EB病毒的研究进展

BE病毒的研究进展 EB病毒（epstein-barr virus,EBv），又称人类疱疹病毒（Human herpesvirus 4 (HHV-4)）。是epstein和barr于1964年首次成功地将burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，故名。 病毒简介 EB病毒是Epstein和Barr于1964年首次成功地将Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，认为该病毒是多种恶性肿瘤（如鼻咽癌）的病因之一，它主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞。在中国南方鼻咽癌患病人群中检测到有EB病毒基因组存在。本病分布广泛，多呈散发性，亦可引起流行。病毒携带者和病人是本病的传染源。经口密切接触为主要传播途径，飞沫传播虽有可能，但并不重要。发病以15～30岁的年龄组为多，6岁以下多呈不显性感染。全年均有发病，似以晚秋初冬为多。一次得病后可获较持久的免疫力。 形态特征 EB病毒的形态与其他疱疹病毒相似，圆形、直径180nm，基本结构含核样物、衣壳和囊膜三部分。核样物为直径45nm的致密物，主要含双股线性DNA，其长度随不同毒株而异平均为17.5×104 bp分子量108。衣壳为20面体立体对称，由162个壳微粒组成。囊膜由感染细胞的核膜组成，其上有病毒编码的膜糖蛋白，有识别淋巴细胞上的EB病毒受体，及与细胞融合等功能。此外在囊膜与衣壳之间还有一层蛋白被膜。 传播途经 1、经口密切传播 2、飞沫传播 3、输血传播 引发病症　EB病毒感染引起的相关疾病： 非肿瘤性疾病 1．传染性单核细胞增多症   患者感染EBV后多数表现为IM。1968年首次发现该病毒是引起IM的病源 ，后经血清流行病学等研究得到证实。该病是目前所知道的由EBV直接引起的唯一疾病，有以下理论依据：(1)此种病毒只能在淋巴网状系统的细胞中生长增殖；(2)培养过程中该病毒能刺激淋巴细胞的增生；(3)急性期周围血淋巴细胞可培养出EBV；(4)患者血清中具有高滴定度EBV的特异抗体，并可长期存在；(5)无此特异抗体者对此病易感,而抗体阳性者则不发病。IM主要症状表现为：发热、咽痛、皮疹、肝脾淋巴结肿大，血液系统改变可以累及三系，但主要以白细胞改变较多，大多白细胞总数增高，可出现异常淋巴细胞。   2．口腔白癍   多发生在免疫功能缺陷病人。在病变上皮的上层可检测到EBV增殖期抗原及病毒DNA。   3．X染色体相关的淋巴增生综合征（XLP）   是一种罕见的与X染色体相关的免疫缺陷性疾病，仅见于男孩。EBV感染后常引发致死性IM或恶性淋巴瘤。   4．病毒相关性噬红细胞增多症   这是一种反应性组织细胞增多症。临床上主要表现有高热，肝、脾、淋巴结肿大，肝功能异常，凝血障碍，外周血常规全血细胞减少、无异形淋巴细胞，骨髓中吞噬红细胞现象多见。血清学检查有抗VCA-IgG和抗VCA-IgM、抗EA-IgG增高，但抗EBNA抗体缺乏,符合EB病毒急性感染表现。 肿瘤性疾病   1．Burkitts淋巴瘤   EBV是英国病毒学家Epstein及Barr等在1964年首次从非洲儿童Burkitt's淋巴瘤的细胞中分离出来，与Burkitt's淋巴瘤的相关性勿庸置疑。Burkitt's淋巴瘤分为地方性和散发性两种。前者主要见于非洲中部的儿童，病变部位多见于颌部，亦见于眼眶、中枢神经系统和腹部，小无裂B细胞为其形态特征。几乎所有的地方性病例都与EBV有关；而散发的Burkitt's淋巴瘤仅有15%-20%与EBV有关，近几年又发现了许多与EBV相关淋巴瘤的新亚型。   2．霍奇金病（HD）   传统上将其分4型：以淋巴细胞为主型、混合细胞型、结节硬化型和淋巴细胞消减型。其中混合型与EBV关系密切，病毒检出率可达96%，而结节硬化型及以淋巴细胞为主型的检出率分别为34%和10%。HD与EBV的关系的密切程度有地域及年龄差别。秘鲁、洪都拉斯、墨西哥等拉丁美洲国家HD中EBV的阳性率高于欧美国家。在中国，90%以上的儿童HD与EBV有关，特别是10岁以下的儿童病例95%检测到了EBV，且与组织亚型无关，许多资料显示,IM的患儿罹患HD的危险性是对照组的5倍。   3．鼻咽癌（NPC）   NPC是与EBV密切相关的恶性肿瘤中最常见的一种，也是研究报道最多的一种，中国南方是NPC高发区，儿童鼻咽癌的早期症状中由鼻咽原发灶所引起的症状并不明显，且病儿对由此引起的不适不懂申诉，加上一般临床医师对儿童病例认识不足，容易漏诊。虽然EBV与NPC的发生关系密切，但尚无动物实验单独EBV可引起上皮性癌，无法证明EBV是NPC的唯一病因。 其它疾病 除了以上介绍的与EBV关系比较密切的疾病外，还有一些儿科疾病中也查到EBV感染，如：与免疫功能受损有关的平滑肌肉瘤、大细胞间变性淋巴瘤、恶性组织细胞增生症、类风湿性关节炎、川崎病、肾小球肾炎、肾病综合征、病毒性心肌炎、心包炎、急性特发性血小板减少性紫癜、多发性硬化、病毒性脑炎、格林-巴利综合征、再生障碍性贫血、呼吸系统感染等疾病。 2 　致病机制 EB 病毒主要感染 B 淋巴细胞、上皮细胞 ,偶尔 感染 T/ N K细胞 ,故主要损伤人的免疫系统和上皮 组织而导致相应的疾病 ,其致病机制主要包括以下两 个方面 : 21 1 　干扰人体免疫 (1) EB 病毒的免疫逃避 : EB 病毒致病的一个重 要的条件是能够长期潜伏在人体中 ,在人体免疫力下 降时激活并增殖。这表明它具有逃避人体免疫攻击 的机制。Ko up6 ]认为 EB 病毒逃避机体免疫攻击的策略主要有 :1)在免疫特定部位进行复制 ; 2) 病毒的主要免疫表位突变以至表位特异性 C TL 无法识别 ;3)下调受感染细胞表面的 HLA 分子和/ 或粘附分子 ;4)下调病毒基因在受其感染细胞上的表达。 (2) 引起免疫紊乱 :陈慧[ 7 ]等人对传染性单核细胞增多症 ( IM)病人免疫功能研究的结果表明 ,在 IM急性期 , CD4+细胞、CD4+/ CD8+细胞显著下降 ,CD3细胞、CD8+细胞显著上升 ;对慢性活动性 EB病毒感染 ( CA EB 病毒) 病人的研究证实增殖的 EB病毒除感染 B 细胞外 ,还感染 T 细胞及 N K细胞 ,并存在自然杀伤细胞 (N K) 功能受损 , EB 病毒特异的CTL 在外周血中显著减少 , T/ N K细胞抗原性低下。Hi ro shi Kimura[ 8 ]等人认为 CA EB 病毒病人可根据感染是以 T 细胞为主还是以 N K 细胞为主而分两型 ,它们有不同的临床表现。CA EB 病毒患者有高浓度的 1 型辅助 T 细胞和抗炎细胞因子。这些细胞因子在两型中是相同的 ,但是在 N K 细胞感染型病人中 , IL213 的浓度比 T 细胞感染型高 ,且在外周血中有更多的病毒定居的单核细胞 ; EB 病毒相关淋巴细胞增生性噬血综合症 ( EB 病毒2HL H ) 也是由于 EB病毒感染 T 或/ 和 N K淋巴细胞 ,杀伤性 T 淋巴细胞(C TL )及 N K细胞失去清除被 EB 病毒感染的淋巴细胞的能力 ,致使淋巴细胞大量活化、增殖引起细胞因子的大量释放及其级联反应 ,从而激活巨噬细胞 ,诱发巨噬细胞吞噬血细胞[ 9 ]。这些免疫功能紊乱 (主要是细胞免疫功能) 是否就是 EB 病毒感染引起的 ,或者是被感染者本身存在免疫缺陷 ,而在 EB 病毒的诱导下而表现出来 ,或者还有另外的原因 ,目前还不是很清楚。每个个体对 EB 病毒感染的反应不同 ,这说明宿主自身可能存在某种特异质的遗传背景 (常常是基因缺陷)而使得某种严重情况易于发生】】 21 2 　致瘤 EB 病毒可以通过多个环节导致肿瘤的产生 ,其 主要作用在于其癌基因编码的潜膜蛋白 LM P1。具 体可从以下几个方面来说明 : (1)诱导细胞增殖 　在 EB 病毒永生化的 B 细胞系中 ,利用点突变分析表明 ,LMP1 有两个转化效应点 ( t ran sfo rmatio n effect sites , TES ) : TES1 和TES2。TES2 与肿瘤坏死因子受体相关因子死亡域( TRADD) 结合介导 N F2κB、A P1 活化 ,从而诱导 B细胞增殖[ 10 ]。此外 ,LM P1 模拟 CD40 活化 B 细胞 ,介导 J N K 信号活化 ,激活 N F2κB ,促进 B 细胞增殖[ 11 ]。LM P1 在不同的细胞中通过不同的信号通路介导细胞增殖。 (2)抑制细胞分化 EB 病毒与鼻咽癌分化有关。鼻咽癌中 A20 表 达与鼻咽癌分化程度有关[ 13 ],LM P1 可能是通过介 导 A20 表达 ,从而抑制鼻咽癌细胞分化。 (3)抑制细胞凋亡 在 H1299 上皮细胞中 ,LM P1 诱导 A20 表达 ,阻 断 P53 诱导的细胞凋亡[ 15 ]。将 LM P1 导入 J urka t T细胞的研究[ 16 ]表明 ,LM P1 表达下调 c2myc 表达 ,上调 bcl22 和 A20 表达 ,抑制 J urkat 细胞凋亡。LM P1 与 TRA F1 结合 ,组成性活化 CD40 受体诱导 bcl2xl , cdk4 和 cdk6 表达抑制 p27kip ,从而抑制 B 细胞凋 亡。 (4)诱导细胞永生化和转化 在 M EF 细胞中的研究[ 17 ]表明 ,LM P1 抑制 P16的表达 ,使细胞度过衰亡期 ,进入永生化 ,且具有癌细胞生长特征。在淋巴细胞中 ,LM P1 增强 B 细胞表面分子 活 性 和 粘 附 分 子 表 达。此 外 LM P1 介 导ER K1P2 活化 ,通过 Ra s 通路 ,介导 MA P K激活 ,而Ra s 激活为 Rat21 细胞转化所必须。 (5)诱导端粒酶的激活 LM P1 可诱导 c2myc 表达从而活化人端粒酶逆 转录酶 ( human telomera se rever se t ranscrip ta se , H TER T) 。研究表明[ 14 ],端粒酶重新激活是防止染 色体端粒程序缩短、促使细胞癌变的关键环节 ,与肿 瘤发生、发展密切相关。 (6)介导肿瘤细胞转移 在鼻咽癌中 LM P1 与 MM P9 表达呈正相关 ,而 MM P9 与鼻咽癌转移有关。体外细胞基因转染证实 LM P1 可上调 MM P9 的表达。LM P1 可能是通过上 调 PPM9、整合素α、β3、β5 的表达协同作用 ,参与肿 瘤细胞的浸润与转移。 (7) EB 病毒 DNA 整合与细胞癌变 高建明的研究[ 18 ]发现 ,EB 病毒整合与染色体异 常紧密相关 ,说明病毒整合对细胞癌变具有重要的生 物学意义。既往的研究证实 ,在 Burkit t 淋巴瘤或其 它淋巴瘤[ 19 ]、体外建立的 EB 病毒感染的鼻咽癌细胞[ 20 ]、EB 病毒转化的淋巴母细胞中均存在 EB 病毒DNA 在染色体上的整合。EB 病毒整合位点通常处 于染色体易位的断裂点附近 ,或在消色差的沟状损伤 处 ,即染色体脆性位点 ( f ragile sites , FSs) 。 检测方法 1．嗜异性凝集试验 用于IM的辅助诊断。若抗体滴度超过1:80则有辅助诊断意义 2．特异性抗体检测 这是临床诊断最常用的方法之一。检测EBV的VCA-IgG和EA-IgA抗体，抗体滴度≥1:5～1:10或持续升高，对鼻咽癌有辅助诊断意义 3、特异性蛋白及EBV核酸检测 应用间接免疫荧光法检测细胞中病毒核抗原EBNA。若采用单克隆抗体替代多价血清，敏感度会更高。 4、应用核酸杂交和PCR检测病变组织中EBV DNA，敏感性和特异性均高。但目前临床实验室尚未普遍使用。 诊断方法 用血清学方法检测 EB 病毒特异性抗体， 是早 期发现鼻咽癌患者的重要手段。 免疫荧光和免疫酶 法两种方法以固定细胞作为抗原的来源， 在显微镜 下逐一判断结果，方法较繁琐，且在结果判定上带有 一定的主观性，影响了检测方法的特异性和敏感度。 近年来， 建立的 ELISA 检测人血清 EB 病毒相关抗 原的抗体，较细胞涂片方法简单、敏感。 EB 病毒基因表达的蛋白比较多，在潜伏期病毒 不进行复制，细胞主要合成核心抗原(EB virus asso- ciated nuclear antigen，EBNA) 和潜伏膜蛋白 (latent membrane protein, LMP)， 在裂解期病毒基因完全表 达，细胞主要合成早期膜抗原、早期细胞内抗原(ear- ly intracellular antigen，EA)，衣壳抗原 (EB virus cap sid antigen，VCA)。 由于大部分单个 EB 病毒相关抗 原的抗体检测灵敏度或特异性偏低， 不能满足临床 需要。 近年来理论上和实践上都提倡一次同时测定 多个抗体，以提高灵敏度或特异性。