【doc】EPO基因修饰MSCs对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的治疗作用
EPO基因修饰MSCs对新生大鼠缺氧缺血
性脑损伤的治疗作用
重庆医学2009年11月第38卷第22期
?
论着?
EPO基因修饰MSCs对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的治疗作用 王文益,赵聪敏,廖伟,张红
(1.第三军医大学新桥医院儿科,重庆400037;2.解放军第三二四医院儿科,重庆400020)
2787
摘要:目的移植促红细胞生成素(EP0)修饰的骨髓间充质干细胞(MSCs)至新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBD)大鼠,观察
移植细胞EPO的表达及向神经元分化情况,为治疗缺氧缺血性脑病提供实验基础.方法构建大鼠EPO的真核表达质粒pEG—
FP-N1/EPO,用脂质体2000转染大鼠骨髓间充质干细胞,免疫组化和RT-PCR检测EPO表达,然后移植7dHIBD大鼠,免疫组
化检测体内EPO表达及MSCs向神经元分化情况.结果酶切和测序鉴定证实重组表达质粒正确,该质粒体外转染大鼠MSCs
后可表达EP0,移植EP0修饰的MSCs体内能表达EPO,部分表达神经元特异标记神经特异性烯醇化酶(NSE).结论EPO修
饰的大鼠MSCs能在新生HIBD大鼠中存活并表达EPO,部分移植细胞呈现向神经元分化的趋势,对新生HIBD大鼠有治疗作用.
关键词:促红细胞生成素;真核表达载体;骨髓间充质干细胞;缺氧缺血性脑病;神经元
中图分类号:R365.741文献标识码:A文章编号:167卜8348(2009)22—2787—03 TherapeuticeffectofEPOgenemodifiedMSCsonHIBDrat
WANGW—,ZHAOCongrainIA,LIAOWP,eta1.
(DepartmentofPediatrics,XinqiaoHospital,MilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China;
2.324HospitalofPLA,Chongqing400020,China)
Abstract:ObjectiveTotransplantEP0modifiedMSCstonewbornhypoxic—
ischemicbraindamage(HIBD)rat,andtoobserve
theEPOexpressionanddifferentiationtoneuronoftransplantationcellforprovidingthebasistofurtherstudyonthetreatmentof
HIBD.MethodsWeconstructedeukaryoticexpressionplasmidvectorpEGFFN1/EP0,MSCscellsweretransfectedwiththe
plasmidusingLipofectamine2000.ThentheexpressionofEPOproteinwasdetectedbyimmunohistochemistrytechniquesandRT—
PCR.ThenwetransplantedMSCstoHIBDrataged7d,detectedtheexpressionofEPOproteinanddifferentiationtoneuronof
transDlantationcel1ofMSCsbyimmunohistochemistrytechniques.ResultsTheconstructedrecombinantplasmidcontainedthese
quenceofratsEPOgene.Aftertransfectionwiththeplasmid,EP0proteincouldbeexpressedinMSCscellsinvivoandinvitro,
partitionMSCscouldexpressspecificitymarkerNSEofneuron.ConclusionEPOmodifiedMSCsofratcansurviveinnewborn
HIBDratandexpressEPO;partitionMSCspresentthetendencyofdifferentiationtoneuron. Keywords:erythropoietin;eukaryotieexpressionplasmid;MSCs;hypoxic—
ischemicbraindamage;neurons
促红细胞生成素(EP0)是一种耐热的酸性糖蛋白,能促进
造血祖细胞增殖分化.近年来发现其具有阻断兴奋性氨基酸
的毒性,抗神经细胞凋亡,抑制炎症反应,促进新生血管形成等
效应,在脑损伤的神经保护中起重要作用.因此,作者构建真
核表达载体pEGFP-N1/EPO并转染骨髓间充质干细胞(rues—
enchymalstemcells,MSCs,检测其EPO的体内外表达,并移
植MSCs至新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic—ischemicbrain
damage,HIBD)大鼠,检测MSCs分化为神经元情况及大鼠行 为学改善情况,为进一步探讨治疗缺氧缺血性脑病提供实验基 础.
1
与方法
1.1主要材料及试剂克隆宿主菌E.coliCompetentCells JM109和克隆载体质粒pEGFP—N1购自Invitrogen公司, RNAreagent反转录酶,琼脂糖,引物,HighFidelityPrime ScriptTMRTPCRKit,PrimeSTARHSDNAPolymerase,
PrimeSTARHSDNAPolymerasewithGCbuffer,TaKaRa
AgaroseGelDNAPurificationKit,TaKaRaDNAA—Tailing Kit,TaKaRaDNAFragmentPurificationKit,TaKaRaDNA
IigationKit,pMD19-TSimpleVector,HindIlI,KpnI内切酶
及标准胎牛血清均购自天津TBD公司,DMEM/F12培养基购 自美国Hyclone公司.Lipofect2000购自Invitrogen公司,质
粒小量提取试剂盒及去内毒素质粒小量提取试剂盒购自北京 博大泰克公司,抗大鼠CD44,CD45,CD90抗体购自美国santa 公司,抗大鼠EPO单克隆抗体购于美国R&D公司,神经特异 性烯醇化酶(NSE)抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司, G418购自美国Gibco公司,实验动物购自第三军医大学实验 动物中心.
1.2方法
1.2.1目的基因的获取及RT_PCR从大鼠肾脏组织中提取
EPO的TotalRNA,由大连宝生物技术有限公司
合成4
条引物:上游引物F:5CAGCAGCCAGGCGCGGAGAT 3,下游引物R:5,_TGGAGGGTTGGCGTGACACAGT一
3.在引物中加入HindllI/KpnI酶切位点.使用HighFidel—
ityPrimeScriptTMRrr_PCRKit,取lgI大鼠肾脏组织提取的
,以R引物进行反转录,反应程序: EP0的TotalRNA为模板
65?预变性5rain,冰上放置2min后,加入PrimeScript
RTase,30?反转录10rain,42?延伸30min,95?灭活反转录 酶5min,然后以上述的反转录液为模板,F/R为引物,加入 PrimeSTARHSDNAPolymerase进行PCR扩增,反应程序: 94?预变性3min,98?变性10s,60?退火5s,72?延伸Imin, 基金项目:重庆市自然基金资助项目(CSCT,2007BB5057)及重庆市2009
生育自然基金资助项目(2009C175).
通讯作者,电话:68774602;E—mail:zhao一54@163.corn. 2788
3O个循环,末轮循环72?聚合lOmin.
1.2.2PCR产物纯化(1)使用TaKaRaAgaroseGelDNA PurificationKitVer.2.0切胶回收上述的PCR产物;(2)使用 TaKaRaDNAA-TailingKit上A处理;(3)使用TaKaRaDNA FragmentPurificationKitVer.2.0精制,命名为RPO-RT- PCR.
1.2.3测序分析克隆测序:使用TaKaRaDNALigationKit 中的连接酶,将RPO—RT-PCR与pMD19一TSimpleVector连 接后,热转化至E.eoliCompetentCellsJM109中,涂布平板, 37?过夜培养.挑选阳性菌落植菌,提取质粒并命名为RP RT_PCR_1,RPRT_PCR_T一2.送大连宝生物公司,对 RP()_RT—PCR—rr_1,RPO-RT—PCR—T2质粒测序.测序结果表 明,RPO-RT—PCR_rr_2质粒符合预期
.
1.2.4目的基因亚克隆
1.2.4.1用HindllI和KpnI双酶切RP()IRT—PCRT一2质粒 及载体pEGFP-N1(一).TaKaRaAgaroseGelDNAPurifica— tionKitVer.2.0切胶回收目的片段,并取1L进行琼脂糖凝 胶电泳.
1.2.4.2克隆及酶切验证(1)克隆:使用TaKaRaDNA LigationKit中的连接酶,将目的片段与pEGFP—N1Vector连 接后,热转化至E.coliCompetentCellsJMlO9中,涂布平板,
37?过夜培养.挑选阳性菌落植菌,提取质粒并命名为pEG FP—N1/EP0质粒.(2)酶切验证:使用HindIlI/KpnI对 pEGFP—N1/EP0质粒进行双酶切鉴定,全量电泳;重组子插入 片段的序列测定由上海生工公司协助完成.
1.2.5pEGFP—N1/EPO体外表达将细胞数对数生长期的 MSCs细胞流式细胞仪鉴定纯度,以1×10/孔浓度接种于6 孔板,待细胞融合达9O以上时,按脂质体2000转染常规步 骤进行基因转染.转染后24~48h将贴壁生长细胞行EPO免 疫组化染色,观察pEGFP-N1/EPO质粒转染后在细胞内EPO 的表达情况.收集细胞行RT—PCR,检测细胞中的EPOmR— NA表达情况.
1.2.6HIBD大鼠模型的建立参照Rice法,选择P7SD大 鼠,乙醚吸人麻醉后,置仰卧位,四肢头部固定,75酒精消毒, 做颈部正中切口,分离并结扎左侧颈总动脉,缝合皮肤后置于自 制1L容积缺氧仓内,以氧氮混合气(氧浓度为8)1,2L/rain 持续灌注2.5h,制成HIBD模型.缺氧仓置于恒温水浴箱中,维 持环境温度在37,37.5~C.缺氧后将新生鼠放回母鼠身边常 规喂养.缺氧缺血后出现自发左旋或夹尾左旋者纳入实验. 1.2.7移植MSCs至HIBD大鼠模型并检测体内EPO表达, NSE表达G418(浓度300~g/mL)筛选转染EPO基因的 MSCs,移植至7d龄HIBD大鼠脑组织,7d后冰冻切片行EPO 及NSE免疫组化染色,观察移植MSCs细胞EPO表达及分化 为神经元情况.
1.2.8移植大鼠远期学习记忆功能检测各组新生鼠饲养至 1月龄时用Morris水迷宫测试学习记忆功能.Morris水迷宫 组成:由圆形水池和自动录像记录系统两部分组成.水池为直 径120cm,高50cm,水深30cm的圆形,水温保持(23?1)?,池 壁上标记4个等距离点N,E,S,W,分水池为4个象限(NW, WS,SE,EN),任选一象限在中央放置平台(平台与池壁圆心距
离相等),平台无色透明,直径12cm,高29cm,没于水下lcm. 测定前将鼠头用染发剂染黑,向泳池内加入奶粉(浓度为0.5 ,
1.5),使水呈白色不透明,平台不可见.迷宫外视觉线索 相对固定(包括工作台,椅子,门,窗,
架及电灯等).自动录 像记录系统以电脑为核心,以图像采集卡,摄像机,图像监视器 重庆医学2009年11月第38卷第22期
等为主要扩展硬件,同步纪录大鼠运动轨迹.利用图像软件包 可完成数据采集和统计处理.
测试分为三部分:(1)定位航行实验(placenavigation).
训练前24h将大鼠放人水迷宫中自由游泳3min以熟悉迷宫环 境.实验历时4d,每天在固定时间分上午,下午两个时间段, 每个时间段训练4次.将平台置于SE象限,分别从池壁4个 象限的中点放入水池,记录大鼠从入水至爬上平台的时问,即 隐匿平台逃避潜伏期(escapelatency,EL),至90s找不到平台, 即将引其上平台,EL记为90s,让大鼠在平台上休息30s,取4 次训练EL平均值.取实验第4天EL,计算各组均数.隐匿 平台EL反映动物获得经验的能力,即学习能力.(2)空间探 索实验(spatialprobe).第5天进行空间探索实验,撤除平台, 将大鼠随机从某一象限池壁中点头朝池壁放入水中,记录 2min穿越平台的次数.空间探索实验反映动物保持经验的能 力,即记忆能力.(3)可见平台实验.为排除大鼠运动和感觉 功能不同对实验的影响,第6天行可见平台实验,使平台露出 水面,观察大鼠EL.
1.3统计学方法所有数据以SPSS10.0统计软件分析处 理.所有数据以j?S表示,两组间比较采用独立样本t检验, 多组间比较采用单因素方差分析.以P%0.05为差异有统计 学意义.
2结果
2.1基因扩增结果以大鼠EPO的cDNA为模板,以F/R 为引物进行2次PCR,扩增得到约750bp的片段(图1). DNA序列测定表明扩增片段的核苷酸序列与GenBank上的 EPO编码区基因完全一致.
lI^1
一图1大鼠EPOcDNA琼脂糖电泳
2.2重组质粒pEGFPN1一EPO的鉴定
2.2.1双酶切验证使用HindUI/KpnI对重组质粒pEGF— PN1一EPO进行双酶切鉴定,全量电泳,产生与pEGFPN1,EP— OcDNA大小一致的片段.
2.2.2测序鉴定重组质粒pEGFP-N1/EPO送上海生工公 司测序,测序结果显示重组质粒pEGFP—NI/EPO中插入的 EP0序列与GenBank上的EPO编码区基因完全一致. ??AB
A:MSCs胞核染成淡蓝色,胞浆染成红色,为表达EPO所致(免疫 组化和HE复染×400);B:部分MSCs分化,胞核染成淡蓝色,胞浆及 胞膜染成赭色,为表达nestin所致(免疫组化和HE复染×400) 图2EPO及Nestin在HIBD新生大鼠脑组织中的表达 2.3大鼠MSCs流式细胞仪鉴定大鼠P5MSCs流式细胞 重庆医学2009年11月第38卷第22期
仪鉴定,CD44,CD90表达阳性;CD45表达阴性.
2.4EPO及Nestin在HIBD新生大鼠脑组织移植MSCs冰 冻切片中的表达脑组织冰冻切片示移植细胞细胞质内EPO 呈阳性反应,部分细胞nestin呈阳性反应(图2). 2.5EP0在MSCs细胞中的表达重组质粒pEGFP—N1/ EPO在脂质体Lipofectamine2000介导下转染MSCs细胞,将 转染后的细胞爬片行EPO免疫组化染色,结果显示,细胞质内 呈阳性反应(图3).提取转染后的细胞行RT-PCR检测细胞 中的EPOmRNA表达情况,能扩增出和目的片段大小一致的
片段(图4).表明pEGFP—N1/EP0质粒转染MSCs细胞后可 表达EPO蛋白.
?0鱼B
分泌EPO胞浆染成红色A,MSCs胞核染成淡蓝色(B),为含所致 (免疫组化和HE复染×200)
图3转染重组质粒pEGFP—NJ/EPO的大鼠
MSCsEP0的体外表达
1
PCR产物. M:DL2,000DNAMarker;1:RT—
图4转染重组质粒pEGFP—N1/EPO的大鼠MSCs EPOmRNARTPCR
2.6移植大鼠远期学习记忆功能检测结果(表1). 表1Morris水迷宫实验结果
与缺氧缺血组比较,?:P<0.01,??:P<0.001,AAG:P>0.05
与假手术组比较,:P%0.05,一:P<O.001,…:P>0.05. 3讨论
新生儿HIBD发病率高,是造成新生儿死亡和儿童永久性 神经功能障碍的重要原因.其发病机制尚不完全清楚,目前仍 缺乏有效的防治手段.
EPO是一种酸性糖蛋白,能刺激红系祖细胞增殖,分化与 成熟,1985年人类cDNA被成功克隆,并利用基因重组技术制 成重组人促红细胞生成素(recombinanthumanerythropoietin,
rHuEpo)用于l床贫血治疗.目前发现EPO不仅影响造血系 统,而且在应激时对机体发挥重要的保护作用,有利于生物体 保持各系统稳态.
在动物实验中,Kim等?亦发现,对于缺氧缺血7日龄大 鼠,EPO治疗保护了损伤侧大脑体积,降低了损伤侧大脑室管 2789
膜下区(SVZ)的扩展,显着改善了大鼠受损前肢的活动情况.
Mizuno等啪研究发现,对于新生3d大鼠缺氧缺血所致的脑室 周围白质损伤,低剂量的EPO预处理,可能经靶向作用于少突 胶质细胞祖细胞而发挥减轻白质损伤的作用.而Chen等比 较在造血系统存在EPO-R而中枢神经系统不存在EPO-R的大 鼠和正常的大鼠,发现EPO能刺激神经祖细胞的增殖,影响神 经元发育;并且能促进卒中后大鼠神经集落向受损伤区域的迁 移.Spandou等]在围产期窒息引起的HIBD模型中证实,EPO 通过抗凋亡机制来减少脑损伤程度并提高脑恢复功能.Kumral 等5]在HIBD新生大鼠模型中也发现,EPO可以下调凋亡基因 bax和DP5的表达来保护神经细胞的活性.最近Gunnarson 等研究表明,大脑的神经胶质细胞上存在4型水通道蛋白 (AQP4),EPO可以对抗谷氨酸引起的神经胶质细胞AQP-4的 通透性增加,从而减轻由此所导致的脑水肿.此外,EPO治疗降 低了IL-6,TNF-a水平l7],降低了单核细胞趋化蛋白l(MCP-1) 的浓度,显着降低了星形细胞的活性并阻止白细胞,小胶质细胞 进入梗死区,提高了大鼠血循环IL-10的水平].
MSCs是来源于骨髓的具有多种分化潜能的干细胞,具有 取材方便,免疫原性低,成本低等诸多优点.目前许多动物实 验和临床研究表明,MSCs对于脑损伤有较好的治疗疗效. Bang等_9将3O例大脑中动脉脑梗死的患者随机分为MSCs 移植组和对照组,1年后观察神经缺损的改变和功能的改善, 并对每组中的5例进行连续的神经影像观察,结果表明,移植 组神经功能的改善与对照组相比差异有统计学意义,没有发现 明显的不良反应.Liu等_】移植大鼠MSCs至生后7dHIBD 大鼠侧脑室,BrdU示踪移植的细胞,发现移植的MSCs能到达 受损脑区并存活,同时HIBD大鼠学习记忆能力较对照组改 善,差异有统计学意义,该研究同时提示该效应可能是移植的 MSCs调节大脑的IL一6,Fas及BDNF,使之处于一合适的水平 所引起的.吴永超等报道MSCs能表达脑源性神经营养因
子(brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)和神经生长因子 (nervegrowthfactor,NGF),并且随MSCs细胞培养时间的延 长,培养液中BDNF和NGF的含量相应增加.Mendonca 等将自体骨髓间充质单核细胞经动脉移植治疗急性缺血性 脑卒中患者,发现也是安全有效的.综上所述,在脑损伤发生 后,MSCs可能在损伤区域局部细胞因子的趋化作用下到达受 损区域,并分泌多种神经营养因子,促进神经前体细胞的增殖, 分化和迁移,从而上调脑的局部可塑性,以利于损伤修复;同 时,作为多能干细胞,其自身亦可能部分分化为神经细胞,发挥 替代部分神经元的效果.
基于此,作者把EPO和MSCs结合起来,利用EPO抗神 经元凋亡,神经营养保护和对神经干细胞的促迁移,增殖,分化 等作用;MSCs分化为神经元的功能,及分泌促进神经前体细 胞增殖,分化和迁移的细胞因子的作用;协同治疗HIBD;构建 了pEGFPN1一EPO真核表达质粒,并将其转染大鼠MSCs,移 植至新生HIBD大鼠模型;验证其体内外EPO的表达,移植的 部分MSCs分化为神经元的情况,结果表明EPO修饰的大鼠 MSCs能减轻HIBD大鼠的脑损伤,改善学习记忆功能,取得 了令人鼓舞的阶段性结果,从而完成了重组EPO基因MSCs 移植治疗HIBD的第一步工作,为下一步临床治疗提供了实验 室基础和新的治疗方法.
参考文献:
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atesbraininjury,subventricularzone(下转第2792页) 2792
MAP一2的表达对于树突的分化是必需的,其磷酸化状态对神 经元突起生长是非常重要的.本实验对MAP_2免疫组化定 量结果表明,非干预组患侧海马CA1区表达较假手术组明显 减少,提示缺血缺氧后神经元受到损伤,MAP一2磷酸化障碍,
微管的不稳定性增强,微管聚合作用下降,这样必然会导致细
胞骨架完整性遭到破坏,树突崩溃,发育停止,突触连接中断,
突触结构和功能受到影响.给予EE干预后早期干预组和晚
期干预组海马CA1区MAP2的表达均增高,提示EE对大鼠
海马cA1区有保护作用,可以使树突生长和受损细胞结构恢
复,在一定程度上能阻止HIBD的病理过程.实验发现早期干
预组MAP-2的表达高于晚期干预组,说明早期应用EE干预
对阻止神经元损伤,促进已受损细胞的修复作用优于晚期应
用.MAP-2在海马表达的变化可能参与了脑发育不同阶段
EE对HIBD神经可塑性的影响机制,而这种表达变化的原因
尚不清楚,可能与不同发育阶段脑中MAP一2磷酸化状态不一
致有关.
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