D换成 C Ca12, 由此氨基酸残基由 () ( ) 检查 PCR 产物大小 。 Gln Q变为 His H; EL5D 全长 105 个核苷酸 ,属 Vκ κ 中 J1 序 列 , 仅 含 有 轻 链 部 分 FR32CDR32FR4 结 κ 1. 2 噬菌体抗体克隆测序的制备 将上述含 构 。3 个基因的 5′端 序 列 为 CTATT CTCACTCGGC2 EL5D 、EL6D 和 Ca12 噬菌体抗体克隆的 15 ml 上清 CGACGTGGCC ,3′端为 GGGGCCGCT GGGGCCGAAACT 分别用 PEGΠNaCl 沉淀纯化 ,溶于 1 ml HO 中 , PEGΠ 2 GTTGAA ,系载体 fUSE5 DNA 在插入片段两端的序列 NaCl 再沉淀一次 ,溶于 0 . 5 ml HO 中 ,酚 、氯仿分别 2 () ( ) 斜体及限制性内切酶 Sfi I 的识别位点 下划线,( 抽提一次 , 最后用酒精沉淀噬菌体单链 DNA ssD2 说明所测插入片段序列完整 。μμ) NA。ssDNA 溶 于 10 l HO 中 , 其 中 2 l 用 于 测2 2. 3 抗体片段结合抗原的活性 细胞免疫组化结 A260 nm 和 A280 nm 值 ,其余用于测序 。 果显示 ,VH 结构的 EL6D 和 Ca12 可结合人大肠癌 细胞 ,不与人白血病细胞和人宫颈癌细胞反应 ,但尚 噬 菌 体 抗 体 克 隆 测 序 1. 3 测 序 引 物 为 5′HO2 3 ,4与人 鼻 咽 癌 反 应 。大 肠 癌 免 疫 组 化 结 果 则 显 示 , GAATTTTCTGTATGAGGTTTTGCT2OH 3′, 插 入 片 EL5D 、EL6D 和 Ca12 均可与 Hb3 阳性的大肠癌组织 段距离该引物尚有 25 个核苷酸 。采用全自动荧光 反应 , 且与 Hb3 的结合部位一致 , 均为大肠癌细胞 () 测序仪 美国 Perkin Elmer 公司 ,377 型进行测序并 的胞浆 、胞膜以及腺腔内分泌物 。 5 从基因库的 BLASTN 中进行同源性分析。 1. 4 噬菌体抗体克隆结合抗原功能的鉴定 免疫 组化方法鉴定 3 个噬菌体抗体克隆 ,一抗为阳性噬 3 讨论 菌体克隆 ,二抗为 HRP2抗 M13 酶结合物 。癌细胞株 我们结合噬菌体呈现技术和体外致敏法成功地 ( 的免疫组化 : 癌细胞株为人大肠癌 HRT218 、HT229 、 构建抗大肠癌的人源单链抗体库 ,并用固相抗原递 ( ) ( ) Hce28693 、SW620、人鼻咽癌 HNE1、人白血病 HL2 减法筛得 90 个阳性抗体克隆 。本研究从中挑选吸 ) 60 、K562。大肠癌组织的免疫组化 :按常规处理 ,封 光度 值 较 高 的 3 个 克 隆 进 行 分 析 , 发 现 EL6D 和 Ca12 两个克隆只有 500 bp ,且核苷酸序列仅含 VH 片观察结果 。 序列 ,不含连接序列和 VL 序列 , EL5D 只有 220 bp 且仅有 V的部分 FR3 、CDR3 和 FR4 。VH 可以结合2 结果κ 抗 体 片 段 的 插 入 大 小 2. 1 EL5D 、EL6D 和 Ca12 3 ,4 ,6 抗原 已 有 报 道 。最 短 的 EL5D 有 结 合 抗 原 活 3 个克隆经 PCR 扩增 , 1 %琼脂糖凝胶电泳后显 示 性 。在此之前曾预测可结合抗原的最小识别单位 () EL5D 仅有约 220 bp ,后两者为 500 bp 图 1。7 () Minimal recognition unit ,MRU为一个 CDR。现在 我们偶然发现仅含 VFR3 、CDR3 和 FR4 的一个小抗κ 体分子 EL5D 确能结合抗原 , 从而在实验上证明了 该推测 。以前单纯 CDR 结构结合抗原的报道仅见 8 ,9 于按照鼠源单抗序列合成的多肽。具有抗原结 ( ) 合活 性 的 VH EL6D 、Ca12 甚 至 更 小 的 抗 体 分 子 ( ) EL5D可能比 scFv 更有应用前景 , Cai 等从人源抗 黑色素瘤单链 抗 体 库 中 筛 出 的 特 异 性 最 好 的 V86 3 ,4 也仅为 VH 结构。另外 ,J ang 等发现一个来自红 斑狼疮小鼠的 IgG 单抗的 VH 与含有 VL 的 scFv 分 10 子相比 ,有同等的与天然抗原结合能力 。上述研 图 1 PCR 扩增的噬菌体抗体克隆在载体 D NA 中插入片段 究提示 VH 结构亚单位本身能决定抗体的特异性 。 大小 此外在骆驼体内有一个天然产生的有功能的重链全 Fig. 1 Inserts of antibody genes in vector D NA of f USE5 ana2 11 lyzed by PCR 套抗体库,这种重链抗体由两个同样的由二硫键 图 2 抗大肠癌噬菌体抗体 EL5D( ?) 、EL6D( ?) 和 Ca12( ?) 克隆的核苷酸和氨基酸序列 Fig. 2 Sequences of nucleotides and a mino acids of the EL5D( ?) , EL6D( ?) and Ca12( ?) clones 4 Cai X H , Garen A. A melanoma2specific antibody heavy chain variable re2 相连的重链组成 ,每个重链有一个 VH、CH2 和 CH3 gion fragment from melanoma patients immunized with gentically modified 结构亚单位 。此研究提供了另外一个证据支持功能 () autologous tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA ,1996 ;93 13:6280 Altschul S F , Gish W ,Miller W et al . Basic alignment search tool . J Mol 5 性的重链 ,也许并不需要任何 VL 结构亚单位配对 。 Biol ,1990 ;215 :403 在 VL 的 FR1 和 CDR1 之间有一个 Sfi I 酶切位 6 Ward E S , Gussow D , Griffiths A D et al . Binding activities of a repertoire of immunoglobulins secreted from Escherichia coli . Nature ,1989 ;341 :544 点 ,因此将 scFv 克隆入 fUSE5 载体时 ,用 Sfi I 酶切就Rodwell J D. Engeering monoclonal antibody. Nature ,1989 ;342 :99 7 Taub R , Gould R J , Garsky V M et al . A monclonal antibody against the 8 可以将 VL 的大部分切除 ,从而只剩下完整的 VH 或platelet fibrinogen receptor contains a sequence that mimics a receptor 4 VL 的 CDR3。() recognition domain in fibrinogen. J Bio Chem ,1989 ;264 1:259 Wiliams W V ,Moss D A , Kieber2Emmons T et al . Development of bio2 9 4 参考文献 logically active peptides based on antibody structure . Proc Natl Acad Sci USA ,1989 ;86 :553 1 胡志伟 ,孙去病. 大肠癌相关抗原体外致敏法构建人源抗体库. 中 10 Jang YJ ,Lecerf J M ,Stoller B D. Heavy chain dominance in the binding () 国肿瘤生物治疗杂志 ,1997 ;4 2:130 og DNA by a lupus mouse monoclonal autoantibody. Mol Immunol ,1996 ; 2 Scott J K , Smith G P. Searching for peptide ligands with an epitope li2 33 :197 brary. Science ,1990 ;249 :386 2Casternan C ,Atarhouch T ,Bendanhman N et al . Naturally oc2 11 Hammers3 Cai X H , Garen A. Anti2melanoma antibodies from melanoma patients im2 curring antibodies devoid of light chains. Nature ,1993 ;363 :446 munized with genetically modified autologous tumor cells : Selection of spe2 cific antibodies from single2chain Fv fusion phage libraries. Proc Natl 〔收稿 1997211206 修回 1998205211〕 () Acad Sci USA ,1995 ;92 14:6537 () 编辑 李 实