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STAMP2变异与新疆维族人原发性高血压相关性研究

2017-09-01 50页 doc 95KB 23阅读

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STAMP2变异与新疆维族人原发性高血压相关性研究STAMP2变异与新疆维族人原发性高血压相关性研究 新疆医科大学 硕士学位论文 STAMP2变异与新疆维族人原发性高血压相关性研究 姓名:毕云伟 申请学位级别:硕士 专业:内科学 指导教师:李南方 2011-04 新疆医科大学硕士学位论文 STAMP2 基因多态性与新疆维吾尔族人原发性高血压相 关性研究 研究生:毕云伟 导师:李南方 教授/主任医师 摘 要 目的: 本研究对新疆和田地区维吾尔族人群进行了高血压流行病学调查,在该人 群中对前列腺六次跨膜蛋白 2 (STAMP2)基因与高血压的关联性进...
STAMP2变异与新疆维族人原发性高血压相关性研究
STAMP2变异与新疆维族人原发性高血压相关性研究 新疆医科大学 硕士学位论文 STAMP2变异与新疆维族人原发性高血压相关性研究 姓名:毕云伟 申请学位级别:硕士 专业:内科学 指导教师:李南方 2011-04 新疆医科大学硕士学位论文 STAMP2 基因多态性与新疆维吾尔族人原发性高血压相 关性研究 研究生:毕云伟 导师:李南方 教授/主任医师 摘 要 目的: 本研究对新疆和田地区维吾尔族人群进行了高血压流行病学调查,在该人 群中对前列腺六次跨膜蛋白 2 (STAMP2)基因与高血压的关联性进行分析,探讨 STAMP2 基因功能区多态位点与新疆维吾尔族人原发性高血压相关性。方法: 采用以 流行病学调查为基础的病例-对照研究,选取2047 例维吾尔族人(包括810 例高血压 患者和1237 例对照)作为研究对象。首先在小样本维吾尔族高血压患者中测序筛查 STAMP2 基因功能区的变异位点,选取代表性变异位点应用 TaqMan-PCR 在大样本 人群中进行基因型鉴定及病例-对照关联研究,来探讨单个变异位点及其构成的单倍 型与原发性高血压的相关性。结果: 选取的STAMP2 基因的功能区共发现14 个新的 和6 个已知的变异位点,其中包括2 个错义突变。STAMP2 基因的3 个代表性变异 位点 rs8122 ,rs1981529 及 rs34741656 基因型及等位基因分布在高血压组与对照组 中差异无统计学意义(P 0.05 )。使用Logistic 回归分析模型校正年龄、性别、体重、 吸烟及饮酒之后, 分析发现三位点不是高血压患病的危险因素(P 0.05 )。进一步 方差分析发现rs8122, rs1981529 及rs34741656 不同基因型间收缩压、 舒张压水平差 异无统计学意义 (P 0.05 )。单倍型基因频率分布在高血压组与对照组中 差异无统 计学意义 (P 0.05 )。结论: STAMP2 基因三个代表性 SNP rs8122, rs1981529 及 rs34741656 可能与新疆维吾尔族人原发性高血压无关。 关键词 :STAMP2;遗传多态性;维吾尔族;原发性高血压 1 新疆医科大学硕士学位论文 Association study of the genetic polymorphisms of the STAMP2 gene and essential hypertension in Uygur Xinjiang population Postgraduate: Bi Yunwei Supervisor: Prof. Li Nanfang Abstract Objective : The epidemiological investigation was performed in the Hetian Area to report the epidemiological characteristics of essential hypertension in men in Uygur Xinjiang population. To investigate the relationship between the genetic polymorphisms of the STAMP2 gene and essential hypertension in Uygur Xinjiang population. Methods : The sequences of STAMP2 gene functional region were sequenced in Uygur Xinjiang population with hypertension. 14 novel and 6 known single nucleotide polymorphisms SNP , including 3 onosynonymous SNP, in the STAMP2 gene were identified. The representative variations selected were genotyped by TaqMan-PCR method in 2047 Uygur individuals, including 810 hypertensive patients and 1237 normotrnsive subjects. The association between genetic variations of STAMP2 and hypertensive in Uygur was analyzed. Results : In the three representative variations genotyped, rs8122, rs1981529 and rs34741656, the essential hypertension and control groups were no significant differences of genotype distribution and allele frequencies between hypertensive and control subjects in three polymorphisms (P 0.05 ). There were no significant alteration of risk in hypertensive, with adjusting for age and gender in a logistic regression analysis (P 0.05 ). In ANCOVA analysis, neither polymorphism was significantly difference associated with systolic blood pressure and diastolic blood pressure (P 0.05 ). There were no significant differences of haplotype frequencies between hypertensive and control subjects (P 0.05 ). Conclusion: There are no associatio n of the three polymorphisms rs8122, rs1981529 and rs34741656 with essential hypertension in Xinjiang Uyghur population. Key words : STAMP2; genetic polymorphism; Uyghur; essential hypertension 2 中英文缩略词对照表 英文缩写 英文全名 中文译名 EH Essential hypertension 原发性高血压 SBP Systolic Blood Pressure 收缩压 DBP Diastolic Blood Pressure 舒张压 six transmembrane epithelial antigen of 前列腺六 次跨膜上皮抗原 STAMP2 prostate 2 2 DNA Deoxyribonuelei acid 脱氧核糖核酸 dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate 脱氧核糖三核苷酸 PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应 LD Linkage Disequilibrium 连锁不平衡 SNP Single Nucleotide Polymorphism 单核苷酸多态性 TagSNP Tagging SNP 标签SNP MAF Minor Allele Frequency 最小等位基因频率 HapMap Haplotype Map projeet 人类单体型图计划 5’-UTR 5"-Untranslated Region 5’非翻译区 3’-UTR 3"-Untranslated Region 3‘非翻译区 BMI Body Mass Index 体重指数 SPSS Statistical package for social science 社会科学统计软件包 HWE Hardy-Weinberg Equilibrium Hardy-Weinberg平衡 EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸 EB Ethidium bromide 溴乙锭 AHA American Heart Association 美国心脏学会 SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠 论文独创性说明 本人申明所呈交的学位论文是在我个人在导师的指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地 方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示 了谢意。 学位论文作者签名: 签字 日期: 导师签名: 签字日期: 关于论文使用授权的说明 本人完全了解学校关于保留、使用学位论文的各项规定, (选择“同意/不同意”)以下事项: 1.学校有权保留本论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅, 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文; 2.学校有权将本人的学位论文提交至清华大学“中国学术期刊 光盘 版 电子杂志社”用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》或其他同 类数据库,传播本学位论文的全部或部分内容。 学位论文作者签名: 签字日期: 导师签名: 签字日期: 新疆医科大学硕士学位论文 前言 原发性高血压 essential hypertension,EH 是一种危害人类健康的疾病之一,近年 来发现我国高血压患病率增高且有年轻化趋势,并且高血压致死率不断上升,成为 心血管疾病致死和致残的疾病之一。据 WHO 显示,欧美国家成年人高血压患 病率在 20% 以上,我国监测结果则显示,多数地区高血压的患病率呈上升趋势,赵 金花调查研究显示高血压的患病率为29.8%[1] 。以有的研究表明高血压的患病率存在 [2,3] 明显的地区和民族差异,维吾尔族是新疆最主要的少数民族之一 。高血压是一种 [4,5] 最严重的心血管独立危险因素 ,探索和确定原发性高血压的易感基因是十分重要 的。在过去的几十年间,人们对高血压的发病机制进行了大量的研究,从不同的方 面来探索发病的机制。研究认为高血压是一种遗传因素和环境因素共同作用引起的 [6,7] 一种复杂性的疾病 ,高血压遗传机制的研究成为近期人们关注的热点。大量动物 试验和体外实验研究证实了遗传因素在高血压发病机制中发挥重要作用,遗传因素 对血压变异的作用占30-50%[8- 12] 因此,在寻找EH 发病的相关基因,探讨血压升高 的遗传机制,不仅能使我们更好的理解高血压发生的病理生理机制,而且能指导我 们对EH 进行早期诊断、早期治疗和早期预防 [13-16] 。。大量实验研究已证实 EH 是一 种多基因遗传性疾病,如果某一个基因编码的蛋白质参与了血压的调节机制,那么 [17] 该基因就可能作为EH 的侯选基因 。但是EH 的发生不是一种基因的改变所能导致, 也不是一种基因单一位点的变异,或者是每一种基因其变异部位在功能区所能导致 的,只有找到在EH 发生中起关键作用的候选基因,EH 的治疗才会有根本性的突破。 迄今为止,已经研究了一系列与血压调控有关的基因,涉及肾素-血管紧张素-醛固酮 系统的位点、上皮钠通道的位点、儿茶酚胺/ 肾上腺素的功能位点、脂蛋白代谢、激 素受体或生长因子基因位点等,这些基因结构或表达异常可导致高血压。目 前已有 不同的人群中证实了与高血压疾病相关的多个基因,如血管紧张素原基因[18-21] 、血 [22-24] [25-27] [28-30] 管紧张素转化酶基因 、WNK 基因 、上皮细胞钠通道基因 、胰岛素受体 基因[31,32]等至少150种基因,到目前为止还没有一个基因及其变异被肯定与EH 相关, 决定病变的基因可能只有少数几种或几十种,因此必须找到与疾病发生相关的并起 关键作用的候选基因。 新近发现前列腺六次跨膜蛋白 2 six-transmembrane protein of prostate 2 , STAMP2 可能是EH 的候选基因,它们在脂肪组织中高度表达并与TNF-a 、IL-6 的 表达和信号传导密切相关,这些基因的表达或受TNF-a 等的调节,或对TNF-a 等的 表达起正性或负性调控作用。研究发现STAMP2 是炎性、饮食影响的脂肪细胞功能 与系统代谢间的一个联系因子,作为脂肪组织炎症和IR 的负性调节剂,能共同调节 [33] 营养和炎症反应来维持系统代谢平衡 。STAMP2 在脂肪细胞中联系炎性通路和物 3 新疆医科大学硕士学位论文 质代谢通路的中间桥梁。目前,STAMP2 的神秘面纱逐 渐被人们揭开,开始从不同 [34] 的方面去研究探索其功能,第一,张春梅 等用免疫印迹技术和免疫组织化学对 STAMP2 的mRNA 和蛋白水平分析,在肥胖的人群中是高表达的;第二,郭艳英等 [35]研究证实了STAMP2 基因变异与新疆维吾尔族人群代谢综合症相关,提示其在正 常的情况下抑制炎症反应保护胰岛素的敏感性最终维持代谢平衡;第三促进铁和铜 [36] 的吸收,在动物实验中发现,缺乏STAMP2 会表现贫血的症状 ;第四, STAMP2 [33] 可以抑制胰岛素抵抗 ,最近在敲除STAMP2 的小鼠研究中发现,缺乏STAMP2 将 会抑制胰岛素刺激的葡萄糖的转移;第五,前列腺癌中高表达,在人类的前列腺癌 [37] 中已经被证实,参与细胞的程序性凋亡 ;第六,研究已经证明STAMP2 在人的滑 [38] 膜中表达,特别是具有类风湿关节炎的病人的CD68+的巨噬细胞中高度表达 。总 之,STAMP2 的变异或缺失将会导致炎症反应和胰岛素抵抗的发生,胰岛素抵抗与 高血压相关,因此STAMP2 可能与高血压相关。STAMP2 在功能上与高血压 相关, 因此STAMP2 可能是高血压的候选基因。候选基因法是以参与血压调节机制的蛋白 为对象,确定候选基因;进行遗传连锁分析,确定该候选基因座位与高血压是否连 锁;筛查该候选基因的各种突变体;基因多态性与高血压间的关联研究,以确定该 基因突变体是否与原发性高血压有关。候选基因编码的蛋白质分别可以从血压的生 理、生化、代谢等途径参与血压的调节。STAMP2 作为EH 的可能候选基因均通过调 节炎症因子的表达和信号传导,参与炎症反应和胰岛素抵抗的调节,这提示STAMP2 基因变异所引起的蛋白质生物功能改变,可能影响炎症因子的表达和胰岛素抵抗的 发生,从而参与EH 发生和发展的病理过程。 维吾尔族人群是新疆的主要群体,特别是居住在经济欠发达的新疆南部的人群, 同时该民族主要以羊肉、乳制品为主,并且存在大量吸烟和过度饮酒等不良生活习 惯,由于生活习惯和饮食习惯差异,所以新疆维吾尔族是高血压发病的少数民族之 一。本研究选择新疆和田地区作为样本收集地点,该地区是维吾尔族世代居住的地 区,其交通不便、人口稳定、流动性少、遗传异质性小、居民配合,因此和田地区 的维吾尔族人群是高血压病的理想研究对象。 本研究选择与炎症因子和胰岛素抵抗相关的STAMP2 基因作为候选基因,以高 血压易感人群的新疆维吾尔族人群为研究对象,采用候选基因策略方法,通过基因 测序的方法精选出变异位点在大规模自然人群中采用病例-对照研究方法来探讨原发 性高血压可能的易感基因。具体如下:随机选取新疆维吾尔族人高血压患者血标本 进行研究, 进行测序选取 STAMP2 的3 个代表性的变异位点,采用TaqMan-PCR 技术在大样本的自然人群中对有代表性的变异位点进行验证,采用病例-对照研究设 计的方法,分析 STAMP2 基因是否与新疆维吾尔族人原发性高血压关联,分别对单 个位点、变异位点所构建的单倍型进行分析,同时采用多元Logistic 回归方程分析与 4 新疆医科大学硕士学位论文 原发性高血压发生的危险因素。本研究探讨新疆维吾尔族人原发性高血压发生发展 可能的遗传机制,试图探求原发性高血压病的易感基因及等位基因,为新疆维吾尔 族高血压病的筛查,诊断、治疗及预防提供理论依据。 5 新疆医科大学硕士学位论文 研究内容与方法 1 研究内容 1.1 研究 本课题采用候选基因策略,病例-对照研究基础上的关联分析研究,基本的策略 是以诊断明确患有原发性高血压患者作为病例组,以没有患该病但有可比性的个体 作为正常对照组,应用分子生物学技术进行候选基因的基因分型,该基因在病例组 中的基因型和等位基因的频率与正常对照组中的基因型和等位基因的频率相比较, 应用统计学的方法分析该基因是否与原发性高血压在统计学上存在着相关关系。在 控制了混杂因素之后,再借助统计学的方法来评估该基因是否为原发性高血压的危 险因素,从而推断出该基因是否为原发性高血压的候选基因,从而达到探索疾病病 因的目的。 1.2 研究对象 本研究是以横断面流行病学调查为基础的病例-对照研究,样本来自具有代表性 的维吾尔族聚居地-新疆和田地区。所有研究对象的临床资料和 DNA 样本均来自新 疆和田地区,该地区人口分布均衡,居民稳定配合。选取新疆30 岁以上的维吾尔族 人群作为研究对象进行流行病学调查,采用整群抽样的方法,随机连续抽取样本, 并且严格控制研究对象的入选,保证研究样本均为遗传学上无关联的个体。本研究 得到了新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会的批准,所有研究对象均签署了 知情同意书。 1.3 病史采集及体格检查 在受试者知情并同意的情况下,以问卷的形式对研究对象的一般资料进行收集, 调查前制定详细的调查表,对入选对象采用统一的调查表,调查问卷的内容包括: 年龄、性别、家族史、服药史、生活方式(吸烟和饮酒)、高血压组要记录降压药的 使用情况(包括药物的名称,药物的剂量,是否规律用药以及是否该用其他药品) 及现患的疾病等。血压的测量按照美国心脏联合会(American Heart Association , AHA)推荐的血压测量方法测量收缩压和舒张压。按方法测量身高和体重,并 且精确到0.5cm 和0.5kg,体重的测量要求少量着衣,身高的测量要求脱鞋 和脱帽。 人体学测量包括:身高、体重、腹围,以身高、体重计算体质指数(body mass index, 2 BMI )[BMI 体重 kg /身高 m ] 。 1.4 诊断标准 所有研究对象均无血缘关系和异族通婚史,高血压诊断标准根据 2005 年 WHO/ISH 公布的高血压诊断标准:高血压组:非同日2 次收缩压?140mmHg 和或 舒张压?90mmHg 或正在服用降压药者;正常血压组:标准为收缩压, 140mmHg 和 6 新疆医科大学硕士学位论文 舒张压 90mmHg (除外正服用抗高血压药物者)。排除标准:继发性高血压、冠心 病、脑卒中、急性心肌梗塞、心肌病、严重的肝肾疾病、甲状腺疾病、过度饮酒史 及恶性肿瘤等。 1.5 生化资料及遗传资源的收集 所有调查对象晨起空腹,由专门的护士抽取肘静脉血,在 4 ? 3000 转/分钟离心 7 分钟,分离血清和血细胞,保存于-70?冰箱,所有血清均送至自治区人民医院特 检科检测,采用日立7600 生化分析系统对血清离子、肾功、血糖、血清胰岛素及血 脂水平的检测。研究对象为新疆维吾尔族人群的基因组DNA 样本,使用试 剂盒(达 沃斯公司,德国)提取,使用分光光度仪(贝克曼公司,美国)测定DNA 浓 度及纯 度。研究对象均来自新疆和田地区。 1.6 主要仪器 3130XL 基因序列分析仪(ABI,美国) 7900 实时定量TaqMan PCR ABI,美国) Sequencher 4.7 高通量基因序列分析软件(美国) 离心机(BIOFUGEPLCO,德国贺力士) 凝胶分析仪(FOTO ,美国) 图像打印器(SONY,日本索尼) 紫外分光光度计 DU530;美国 SNPalyzer 专业版分子遗传学分析软件(日本) 水平电泳槽(BIORAD,北京) 电导率仪(DBS-307,上海) PCR 仪 PCR system 9700 ,新加坡 电子天平(PB2002-N ,德国) 电子定时钟(SDD-2 ,北京) 紫外可见光分光光度计(ND- 1000 美国) 超净工作台(SW-CG-2FG,苏州安泰) 电热恒温水箱(BHW2- 1,北京) 制冰机(AF- 100, 意大利) 电泳仪(PAC 3000,美国) 超纯水仪(EASYPUE,美国) 高压灭菌器(AUTOCLAVEMLS-3020,日本三洋) 超低温冰箱(NUNR,美国) 垂直电泳槽(PROTEANII120,美国) 台式酸度计(525A,美国) 7 新疆医科大学硕士学位论文 电热恒温震荡水槽(DKZ-2 ,上海) 搅拌振荡器(MIXIMIX,美国) WD900ASL2302 微波炉(中国) ,20 ?冰箱(中国) 低温高速离心机(德国) 高压高温消毒柜(中国) 加样器(GILSON 公司) 干燥箱(上海益恒实验仪器有限公司) 1.7 主要试剂 TaqDNA 聚合酶 (上海生物工程公司) PAXgene 血DNA 提取试剂盒 (美国QIAGEN 公司) MgCl2 、无水乙醇、异丙醇 (华美生物工程公司) PCR 反应缓冲液 (华美生物工程公司) 探针、Mast Mix (美国ABI 公司) DNA Marker (华美生物工程公司) 琼脂糖 (上海生物工程公司) 限制性核酸内切酶 (华美生物工程公司) 溴化乙锭 (上海生物工程公司) 引物 (上海生物工程公司) 溴酚兰 (上海生物工程公司) 主要试剂配制 0.5mol/L EDTA pH 8.0 : 二水乙二胺四乙酸( ) 18.6 g 加水 80 ml NaOH 2 g ,电磁搅拌,缓慢加 入至pH 值达 到8.0 为止。 加水 定容至100 ml 高压灭 菌后室温存放。 溴化乙锭 EB 储存液 10 mg/ml : 溴化乙锭 1.0g 双蒸水 100.0ml 溴化乙锭工作液 1mg/ml : 溴化乙锭储存液 100.0μl 双蒸水 900.0μl 8 新疆医科大学硕士学位论文 6 × 溴酚兰上样缓冲液: 溴酚兰 0.25 g 甘油 30ml 双蒸水 定容至100ml,保存于 4 ?。 10%十二烷基磺酸钠(SDS ): 电泳级SDS 10 g 水 90 ml ,加热至68?助溶 浓盐酸 几滴调节溶液pH 值至7.2 加水 定容至100 ml。 5×TBE 缓冲液 1L : Tris 碱 54.0g 硼酸 27.5g 0.5mmol/L EDTA 20.0ml 加水蒸馏水定容至 998.0ml TE buffer PH:8.0 : 10mmol/lTris-HCL PH:8.0 5.0ml 1mmol/l EDTA PH:8.0 1.0ml 双蒸水 494.0ml 1mol/L Tris-HCl: Tris 碱 121.14 g 水 800 ml 溶解 浓盐酸 60 ml 调节pH 值至 7.6,冷却后 蒸馏水 定容至1000 ml 分装后高压灭菌。 常规PCR 反应体系配置 DNA 原液 1 ul 上游引物 0.25ul 下游引物 0.25ul Taq 酶 5ul H O 3.9 ul 2 PCR 引物配置: 将原始引物浓度稀释为50umol/l 原始引物 6ul Buffer BG4 24ul 9 新疆医科大学硕士学位论文 2 实验方法 2.1 基因DNA的提取步骤 真核生物DNA以核蛋白的形式存在于细胞核中。制备DNA的原则是既要 将DNA 与蛋白质、脂类和糖类等分离,又要保持DNA分子的完整性,本研究通过十 二烷基 磺酸钠溶解细胞并使蛋白质变性;乙二胺四乙酸可螯合二价阳离子以抑制 DNase 的活 性,从而保护DNA 的完整性;加入RNase除去RNA ;蛋白酶能在十二烷基磺酸钠和 乙二胺四乙酸存在下仍保持很高的活性,可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA 分子完整地分离出来,再用酚/氯仿抽提除去蛋白质,酚可使蛋白质变性,但用酚抽 提DNA时仍有10%-20% 的酚溶于水,氯仿则可除去水相中的酚,使其进入有机相, 同时协助酚使水相和有机相分界清楚,异戊醇清除反应中产生的气泡,使界面清晰; 用无水乙醇沉淀DNA。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生不同大小的片 段。因此,在分离基因组DNA时应尽量采取温和的条件,以保证得到较长的DNA。 DNA提取步骤: 取5mlEDTA-Na2 抗凝冷冻血细胞,采用PAXgene 血DNA 提取试剂盒,按照操 作说明结合实验实际进行。具体步骤如下:室温放置50-60 分钟解冻,用前5 分钟颠 倒4-5 次,取5ml 血样本加入25ml BG1 细胞裂解液 Cell Lysis Solution 中,上下颠 倒10 余次混匀,使其充分裂解;震荡后低温离心机离心,5000rpm、4 ?离心5 分钟; 取出试管,小心仔细弃去上清液;沉淀物中,加入 BG2 4ml,旋紧试管盖,高速振 荡15 秒,充分溶解沉淀物;5000rpm、4 ?离心5 分钟,取出试管,小心仔细弃去上 清液;沉淀物中,加入BG35ml 和30ul 裂解酶,高速振荡20 秒;放入55?恒温水 浴箱水浴15 分钟,(样本颜色由红色变为淡绿色,表明蛋白已被消化);从水浴箱中 取出试管,高速振荡5 秒;加入异丙醇5ml (100%),轻微震荡,充分颠倒混匀,直 至可见白色DNA 析出、聚团;5000rpm、4 ?离心10 分钟;取出试管,小心仔细弃 去上清液,将离心管倒置于干净的滤纸上约5 分钟,以便充分去除异丙醇;加入70% 酒精5ml,轻微振荡5 分钟; 10000rpm、4 ?离心4 分钟,取出试管,小心仔细弃 去上清液,将离心管倒置于干净的滤纸上约5 分钟,充分除去残留酒精,直至DNA 干燥; 加入BG4 5ml,充分溶解DNA,再放入65?恒温水浴箱中水浴2 小时,随 后取出离心管室温下过夜;次日用分光光度仪测OD 值。 2.2 DNA浓度测定 核酸分子中含有碱基使核酸在260nm下有最大吸收。紫外吸收是嘌呤环和嘧啶环 上的共轭双键系统所具有的性质,含有嘌呤和嘧啶的物质,不论是核苷、核苷酸或 核酸都有吸收紫外光的特性。蛋白质由于含芳香族氨基酸,因此也能吸收紫外光, 通常蛋白质在280nm波长有特异吸收。因此,核酸在A260 及A260 、A280 测定的比值 (A260/A280 )可以反映样品中核酸的含量及纯度。纯度的测定:RNA在A260/A280 的 10 新疆医科大学硕士学位论文 比值在2.0 以上;DNA在A260/A280 的比值为1.8左右。DNA溶液的A260/A280 应为1.8-2.0 为佳,若比值大于2.0 以上,说明RNA尚未除尽;若A260/A280 比值小于1.8时,说明样 品中含有蛋白质与酚或其他吸收此波长的杂质在其中,建议再用酚/氯仿抽提,继以 乙醇沉淀除去杂质。 采用NanDrop ND- 1000 分光光度仪测定DNA 浓度及纯度:点击桌面软件图标, 选择核酸检测;反复用超纯水清洗加样孔5 次以上;取超纯水2μl 加入加样孔调零, 擦干加样孔,加入2μl BG4 于加样孔,点击“Blank”,随后点击“Measure”,直至D260 小于0.005 ;分别加入每一个DNA 样本2μl 于加样孔进行检测,每测一 个样本之后 用干净的滤纸将加样孔擦拭干净;打开“Show Report”,逐一记录每个样本的浓度、 纯度(OD260/280 )并保存,OD260/280 在1.7~1.9 为佳。 2.3 PCR 引物序列设计及合成 PCR 引物在Primer primer 3.0 软件上设计,由中国上海生工生物工程公司合成。 2.4 PCR 扩增目的片段 PCR 是一种选择性体外扩增DNA 的方法,包括三个基本步骤:第一,变性使目 的双链DNA 片段在 94?下解链;第二,退火使两种寡核苷酸引物在适当的温度下 与模板上的目的序列通过氢键配对;第三,延伸使在TaqDNA 聚合酶的最适温度下, 以目的DNA 为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环 将使目的DNA 扩增一倍,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,经 6 25-35 轮循环就可使DNA 扩增10 倍 PCR反应在96孔Perkin Elmer 9700热循环仪上进行,每个PCR反应体系含50ul容 积:DNA模板1ul,上下游引物各0.25ul,Taq酶5 ul,去离子水加至10ul。反应条件包 括:首先在94?变性5分钟,随后进行30个循环,每个循环包括三步。PCR反应体系 DNA模板40ng/μl,2 μl,终浓度为1.6ng/μl ;Taq DNA聚合酶,0.5 μl,终浓度为0.5U (0.10U/μl );上下游引物各0.8 μl,终浓度为0.16mol/L;dNTP体积为4 μl,终浓度为 及0.8mmol/L;25mmol/LMgCl2体积为1.5μl,终浓度为1.5mmol/L;10×buffer,5μl, 终浓度为3.50mmol/LKCl,0.1mg/ml 明胶和10mmol/LTris-Hcl。反应条件为预变性94?、 5分钟、一个循环;变性94?、1分钟,60?、1分钟,延伸、70?、1分钟,循环30 次;总循环70?、5分钟、一个循环。 2.5 琼脂糖凝胶的制备和PCR 产物的鉴定 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化和鉴定DNA 片段的典型方法。琼脂糖凝胶电泳的 基本原理是在 PH8.0-8.3 的缓冲液中,DNA 分子带负电荷,在电场中向正极泳动。 DNA 分子在电场中通过介质而泳动,除电荷效应外,凝胶介质还有分子筛效应,与 分子大小及构象有关。对于线形DNA 分子,其电场中的迁移与其分子量的对数值成 反比,在凝胶中加入少量的溴化乙锭,其分子可插入DNA 的碱基之间,形成一种光 11 新疆医科大学硕士学位论文 络合物,在 254-365nm 波长紫外光的照射下,呈现橘红色的荧光,因此可对分离的 DNA 进行检测。电泳时以溴酚蓝及二甲苯青作为双色电泳指示剂,其目的是:第一, 增大样品的密度,确保DNA 均匀进入样品孔内;第二,使样品呈现颜色,了解样品 泳动的情况,使操作更为方便;第三,溴酚蓝及二甲苯青可做DNA 片段大小及迁移 距离等的参照。DNA 在琼脂糖凝胶介质中,在电场的作用下,从负极向正极移动, 泳动的速度取决于 DNA 的大小和构型,电泳以后经溴化乙锭染色,DNA 可与其结 合,在紫外灯光下发出荧光。PCR 产物经溴乙锭染色,在0.5%琼脂糖凝胶中电泳后 经自动凝胶成像系统做定性鉴定。具体步骤:将电泳槽放在工作台的水平位置上 水 平仪校正 ;0.8%的琼脂糖凝胶板的配制:在0.6g 进口琼脂糖粉中加入80ml 的1× TBE (1x)20ml 缓冲液,将琼脂糖在微波炉中加热,充分融化,将其冷却至55?-65? 左右后加入10μl 溴化乙锭使其终浓度为0.5ug/ml 的,充分混匀备用;将插有梳子的 灌胶模具放在工作台的水平位置上,取配置好的0.8%琼脂糖凝胶在微波炉中加热充 分融化,然后冷却至70?左右,充分倒入放置梳子的电泳槽中,凝胶厚度在3-5mm 之间,琼脂糖凝胶浓度为 2% ;室温放置 30 分钟,待凝胶完全凝固后,小心移去梳 子;将制备好的琼脂糖凝胶置于水平电泳槽中,加入没过胶面约 1 mm 的0.5×TBE 电泳缓冲液;加入6μl 混有少量溴酚兰的PCR 产物,用排枪把样本点入点样孔中, 同时加入标准分子量DL 2000 Marker 对照,以确定反应条带;盖上电泳槽,100V 进 胶,80V 电泳30 分钟;紫外凝胶成像仪成像,鉴定PCR 产物;观察PCR 产 物长度 电泳观察扩增结果,通过凝胶成像仪成像,可以清晰地看见目的条带,记录并保存 结果,PCR 产物在-4 ?保存。 注意的要点:第一,选择琼脂糖凝胶地浓度取决于所鉴定的DNA的大小,小片 段DNA应用高浓度的凝胶;大片段的DNA则用低浓度的凝胶,在1%的琼脂糖凝胶中 溴酚兰的泳动速度与500bp的双链线状DNA一致;第二,电泳中注意防止凝胶发热; 第三,将电泳仪放置稳压档,电压设置小于5v/cm (电极间的最小路径),随着电压 的增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小;第四,溴化乙锭有强烈的致癌作用,操 作时注意防护。 2.6 PCR 产物纯化及测序 PCR 产物一般都含有过量的引物、TaqDNA 酶及dNTP ,这些成分的存在将直 接影响到后续的酶切、双脱氧PCR 测序反应等过程,因此有必要除去。先用溶液溶 解DNA 的琼脂糖凝胶,然后加入有吸附柱的离心管中,吸附柱吸附DNA,离心将 琼脂糖的溶液去除,再加入去盐的漂洗液进一步去除杂质;因PH 值的原因,DNA 还是吸附在吸附柱上的膜上;最后加入纯水或者TE 溶解液,在这个条件下DNA 会 12 新疆医科大学硕士学位论文 溶解在其中,通过离心将液体离下来,得到的液体就是纯化好的PCR 产物,从而使 DNA 得到纯化。 PCR 扩增产物按照高通量核酸提取系统(ABI PRISMTM ,Big-Dye )末端标记 试剂盒说明书进行纯化反应。纯化反应体系虾碱酶消化体系10μl,虾碱酶0.5 μl,去 离子水1.5μl,PCR 产物10μl。PCR 产物纯化的反应条件35?、30 分钟,80?、15 分钟,15?为8 ,循环1 次。 ABI PRISM 3130XL 基因序列分析仪 即DNA 测序仪 ,采用毛细管电泳技术取 代传统的聚丙烯酰胺平板电泳,应用四色荧光染料标记的ddNTP 标记终止物法 ,因 此通过单引物PCR 测序反应,生成的PCR 产物则是相差1 个碱基的3'末端为4 种不 同荧光染料的单链DNA 混合物,使得四种荧光染料的测序 PCR 产物可在一根毛细 管内电泳,从而避免了泳道间迁移率差异的影响,大大提高了测序的精确度。由于 分子大小不同,在毛细管电泳中的迁移率也不同,当其通过毛细管读数窗口段时, 激光检测器窗口中的CCD 摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测,激发的荧光 经光栅分光,以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光,并在CCD 摄影机上同步 成像,分析软件可自动将不同荧光转变为DNA 序列,从而达到DNA 测序的目的。 分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。 纯化后的DNA 还需进一步进行测序反应,方可采用美国ABI 公司的ABI 3130Xl genetic analyzer 全自动测序仪进行核苷酸序列测定。分别对STAMP2 基因的所有外 显子、外显子- 内含子交界区、5′和3′非编码区(untranslated regions, UTRs )序列进 行PCR 扩增及测序分析。DNA 测序的反应体系待测DNA 的正向引物 1μl,灭菌去 离子水2 μl,纯化的DNA 体积为1μl,BigDye Mix 体积为1μl。反应条件为98?、2 分钟、一个循环;96?、10 秒,50?、5 秒,60?、4 分钟,25 个循环;15?,1 个 循环。 2.7 变异位点的选择 在测序发现的变异位点中,在考虑可能的功能(错义突变)和连锁不平衡(Linkage 2 disequilibrium, LD)关系(r 0.8 )后,选择最小等位基因频率(minor allele frequency, MAF ) 5%的常见变异位点和低频率的错义突变。 STAMP2 基因,定位于 7q2 1.12 ,由 5 个外显子和 4 个内含子组成, 测序后在 STAMP2 基因检测到14 个新的变异位点和6 个已知的变异位点,其中包括2 个错义 突变。应用SNPalyzer 7.0 程序后,计算配对连锁不平衡系数,如果r2 0.8 时,可选 出3 个代表性的变异位点,这3 个SNP 分别为rs8122,rs 1981529 和rs34741656 。选 择的3 个变异位点rs8122 的位置3' 的非编码区;rs1981529 位置在外显子2 区,为错 义突变,氨基酸的改变为甘氨酸变成天门冬氨酸;rs34741656 位于外显子 2 区,为 13 新疆医科大学硕士学位论文 措义突变,氨基酸的改变为丙氨酸变为苏氨酸。 2.8 基因分型 TaqMan 荧光实时定量PCR 是使用一个双标记的TaqMan 荧光探针,能实时检测 产生的PCR 产物。荧光5 ′核酸为PCR 化验使用,Taq DNA 聚合酶下的5 ′-3 ′核 酸活性切开TaqMan 探针,该探针在PCR 的过程中与目的序列杂交在一起。当探针 完整时,荧光染料因接近淬灭染料而被抑制。在 PCR 过程中,探针会退火到 DNA 模板上,TaqDNA 聚合酶的5 ′-3 ′核酸活性切开染料,导致染料信号增多。剩余的 探针从目的序列上分离开,使PCR 反应继续。荧光的强度和放入的目的DNA 量直 接相关。荧光信号通过使用序列检测系统捕获。在PCR 过程中通过分析每个循环作 为扩增模板结果的荧光信号来确定目的模板的最初量。引物和探针必须杂交到目的 序列上来扩增和切割。荧光信号只在探针的目的序列在PCR 中扩增的情况下产生, 由于这些条件,所以不会检测到非特异性扩增。 2047 个样本基因分型均采用 TaqMan 7900HT 荧光实时定量 PCR (Applied Biosystems,Foster City, Clifornia, USA),分型样本均放置384 孔板中。质量控制:首 先是病例对照随机分布在每张384 孔板;其次是最后两孔只加Buffer,作为阴性对照; 最后是测序用的47 个样本随机分布在384 孔板,用来检验分型是否正确。基因型鉴 定步骤:将所测样本DNA 稀释至20ng/uL,然后每孔加入1ul ,分装384 孔(其中2 孔为对照组,剩余382 孔均为待测样本);每孔分别加入引物和探针混合液0.125ul; 每孔加入去离子水1.625ul,直至反应体系总体积为5ul ;按照反应条件,调节反应温 度、反应时间、循环次数。按正规操作程序进行操作,反应结束后采用 SDS2.0 软件 分析分型结果、记录反应结果,随机抽取 l0 ,的个体进行重复基因分型,控制基因 分型质量,独立、双遍判读基因型并输入数据库。TaqMan-PCR 反应体系PCR 主要 反应混合液2.25 μl,荧光探针0.125 μl,去离子水1.625μl,DNA20ng。TaqMan-PCR 反应条件:预变性95? 、10 分钟、循环1 次;变性95?、10 秒,退火60?、1 分 钟,延伸72 ?,循环次数为41 次;总延伸72 ?、7 分钟、循环1 次。 3 质量控制 3.1 研究对象选择 研究对象的选择方面,严格控制研究对象的入选标准和排除标准,多设立对照 组,遵循随机化原则,随机抽样和随机分配的方法,提高应答率,减少失访率,最 大程度上减少选择偏移; 3.2 资料的收集 在资料的收集过程方面应尽量使用统一的标准收集资料,以便控制信息偏移, 减少系统误差,这就要求研究对象本身尽可能的在调查期间准时的到场,要求研究 对象本身对自己的患病情况和一般情况作出准确可靠的应答信息; 14 新疆医科大学硕士学位论文 3.3 测量方法 在具体的测量方法上要求尽量做到准确和严格,都按照严格的标准进行操作, 首先所有研究对象测量血压前30 分钟禁止吸烟、饮酒、喝茶、喝咖啡和剧烈的运动 等,采用台式水银柱血压计对血压进行测量,由高血压专科医师操作,在受试者休 息5 分钟之后测量其坐位右上臂的血压,连续测量3 次,每次间隔5 分钟,数据分析 时取3 次平均值,测定血压时室温保持在20 ?以上,尽可能控制信息偏移。 3.4 技术人员和仪器 在收集资料的过程中,采用一定的调查技巧,要求每一个调查人员都经过严格 培训和考核,内容包括问卷调查、人体测量、血样采集、运输、分离、标记、 保存、 记录、调查表审核、资料录入等,考试合格后才能担任,均由专门人员负责,其中 问卷调查人员由高血压专科医师承担,所有生化指标的检测均在新疆自治区人民医 院(三级甲等医院)检验科进行。该科室设备精良,并由专业人员进行检测,最大 程度地减少了人员和设备检验所造成的试验误差,尽可能的减少信息偏移。最大程 度减少了由观察者所造成的人为的误差,控制了信息偏移。全部测量仪器都要经过 严格的校正,全部检测所用到的试剂都要选择统一的型号、统一的剂量,使用同一 个生产厂家所生产的试剂,以便消除测量偏移。 3.5 生化指标 所有的生化指标均使用客观的研究指标,资料录入计算机采用两人双边录入, 核对无误后进行统计学分析,尽可能的控制信息偏移。由于高血压是一个复杂性的 疾病,所涉及的范围很广,所以混杂因素将会在很大程度上对它有严重的影响,混 杂因素由一个或者多个外来因素的存在,掩盖或夸大了研究因素和疾病的相关关系, 从而部分或全部的歪曲了两者之间的真实关系,所以在分析高血压的危险因素时, 借助统计学软件和利用统计学的方法,准确评估危险因素,尽可能的消除混杂因素 对疾病所造成的影响,从而消除混杂偏移。 4 统计学处理 数据处理应用SPSS17.0软件;计量资料以均数?标准差表示;计数资料用构成比 或率表示其基本特征;正常血压组和高血压组如人体测量指标、生化指标及血压水 平之间的差异比较时应先进行方差齐性检验,以决定是采用t检验或方差分析,或采 2 用秩和检验等;用? 检验以确认是否符合Hardy-Weinberg平衡,用直接计数法分别计 算正常对照组和高血压组基因型频率,由基因型频率计算等位基因频率,两组间等 位基因频率和基因型频率比较采用卡方检验,采用卡方检验时要综合考虑样本例数 和最小理论数以便采用不同的公式;本研究中应变量为二分类变量,因此选择非条 件Logistic 回归分析来了解不同基因型与高血压发生的关系并消除混杂因素(如校正 性别、年龄、BMI 、吸烟、饮酒混杂因素),分别分析STAMP2基因变异位点位点对 15 新疆医科大学硕士学位论文 高血压危险的作用大小,计算比值比(odds ratio,OR)和95 ,可信区间(Confidence interval,CI);SNPalyzer 7.0 软件构建单体型,计算常见单体型在正常血压组和高血 压组频率分布有无统计学差异;检验水准通常取a 0.05,P 0.05表示差异无统计学意 义, 以P 0.05或P 0.01为差异有统计学意义。 5 技术路线 高血压流行病学调 收集表型资 收集血液标 DNA遗传资源库建 性别、年龄、BMI、血压 血生化指 基因测序 基因型坚定 病例-对照的关联研 对臆测的致病突变的功能进 16 新疆医科大学硕士学位论文 结果 1 STAMP2 基因功能区测序结果 对47 例维吾尔族高血压病患者STAMP2 基因功能区测序,共发现20 个变异位 点:3'-UTR 区8 个,内含子区8 个,外显子区4 个。6 个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms, SNPs )在NCBI 的SNP 数据库中已有记录,2 个SNPs 在外显子,4 个SPNs 在3'-UTR 区。根据变异位点的可能功能和最小等位基因频率(minimum allele frequency, MAF ) 5%,共选取 3 个变异位点在自然人群中进一步进行基因型鉴定, rs8122, rs1981529 和rs34741656 。(表1,2,3 ) 表 1 47 例高血压样本测序 STAMP2 基因外显子区变 异 dbSNP ID LD AA region N MAF % rs1981529 224G/A Gly75Asp Exon2 41 0.183 rs34741656 364G/A Ala122Thr Exon2 47 0.047 -22553C/T Exon1 42 1% 291T/C Asn97Asn Exon2 43 0.012 dbSNP ID :单核苷酸多态数据库中的标识符;Exon :外显子区;MAF :最 小等位基因频率;LD: 2 连锁不平衡(变异位点间r 0.8 定义为存在LD ), 表 2 47 例高血压样本测序 STAMP2 基因内含子区变 异 dbSNP ID SNPs LD region N MAF % -22308t/a intron 1 42 0.012 -237a/c intron 1 43 0.035 865t/a A intron 2 46 0.064 1005c/t A intron 2 46 0.065 1684c/t A intron3 46 0.065 2988t/c intron3 46 0.011 4498t/c intron4 45 0.033 4501t/c intron4 45 0.011 dbSNP ID :单核苷酸多态数据库中的标识符; intron :内含子区;MAF : 最小等位基因频率;a: 2 连锁不平衡(变异位点间r 0.8 定义为存在LD ) 17 新疆医科大学硕士学位论文 表 3 47 例高血压样本测序 STAMP2 基因 3 ’UTR 区变异 dbSNP ID SNPs LD N MAF % rs55767928 5826G/A a 40 0.038 5750G/A 40 0.013 rs9886189 6101T/G a 32 0.047 6031T/G 32 0.078 6666T/C 47 1% rs1044424 6734A/C a 47 0.064 7039A/G 46 1% rs8122 7414 A/G 47 0.372 dbSNP ID :单核苷酸多态数据库中的标识符;MAF :最小等位基因频率;a:连锁不平衡(变 2 异位点间r 0.8 定义为存在LD ), 2 高血压组和正常血压组基本特征 受试维吾尔族人群性别、年龄、体重指数、收缩压和舒张压的基本数据见(表4 ), 正常血压组和高血压组的年龄、体重指数、收缩压和舒张压之间差异有统计学意义 (P 0.05 )。性别在正常血压和高血压组之间的差异无统计学意义(P 0.05 )。 表 4 高血压组和正常血压组人群一般特征 一般特征 高血压组 810 正常血压组 1237 P 性别(男/女) 311/499 456/781 0.484 年龄(岁) 54.8?9.4 49.0?11.0 0.0001 2 体重指数 kg/m 28.2?4.5 26.2?4.2 0.0001 收缩压(mmHg 159.1?20.0 115.4?13.1 0.0001 舒张压(mmHg 93.4?14.4 71.3?9.5 0.0001 3 维吾尔族高血压组和正常血压组基因型频率和等位基因频率分 布比较 STAMP2 基因rs8122 ,rs1981529 和rs34741656 突变在两组人群中基因型分布及 等位基因频率见 表5 。 rs8122 的GG、GA、AA 基因型、G、A 等位基因在高血压 组及正常血压组中的频率分别为50.1%、41.9%、6.5%、71.0%、29.0%及48.8%、44.7%、 6.5%、71.2%、28.8%;rs1981529 的AA、AG、GG 基因型、A、G 等位基因在高血 压组及正常血压组中的频率分别为65.2%、31.5%、3.3%、80.9%、19.1%、及66.5%、 30.6%、2.9%、81.8%、18.2%;rs34741656 的GG、GA、AA、基因型、G、A 等位 基因在高血压组及正常血压组中的频率分别为81.4%、17.0%、1.6%、89.9%、10.1% 及82.0%、17.0% 、1.1%、90.5%、9.5%。rs8122 ,rs1981529 及rs34741656 基因型及 18 新疆医科大学硕士学位论文 等位基因分布在高血压组与正常血压组中差异均无显著性 (P 0.05 )。 表 5 变异位点基因型及等位基因频率在高血压组与正常血压组间的比较 位点 基因型 正常血压组 n % 高血压 n % ?2 P GG 604 48.8 406 50.1 rs8122 GA 553 44.7 339 41.9 2.757 0.252 AA 80 6.5 65 8.0 G 1761 71.2 1151 71.0 0.008 0.928 A 713 28.8 469 29.0 rs1981529 AA 822 66.5 528 65.2 AG 379 30.6 255 31.5 0.516 0.773 GG 36 2.9 27 3.3 A 2023 81.8 1311 80.9 0.462 0.497 G 451 18.2 309 19.1 rs34741656 GG 1014 82.0 659 81.4 GA 210 17.0 138 17.0 1.206 0.547 AA 13 1.1 13 1.6 G 2238 90.5 1456 89.9 0.379 0.538 A 236 9.5 164 10.1 a:优势比;b :95%可信区间 4 非条件Logistic 回归分析 排除混杂因素(如年龄、性别、体重指数、吸烟和饮酒)作用之后, STAMP2 基因多态性与高血压病无关联。同时也未发现三个位点使高血压病患病风险 (odds ratio ,OR)显著改变。 表6 表 6 Logistic 回归分析 指标 ? SE ?2 P OR 95%CI 年龄 -0.067 0.005 192.083 0.000 0.936 0.926-0.945 性别 -0.045 0.113 0.159 0.690 0.956 0.766- 1.193 体重指数 -0.141 0.012 158.078 0.000 0.868 0.848-0.889 吸烟 0.231 0.133 3.080 0.082 1.259 0.971- 1.633 饮酒 -0.077 0. 182 0. 178 0.672 0.926 0.649- 1.322 rs8122 0.050 0.105 0.224 0.636 1.051 0.855- 1.291 rs1981529 -0.107 0.111 0.814 0.368 0.899 0.712- 1.134 rs34741656 -0.071 0.108 0.437 0.508 0.931 0.754- 1.150 19 新疆医科大学硕士学位论文 5 收缩压及舒张压同rs8122,rs1981529 及rs34741656 多态各基因 型间的关系 方差分析发现rs8122, rs1981529 及rs34741656 多态不同基因型收 缩压间的收缩 压和舒张压水平差异无统计学意义 (表7 )。 表 7 三位点不同基因型间血压的比较 SNP 基因型 收缩压 (mmHg ) P 舒 张压 (mmHg ) P GG 133.4?27.5 80.2?15.9 Rs8122 GA 131.8?25.8 0.41 79.7?15.7 0.67 AA 133.59?28.3 80.8?17.0 AA 132.9?27.2 80.1?15.9 Rs1981529 AG 132.3?26.3 0.92 80.0?16.0 0.86 GG 132.8?26.8 79.0?15.3 GG 132.6?26.7 79.9?15.9 Rs3474 1656 GA 132.5?27.0 0.37 80.2?15.8 0.68 AA 140.0?31.9 82.6?20.5 6 维吾尔族高血压组和正常血压组单倍型频率分布比较 STAMP2 基因的单倍型在两组人群中分布频率见 表8 。G-A-G 单倍型 频率在高 血压组及正常血压组中分别为60.4%、61.1%;A-G-A 单倍型频率在高血压 组及正常 血压组中分别为17.9%、18.1%;A-A-G 单倍型频率在高血压组及正常血压 组中分别 为10.8%、10.6% ;G-A-A 单倍型频率在高血压组及正常血压组中分别为 9.4%、9.6%; STAMP2 基因的单倍型频率分布在高血压组与正常血压组中差异无统计学意 义。 表 8 STAMP2 基因的单倍型在对照组和高血压组中的频率分 布 单倍型 正常血压n % 高血压组n % ?2 P OR 95%CI G-A-G 1520 61.1 979 60.4 0.417 0.518 1.043 0.918- 1.186 A-G-A 443 18.1 299 17.9 0.200 0.655 0.964 0.819- 1.133 A-A-G 267 10.6 168 10.8 0.184 0.668 1.046 0.853- 1.282 G-A-A 233 9.6 162 9.4 0.381 0.537 0.936 0.758- 1.156 G-G-A 8 442.3 10 320.6 1.932 0.165 0.522 0.206- 1.326 A-A-A 3 130.5 2 128.3 3.864 0.984 0.982 0.164-5.885 7 维吾尔族人STAMP2 基因最小等位基因频率MAF (%)和其他 人群的比较(表9 ) 新疆维吾尔族人群中rs8122 G 等位基因频率(29.0% )与HapMap 数 据库中国汉 20 新疆医科大学硕士学位论文 族人(22.2% )、日本(12.2% )、非洲(65.8%)和欧洲高加索人 38.3% 有 显著性差 异;rs1981529 A 等位基因频率(19.1%)与中国汉族人(11.1%)、日本 (2.2% )和 非洲(0 )有显著性差异,与欧洲高加索人 24.2% 没有太大的差异。 rs34741656 A 等 位基因频率(10.1%)与中国汉族人(2.2% )、日本(1.1%)和非洲(3.3% ) 有显著 性差异,与欧洲高加索人 11.7% 没有太大的差异。 表 9 维吾尔族人 STAMP2 基因 MAF % )和其他人群比较 SNP 维吾尔族 中国汉族人 日本人 欧洲人 rs 8122 29.00% 22.2 12.2 65.8 re1981529 19.1 11.1 2.2 0 re34741656 10.1 2.2 1.1 3.3 其他人群MAF 参照NCBI 基因数据库 21 新疆医科大学硕士学位论文 讨论 1 原发性高血压的流行状况 原发性高血压是以血压升高为主要临床表现的综合征,是多种心、脑血管疾病 的重要病因和危险因素,影响重要的心、脑、肾的结构和功能,最终导致这些器官 的功能衰竭。原发性高血压还是一种由遗传因素和环境因素共同作用引起的多基因 [39] 遗传病,累及全世界约25%-35%的成人 ,是危害人类健康的主要公共卫生问题。 近年来我国的高血压的患病率呈逐年快速增长的趋势,高血压的患病率在不同的国 家、不同的地区和不同的种族之间是有差别的,工业化国家较发展中国家高,美国 黑人约为白人的2 倍,我国自20 世纪50 年代以来进行了三次成人血压普查,总体 上高血压的患病率呈明显的上升趋势。流行病学调查显示,我国高血压的患病率存 在地区、城乡和民族差异,北方高于南方,城市高于农村,高原少数民族地区患病 [40] 率较高。根据研究显示估计2006 年全国高血压患病人数将达到2 亿 ,平均每4 个 人中就有一个高血压患者,每年新增加的高血压病患者就有1000 万,并且高血压患 [41] 者趋于年轻化,有人称高血压病是一个“无声的杀手” 。目前,对国外高血压流 [42] 行状况的研究显示,全世界高血压患者的总人数达9.72 亿 。欧美发达国家高血压 的患病率约为20%-50%,印度国家男性患病率最低,然而波兰成年女性高血压患病 率高达 72.5%[43] 。在对人群高血压的知晓率、治疗率和控制率来看英国 为 52.2%、 38.0%和10.7%。在对我国高血压流行状况调查来看,我国高血压的患病率为18.8%, 知晓率29.8% 、治疗率24.7%和控制率6.1%[44] 。形势更加严重的是我国高血压患病 率的增长趋势与老年人相比年轻人更加明显,特别是35-44 岁的男性高血压的患病率 为 74%[45] 。从中可以看出对高血压的治疗和防治工作应该刻不容缓。尽管目前我们 对高血压的发病机制还不很清楚,但是很多临床、基础和流行病学的研究为我们提 供了不少的证据和理论。使人们懂得了高血压发病的危险因素,存在遗传因素、高 钠饮食、肥胖、吸烟、饮酒以及缺乏运动等。在高血压治疗的前期工作就应该改变 一些危险因素,如低盐饮食、减轻体重、预防睡眠呼吸暂停综合症、胰岛素抵抗、 糖尿病和代谢综合症的发生。对一些不可改变的危险因素如年龄、性别和遗传因素, 如何去解决,是我们目前所面临的巨大问题。科学人员们对遗传因素之一点开始探 索解决高血压发病的机理,最终达到治疗高血压疾病的目的。高血压的发生增加了 心脑血管疾病的发病风险,同时也增加了心脑血管疾病的死亡率。高血压的人群患 病率的高低对心脑血管疾病的防治和治疗有十分重要的作用和意义。高血压诊断的 前提条件是血压的升高,我们所解决的问题就是如何将血压控制在达标的状态,目 前血压的控制上就是用药物来降血压,同时加上饮食或运动等其他的方法来促使血 压下降,但这只是治标不治本,不能从根本上解决血压高的状态,由于好多人只要 22 新疆医科大学硕士学位论文 一检测出自己得了高血压,那么就意味着会终生服用药物,这是很多人难以接受的 事实,也对很多家庭带来了负担,所以现在正寻找到能解决血压高的方法是刻不容 缓,也是很多人所期盼的结果。所以目前,高血压成了一个需要全世界科学家们来 解决的难题,怎么才能从根本上解决血压的升高呢,目前,很多学者们都在寻找治 疗高血压的根本的途径和方法,所以不可改变的因素遗传因素就逐渐成为人们研究 的热点,研究表明交感神经系统的活性增加基因、水钠潴留相关的基因、内分泌相 关的基因、胰岛素受体基因和代谢综合征相关的基因等一系列与高血压机制相关的 基因成为人们研究的靶点。目前已有很多关于高血压易感基因的研究,但由于高血 压的多基因决定性、遗传异质性、外显子功能不全及表型异质性等诸多因素,导致 研究结果并不一致,阻碍了高血压发病遗传机制的深入研究,导致许许多多的研究 结果在不同的人群中的重复性较差,甚至在同种族人群中也有差异,所以关于高血 压的发病机制至今仍不能阐明。大量遗传流行病学研究表明血压水平的变异 大多归 因于遗传因素,由于血压是数量性状,加之有较大的遗传异质性,若干有微弱效应 的基因的积累作用导致这个复杂疾病的遗传,复杂疾病的遗传模式通常是未知的、 复杂的、很难用一种固定的遗传模式来描述,再加上遗传异质性,在基因组中同一 部位存在多个某种疾病的易感基因,同时环境因素的影响存在里面,而复杂疾病有 时还有表型异质性,即同一种疾病具有不同的临床表现,更增加了研究的难度。 2 原发性高血压的发病机制的研究 2.1 原发性高血压以及与血压调节相关的易感基因 已经成为目前心血管领域中研究的热点之一。一些属于单基因遗传疾病 的继发 性高血压的致病基因已被识别,而原发性高血压是一种多基因遗传病,它的发病机 制是由环境因素和遗传因素共同作用的结果,这为高血压病遗传易感基因研究带来 很大的困难,近年来,候选基因途径和全基因组扫描是研究原发性高血压的两个主 要的研究策略,它们可以成功的用于多基因疾病相关基因的定位研究。目前对于疾 病的研究,逐渐从单基因向多基因转化,研究所带来的困难越来越大。原发性高血 压可能是一种多基因遗传性疾病,其发病率之高、危害性之大、但是收集样本量是 相对比较容易,因此已成为目前多基因疾病研究的热点和重点之一。原发性高血压 中血压的变异绝大部分是由遗传因素决定的,所以找到与疾病相关的易感基因是十 分重要的。对于疾病易感基因研究就显的尤其重要。目前,候选基因法是最常用的 方法,它是以参与血压调节机制的蛋白为研究对象,确定候选基因,然后再进行基 因连锁分析,确定该候选基因的座位是否与高血压相连锁,随后筛查该候选基因的 各种变异位点,再进行基因多态性与高血压的关联研究,来确定该基因的变异位点 [46] 是否与原发性高血压相关联 。在复杂疾病的遗传学研究中所用的遗传分析方法有: 连锁分析法、关联研究方法、微卫星方法、参数分析法、非参数分析法、患 病同胞 23 新疆医科大学硕士学位论文 对法和患者家系成员法。连锁分析是在有亲缘关系的个体中,通过检测某一性状和 遗传标记之间共分离的概率是否超过预期的随机概率,来定位疾病易感位点。连锁 分析常能将疾病的易感基因定位到染色体的一个较大的区域,甚至在不知道疾病的 生物学机制的情况下也能运用。但连锁分析需要获得相对完整的家系结构,主要用 于单基因研究,这限制了连锁分析在复杂疾病遗传因素研究中的广泛应用。关联研 究是目前应用最多的研究方法,即在无关个体中,通过比较病例组和对照组 之间的 [47] 等位基因频率来遗传变异对所研究的表型的作用 。关联研究常用来在最初连 锁所确定的基因组位置之上进行精细作图和定位。 关联研究在检测微效基因的效应 方面把握度更高,但需要更多的遗传标记。 这使得关联研究在复杂疾病的研究中有 着重要的作用和地位,逐渐成为复杂疾病致病基因研究的主要方法。关联研究通常 采用病例对照研究方法,基于的原理是检验一个遗传标志物在病例组中的频率是否 高于对照组。关联分析研究的优点就是样本容易收集,检出率高和分析准确。关联 研究虽然有一定的优越性,但是还存在一些缺点,最大的缺陷就是对照组的选择, 由于患病组与对照组之间的临床情况及基本的参数很难匹配,致使出现假阳性较高 的问题,所以在应用时能够扬长避短,科学地运用这种方法将会对我们的研究提供 很大的帮助。微卫星分析法是运用PCR 技术将简单重复的序列在体外扩增,由于重 复序列具的多态性的特点可用于遗传分析的研究,缺点就是不适用于复杂疾病的研 究。参数分析法属于连锁分析方法的一种,该方法利用似然方法估计似然比以用来 检测两个基因之间的重组率。非参数分析法也是连锁分析方法的另一种,此方法是 不受遗传模式的限制,是分析复杂的多基因疾病的好方法,主要是对家系中 的两个 患病人员比较他们来自共同祖先的同一等位基因的频率,来比较这两个等位基因之 间有无差异,两者之间统计学差异,则该等位基因是该疾病的致病基因。患者同胞 对法是非参数分析法的一种方法,此方法基于患者是同胞,主要将共同致病的基因 染色体进行基因型等位,找出染色体上共有的并且是大于理论值的区域,这个区域 就是致病基因的区域。患者家系成员法是非参数分析方法的另外一种,此方法是利 用家系里的所有成员,来分析所有个体在同一座位上的等位基因是否相同,如果相 同则致病基因就在这个区域。到目前为止还没有一个研究能够证实某一个基因确实 是原发性高血压的易感基因,由于科学技术和研究工具的出现,原发性高血压易感 基因的研究能够逐步向前发展,与此同时,由于流行病学的支持,使得原发性高血 压的易感基因的研究能够大力的开展工作,为建立高血压易感基因库必须应用分子 生物学的技术和方法,最终找到原发性高血压的易感基因。 2.2 基因关联研究中存在的问题 关联研究中通常会遇到许多问题,如候选基因的确定、中间表型的运用、单核 苷酸多态 single nucleotide polymorphism, SNP 的选择、单体型分析和关联研究结果 24 新疆医科大学硕士学位论文 的判定等。第一,候选基因的确定是将候选基因的序列变异作为遗传标记物,来分 析与疾病之间的关系。候选基因的选择是基于首先该基因与疾病之间有生物学联系, [47] 再者该基因与该疾病的已知的相关基因具有同源性 。第二,中间表型的应用是基 于一个较低水平的生理机制与更远的临床表型关联,对这个较低水平的表型的遗传 [48] 学分析将会显的更容易,因为它的遗传涉及较少的基因或变异 。第三,SNP 的选 择上有一定的难度,SNP 作为人类基因组中最丰富的遗传变异, 数量巨大,可能是 人类基因组中疾病易感基因的遗传标记,甚至是直接影响一些常见病的易感性基因 位点。目前许多高通量 SNP 检测方法应用到 SNP 的基因分型中,大大加快了人类 SNP 数据的增长。据估计,人类基因组中平均约每1000 个碱基就存在一个SNP,这 些SNP 位于基因的编码区或非编码区,可能与复杂疾病之间存在关联。然而对于候 选基因中数目较多的SNP 的选择目前还没有统一的答案。最早有人提议研究启动子 和基因编码区内的SNP[49] 。因为这些区域内的SNP 很可能具有功能意义,可能直接 [47] 影响所研究的性状,或者是这些SNP 与疾病易感的等位基因连锁不平衡 。另一些 [50] 人研究认为内含子的变异可以影响基因的表达,进而影响了基因的功能 。Collins 等研究显示非编码区或平均分布的高密度SNP 的连锁不平衡来寻找相关疾病的基因 [51] 位点 。 随着 SNP 检测和分型技术的不断完善和发展,最终有可能对多个高血压 [52] 候选基因的SNP,甚至全基因组的SNP 实现一次性、大规模检测 。第四,单体型 分析的应用是为了排除与疾病无关的 SNP,找出与疾病有关的SNP,这样可以避免 了由于SNP 得选择而造成的信息的丢失。目前人类基因组中大约有4 百万个常见的 SNP[53,54],使单体型分析在复杂疾病的研究中越来越得到广泛的应用[55,56] 。当 SNP [57] 与疾病进行大样本关联分析时,只对每一个单体型的少数几个SNP 进行分型 。由 于高血压属多基因遗传病,不是一种基因的改变,也不是一种基因单一部位的缺陷, 与高血压的相关性不仅是由某一单个基因位点(等位基因)起作用,可能是由于真 正的易感基因与某单体型连锁所致,所以研究单体型与EH 相关性的意义更大于单一 SNP 与疾病的相关性[58,59] 。第五,关联分析结果的判定出现阳性结果时应当考虑混 杂因素是否排除、统计学方法是否正确、对象的选择是否严格、是否与实际的人群 可信性、是否排除了假阳性。 2.3 原发性高血压候选基因的选择 原发性高血压候选基因的研究表明高血压是遗传因素和环境因素共同作用的复 杂的多基因遗传性疾病,原发性高血压所具有遗传异质性、迟显性和易感基因外显 功能不全性的特点,所以这些特点给原发性高血压的相关基因的研究带来了很多的 困难。原发性高血压候选基因的研究一直是科研人员所重视的。原发性高血压候选 基因筛查的策略:第一,全基因组扫描是利用短串联重复变异标志来确定家系中所 有成员染色体DNA 各标志位点基因型,通过连锁分析寻找与疾病连锁相关的基因位 25 新疆医科大学硕士学位论文 点。第二,中介表型途径是利用原发性高血压发生发展过程中早期出现的中间表型 特点用来筛查疾病的易感基因。第三,比较基因组学
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