【doc】嗜热四膜虫的着丝粒蛋白检查
嗜热四膜虫的着丝粒蛋白检查
8l1
动物学研究1996,17(4):495--499CN53-1040/QISSN0254—5853 ZoologicalResearch
嗜热四膜虫的着丝粒蛋白检查
吴传芬代嘉陵杨新林李靖炎王永潮--
t—————1
(北京师范大学生物系100875)
一,,
(?中国科学院昆明动物研究所细胞与分子进化开放研究实验室昆明650223)/~?///?v/一
厂I摘要目前国际上的着丝粒蛋白研究工作几乎全是以酵母和高等生物为材料进行的.为了
从起源与进化的角度考察着丝粒蛋白,我们以人喉癌培养细胞HeplI作为对照材料,以两种
ACA血清和CENPB单抗,多抗以及CHO动粒蛋白单抗为探针,用间接免疫荧光和免疫印
迹技术对嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)作检查.免疫荧光结果
明,HeplI细胞的
着丝粒抗原在问期核中呈点状分布:与HepII细胞的不同,嗜热四膜虫的着丝粒抗原在间期核
中的分布呈不规则的斑块状.免疫印迹结果表明,作为单细胞生物的纤毛虫虽然在进化上距离
哺乳动物和人甚远,但却已具备了与哺乳动物和人的相似的着丝粒/动粒点抗原蛋白这说明
着丝粒和动粒的蛋白组分可能是发生得很早的,而且是相当保守的.
关键词四膜虫,着丝粒蛋白,ACA血清
-——
一————————一
为要更深刻地认识和理解典型真核细胞着丝粒的结构与功能,就需要从它的起源与进
化的角度来进行考察.对此国际上迄今尚无专门的系统研究,我们对着丝粒和动粒的一些
蛋白组分的起源与进化开始进行探索.
目前国际上的着丝粒蛋白研究工作几乎全是以酵母和高等生物为材料进行的.由于酵
母属于真菌,从分子进化的研究结果来看实际上已经相当高等,而且国际上对它们的着丝
粒也已做了大量的工作,因此我们用比酵母低等得多的原生动物为研究材料,而以人的喉
癌培养细胞口Pp?作为对照.
在原生动物中,纤毛虫是最高等的类群.其细胞内有十分复杂和特化的细胞器;其细
胞核分化成大核和小核两种形式.大核与小核在体积上悬殊很大;在功能上大核为营养
核,小核为生殖核.我们以嗜热四膜虫作为代表材料.这里我们用两种ACA血清和 CENPB单抗,多抗以及CHO动粒蛋白单抗对嗜热四膜虫作检查. 1材料与
1.1材料'
Hepl~细胞用1640培养基培养,加入谷氨酰胺至0.03%,胎牛血清至10%,青霉素 和链霉素分别至100u/ml.在37?CO2培养箱内用培养瓶作单层贴壁培养. 昊传莽现在地址:美国Texas大学,MDAndersonCancerCenter分子遗传学系.Houston.Texas77030
率文1995年7月29曰收到,同年11月28日修回
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嗜热四膜虫(Tetrahymenathermo如)SB225虫种由北京大学生物系陈阅增教授实 验室惠赠.在30~C恒温条件下作悬浮培养.培养基:2%蛋白胨,1%酵母粉. 1.2方法
1.2.1间接免疫荧光染色与吴传芬等(1996)相同.
1.2.2免疫印迹与吴传芬等(1996)相同.
电泳及印迹用我们改进后的方法(吴传芬等,1996).但是我们在工作中发现,在制 SDS—PAGE蛋白样品时必须先脱去纤毛,否则会强烈干扰蛋白的电泳分离. 脱纤毛处理:收集细胞并悬浮于l0ml10mMTris—HC1,pH6.8溶液中,加入2OmI 50mMNaAC,2ml100mMEDTA,0.6ml1M氯化钙.缓慢搅拌均匀,冰浴放置 5min.离心收集细胞沆淀,用Tris—HC1pH68buffer洗涤即成.
一
抗与吴传芬等(1996)相同.
二抗与吴传芬等(1996)相同.
2结果与讨论
嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)按照Kudo的分类隶属原生动物门,纤毛虫 纲(ClassCiliata),全毛目(OrderHolotricha),前口虫科(FamilyFrontoniidae),四 膜虫属,梨形四膜虫复合种(Tetrahymenapyriformiscomplex)中的嗜热四膜虫种.嗜 热四膜虫的细胞呈梨形,长约50pm,宽约3Om;l:l器位于细胞近前端,l:l器内有3个 小膜,口边缘有1个波动膜(这就是四膜虫的"四膜").大核近乎呈圆形,直径约 10pm,位于细胞中央,小核位于大核附近,直径约15—2pm.
2.1间接免疫荧光染色
经过免疫荧光染色后,嗜热四膜虫的大核和小核都染上了色,但不能分辨出细小的前
着丝粒小点,而只能看到一些不规则的点状物,似由几个小点聚集成的.由于荧光很弱,
未能照相.
2.2免疫印迹
22.1ACA血清印迹结果用ACA血清作免疫印迹检查,嗜热四膜虫的全细胞蛋白样
品中有许多蛋白带被血清中的抗体所识别(图lc).在分子量约l4—35kD区段和80kD
以上区段的反应带与Hep]]细胞的是一致的在35—8OkD区段,则比Hep]]的带要少
一
些(图2).
嗜热四膜虫的SH血清印迹结果与Hep]]细胞的SH血清印迹的也基本相似,而且在
ACA血清反应中没有显示出来的有些带在SH血清的反应中显示出来了(图2).可以认
为,嗜热四膜虫含有的ACA血清抗原蛋白与Hep[1的是相似的. 2.2.2多抗ra—ACA一2的印迹结果嗜热四膜虫对多抗ra—ACA一2的反应与Hep[1的是
一
致的(图3).它含有与Hep[1的CENPB极相似的蛋白.
2.2.3单抗mACA一2的印迹结果用单抗mACA2作印迹检查后得到3条阳性反应蛋
白带,比Hep~[的多1条分子量更高的弱反应带(图4).着色深的带大约为8OkD,其 余两条带的分子量难于准确估计,但都比较高在ra—ACA2多抗的印迹结果中没有发
现这两条带,因而它们极有可能是具有与CENP—B氨基酸相似结构的非CENP—B蛋
白.四膜虫对CENP—B抗体的反应与Hep]]的没有多大差异.
4期吴传芬等:嗜热四膜虫的着丝粒蛋白检查497
2.24mAb37A5的印迹结果嗜热四膜虫对mAb37A5的反应只有1条阳性带,与 Hep[I的有所不同,而且分子量也比Hep]71的两条都低些(图5).其原因尚不清楚. 97
B7kB
43如
30kD
17kD
图IACA血清的免疫印迹结果
Fig1Theresultoftheimmuno—blotting detectionbyACAantiserum a
分子量蛋白(standardproteinsforJdenti.
1yingmoleeularweightshb.Hep]~}c嗜热四膜 虫{therm,)血)
g
B7kD
4d
如
lT
3ab
图3CENPB多抗ra
ACA-2的印迹结果
Fig.3Theresultofthe immunoblottingdetection bypolyclonalantibody, raACA2,againsthu—
manCENPB
a标准分子量蛋A(standardpro. teinsforidentifyingmole—
cularweigh
b嗜热四膜虫(thermo砷妇)
如
BT妨
4D
3OkB
17kD
2
~
80kB
50kn
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图2SH血清的印迹结果
Fig2Theresultoftheimmunoblotting
detectienbySHantisegtl/ll
a嗜热四膜虫(therm~,妇)j
bF?.
图4CENPB单抗mACA
2的印迹结果
Fig4Theresultofthe immunoblottingdetection bymonoclonalantibody, mACA2,againsthuman CENPB
a标准分子量蛋A(standardpro, teinsforindentiingmole—
cularweighbj;
b嗜热四膜虫(thermo砷妇)
97
E7kD
43k9
30
l7kB
图5mAb37A5单抗的印迹
结果
Fig5Theresultofthe
immunoblottingdetection
bymonoclonalantibody,
mAb37A5,againstthe
kinetochoreproteinof
CHOcelI
a嗜热四膜虫(therm~ilah
b.标准分子量蛋A(standardpro.
jnsforidentiingmole—
cularweights).
动物学研究7卷
迄今所知的关于纤毛虫的着丝粒蛋白工作有两个,一个是美国Cox等人用Cen一2
ACA血清对梨形四膜虫所作的检查,发现其着丝粒含有14kD和23kD两种蛋白(Cox
等,1985,Cox等,1983).另一个是王永潮教授等用自己筛选的ACA血清对草履虫所 作的荧光染色,发现其小核是阳性反应.这与我们得到的部分结果是一致的. 从上面的实验结果看出,作为单细胞生物的纤毛虫虽然在进化上距离哺乳动物和人甚
远,但却已具备了与哺乳动物和人的相似的着丝粒/动粒点抗原蛋白.这说明着丝粒和动
粒的蛋白组分可能在进化上发生得很早,而且相当保守.现有的文献资料表明,一些纤毛
虫小核的中期染色体已有着丝粒和动粒的形态分化.因此,上述的结果并不难理解.
参考文献
吴传芬,李靖炎,代嘉陵等,】996涡鞭毛虫(甲藻)着丝粒/动粒蛋白的检查动物学研
究,17(3):307—3I3
CoxJVObnstedJRI985.MolecularBiologyoftheCytoskeletort.ColdSpringHaboutLabratroyPress71—77
CoxJVSchenkEAOImstedJB.1983Humallanticcntromereantibodies:distribution,eiaaracterizationof
atttigensandefficientoNmicrotubuleorganizatiortCell35:331339
THEDETECTlONOFCENTROMEREPRoTEINSlN
Tetrahymenathermophila
WuChuanfenDaiJialingYangXinlin@LiJingyan$WangYongchao.
(:l,DeptBiology.BeijngNormalUniversity.Bei)ng100875)
(LohoratoryofCellularandMolecularEvolution.KunmingInstituteofZoologytheChineseAcademySciences
Kunmingyunnan650223)
Abstract
UPtonow.thestudiesonthecentromereproteinsayealmostcarriedoutinyeastand higherorganismsintheworld.Inthispaperwereportourstudiesoncentromereproteinsin onekindofciliateswhichlsmuch1owerthanyeastintheevolutionarypositionmainlywith indirectimmunoftuorescentmicroscopyandwesternimmunoblottingtechniquesusingtwo ACAsera,ra—ACA一2,mACA一2,andmAb37A5asprobesThecontroImaterialinthe
studyishumanHep[Jcell
WithimmunofluorescentstainwithChineseACAantiserum.intheinterphasenucleusof HepHcellsonlyveryminutepots--precentromerecouldbeobservedThismeansthatthe ACAantiserumcanactuallyandspecificallyrecognizetheproteincomponentsof centromer/kinetochore.WhenTetrahyraenawasstainedwiththesametechnique,there wereonlypatchedwithinnucleicomposedofminutefluorescentspots;nopreeentromere couldbedistinguished,althoughallthenucleigavepositivereaction AfterimmunoblotedwithChineseACAserumandSHse]ttrJ),tilepositiveband—pattayn
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(from14kDto140kD)ofTetrahymenawashighlysimilartotheband—patternofhuman
Hepl~cells.TheblottingresultswithmACA2antibodyshowedthatHep]Jceilsgavetwo bands(80kDstaineddeelyand120kD,stainedslightly),Tetrahymenagavethreepositive bands(sokD,120kD,and150kD)Theblottingresultswithra—ACA一2antiserumshowed
thatHep?andTetrahymenaallgave50kD60kDand80kDbands.Intheim-
munoblottingwithmonoclonalantibodymAb37A5,HepJJcellsgavetwobandsverysimilar tothoseofCHOcells.Tetrahyraenagaveonlyonebandwithmolecularweightsomewhat lowerthan140kD
Theresultsdescribedaboveindicatthehighsimilarityinthecentromere/kinetochore proteincomponentsbetweenHepl~cellsandtheTetrahymena.musthaveemergedcartierin lifeevolutionaryhistory
KeywordsTetrahymena.Centromereprotein.ACAsei'/lm