蛋白质提取方法

蛋白质提取方法 来自龚欣的 1.2.1瓜蒌子饼粕的制取 先将瓜蒌子在65?恒温干燥箱中干燥3h，去皮。用捣碎机将瓜蒌子仁粉碎。利用微博辅助的方法去除粉碎仁中的油脂，有机溶剂为正己烷，操作时料液比1:7，中火，提油时间9min。之后提取液用真空泵抽滤，滤渣即为瓜蒌子饼粕。 1.2.2提取液浓度的选择 参考文献得出初步试验条件。按10:1的液料比，称取饼粕4g和量取HaOH提取液40ml，混匀于烧杯中。将烧杯被至于60?水浴锅内，同时设定烧杯内转子搅拌速度200RPM，提取蛋白120min。在0.05%，0.1%，0.5%，1%，1.5%五个水平下提取蛋白。将每个水平下的提取试验完成，后用冷冻离心机离心提取液，离心条件为12000r/min，4?，离心15min。离心完成，取上清液100ul于具塞试管1号中，用pH=6.81的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释100倍，因为浓度 -1为0.02~0.5mol?LpH为6.8的磷酸缓冲液为蛋白溶剂，对蛋白与考马 [7]斯亮蓝结合后的线性无影响，用漩涡混匀器混匀后取60ul溶液于具塞试管2号中，加入考马斯亮蓝溶液，漩涡混匀器混匀后在波长595nm下测吸光值，加考马斯亮蓝液到测吸光值的过程要在3min内完成，因为溶液刚倒入比色杯时，溶液吸光变化比较大，在3min到5min [7]内比较稳定。测三组平行吸光值，取平均值。用提前做好的BSA(牛 2血清白蛋白)标准曲线，R=0.991,回归方程y=0.007x+0.039，算的吸光值对应的蛋白量Pr。 A,0.039提取液蛋白含量Pr(ug)= 0.007 ——A，是提取液稀释后的吸光值 算得的五水平下提取液蛋白含量相比较。蛋白含量最高组对应的提取液浓度即是选定的提取液浓度。 来自任丽的论文 [9]1.2.1 瓜蒌籽种仁脱脂 将瓜蒌籽手工脱壳后将种仁破碎研磨成浆状，用其质量体积比1:7的正己烷微波萃取9分钟，为避免萃取瓶温渡过高产生安全隐患可将操作时间分三段进行，第一次4分钟，第二次3分钟，第三次2分钟。然后将得到的蛋白正己烷溶液进行抽滤，滤渣保存下来用于试验后面步骤种仁蛋白的提取，滤液为瓜蒌籽油脂正己烷溶液，正己烷可回收重复利用一次。此脱脂过程进行三遍。最后将脱脂粉于-60?冷冻干燥24小时，再磨成细粉直至通过60目筛子(0.3mm)，粉末于阴凉处保存用于种仁蛋白质的提取和加工性质、氨基酸、蛋白质二级结构的分析。 1.2.2 瓜蒌籽种仁分离蛋白的制备 使用传统的碱溶酸沉法获得分离蛋白。首先将瓜蒌籽种仁粉末用去离子水(w:v=1:10)溶解，得到的水溶液用1mol/L NaOH调pH值至10后在室温下用磁力搅拌器轻轻搅拌1h，于5000rpm、4?离心15min，此提取过程重复两次，以最大限度提取滤渣中的蛋白质。提取完成后将第一次和第二次提取的上清液均匀混合，用1mol/L HCl调pH值至4.5后在4?条件下保存1小时进行等电沉淀(清蛋白的 等电点约为pH=4.3，球蛋白的等电点约为pH=5.1，醇溶蛋白的等电点约为约为pH=4.7，谷蛋白的等电点约为pH=4.5)1小时后将得到的沉淀在5000rpm、4?条件下离心15min，用去离子水洗涤沉淀使蛋白恢复，然后将溶液的pH值调至7.0，60?下冷冻干燥48h，于4?贮存直至使用。