小鼠胚胎成纤维细胞培养实验

小鼠胚胎成纤维细胞培养实验 0234091班 81人 灾害毒理学实验 实验一 小鼠胚胎成纤维细胞培养实验 一(实验目的 明确细胞培养室的建设与日常，了解细胞培养实验中常用的仪器设备的使用方法、注意事项和保养方法。 二(实验器材与试剂 1. 主要仪器 高压蒸汽灭菌器;超净台;电热干燥箱;自动双重纯水蒸馏器;CO2培养箱;电热恒温培养箱;液氮罐;低温冰箱;超低温冰箱;倒置显微镜(Olympus，Japan); 100ml的玻璃培养瓶;6孔培养板(COSTAR，每孔直径为3.5cm);Eppendroff管;1ml,2ml,5ml的玻璃滴管各30支;5ml冻存管;10ml尖底离心管和直径为8cm的平皿;解剖器械;离心机;漏斗和量筒;培养皿;酒精灯等。 2.主要试剂及配制 ? MEF(mouse embryo fibroblast，小鼠胚胎成纤维细胞)培养液 ?低糖DMEM母液 用一个1000ml的大烧杯加入1000ml无菌无内毒素的超纯水; 将一小袋低糖DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，并冲洗包装袋的内面以洗下所有的粉未。 每升培养基中添加3.7gNaHCO3。 搅拌直至完全溶解。 用1NHCl或1NNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3，调好PH后，将容器密封(在该实验中用1NHCl调PH至7.3)。 立即用0.22um的滤器过滤除菌，装入高压过的盐水瓶中, 4?保存(1个月内用完)。 ?MEF培养液 取100ml上述配好的低糖DMEM液体，加入10000IU青霉素钠(6.25mg)和10mg链霉素，溶解后再次调节PH至7.3，经0.22um的滤器过滤至高压过的血清瓶中，再添加10ml分装好的新生牛血清(Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需56?，30min灭活过)，4?保存至使用。 PBS缓冲溶液 ? PPS------含0.05%吐温,20的pH7.4的磷酸盐缓冲液的配置 在500ml超纯水中依次溶入 NaCl 4.0g KCl 0.1g Na2HPO4.12HO2 1.445g KH2PO4 0.1g 于121?高压灭菌30min或经0.22um的滤器过滤除菌再分装入100ml洁净灭菌的盐水瓶中，再放入4?冰箱中保存备用。 ? 0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液的配置 在100ml超纯水中分别溶解 胰蛋白酶干粉(Trypsin, Sigma,T4799) 0.25g EDTA 0.02g NaCl 0.7g NaHPO.12HO 0.024g 242 ?1? KHPO 0.024g 24 KCl 0.037g Tris 0.3g D-葡萄糖 0.1g 酚红 1mg 于4?过夜，使之充分溶解，用1mol/lHCl调PH至7.6, 0.22um的滤器过滤除菌，在–10,30?下冻存备用。 ?0.1%的明胶水溶液 称明胶0.1g (Sigma, G—9391)溶于100ml超纯水中，先加热溶解，再分装入20ml的血清瓶中于121?高压灭菌45min，于4?保存。 ? 10ug/ml的丝裂霉素C工作液----刺激成纤维细胞生长的物质 三( 0.5mg/ml的丝裂霉素C母液 在盛有2mg丝裂霉素C的小瓶中加入4ml高压灭菌的PBS，用高压灭菌的尖嘴混匀。即得0.5mg/ml的丝裂霉素C母液。 注:此步应在胶卷暗盒内操作，然后于4?避光保存。 ? 10ug/ml的丝裂霉素C工作液 在24.5ml的MEF培养液中加入0.5ml的0.5mg/ml的丝裂霉素C母液，并经0.22um的滤器过滤至25ml血清瓶中。用前临时配制，并在37?的CO2培养箱中预温30min.。 ? 冻存液 取2支1.5ml Eppendroff管，每管均加入0.9ml DMEM(低糖型)培养液和0.1ml二甲基亚砜(DMSO，AR纯，中国医药集团上海化学试剂公司)，置40C冰箱中预冷60min。 3.动物 性成熟期即大于8周龄昆明种小白鼠，领自福建医科大学实验动物中心。 三(实验步骤 ? 获取小鼠胚胎 将8周龄的?鼠和12周龄的?鼠按1:1比例合笼。 次日晨10:00前观察?鼠阴道口，有乳白色或蛋黄色胶冻状物(阴道栓)即定为怀孕0.5天。 实验时断颈处死孕13.5天的母鼠，置于蜡盘上。 75,酒精消毒后，用普通剪刀和镊子剪开下腹皮肤，并用两把弯头止血钳夹住切口处的皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮。 用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。 用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整个子宫分离下来(注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染)。 将子宫置于无菌滤纸上去除血迹。 在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的平皿中，洗涤数次。 将子宫移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠(一般有12只)。 将胎鼠移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和内脏，得鼠胚躯干。 将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的平皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。 ? 小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养(组织块培养法) 将干净的鼠胚躯干移至青霉素小瓶内(每6个鼠胚躯干装1瓶)，用眼科直剪充分剪碎，剪成约1mm3以下的碎块(需剪约200下)。 用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS，混匀后连同鼠胚碎块一起移至一尖底离心管中。 ?2? 室温下静置5min，用刻度吸管吸去上清液，留下鼠胚组织碎块。 向装有鼠胚碎块的离心管内加入1ml0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液，轻轻吹吸30秒(可见组织块变得较为粘稠)。 再加入1 mlMEF培养液终止消化，室温下静置5min。 吸去上清液，留下鼠胚组织碎块沉淀。 每个离心管内加入5mlMEF培养液悬浮鼠胚组织块，并接种到100ml的螺口的培养瓶中(接种时应用滴管将组织块混匀)。 做好标记(如培养日期，细胞名称，编号)，将装有鼠胚组织碎块的培养瓶放入37?，5,CO2，100,RH的培养箱中培养。 培养的头两天不要晃动培养瓶，第三天可以观察，可见组织碎块附着于培养瓶底，周围细胞呈放射状生长，此时有多种细胞类型，有的是呈梭形的成纤维细胞，有的是呈圆形的上皮细胞。如果细胞已全部长满则可消化传代，如果未全部长满则可3/4换液或全量换液。 ? 小鼠胚胎成纤维细胞的传代培养 用滴管吸弃培养瓶中的培养液和未贴壁生长的组织块。 每瓶用滴管加入约3ml的PBS，轻轻前后晃动培养瓶，洗涤细胞一遍，吸弃PBS。 每瓶用滴管加入约2ml的0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液，能盖住培养瓶底，室温下静置作用30秒，吸弃消化液。 在倒置镜下观察，当细胞变圆时即可加入4—5mll MEF培养液终止消化，并用滴管吸培养液用力吹打整个瓶底(约30下)。 将培养物全部吸置尖底离心管内，静置5min，将上层细胞悬液吸置另一离心管内。 1000r/min(80-1离心机为80g)离心5min，吸弃上清液。 每瓶加入3mlMEF培养液悬浮细胞沉淀块，并分装至3个100ml的培养瓶中。 每个培养瓶再补加4ml的MEF培养液，并吹打混匀细胞(吹打时勿产生气泡)。 将刚消化传代的细胞在倒置镜下观察，可见细胞呈大小不一的圆形。 将装有消化后细胞的培养瓶放入37?，5,CO2，100,RH的培养箱中培养。 约2天后，细胞可贴壁长满，继续按1:3消化传代(操作同前，省略步骤5中的静置和换管)。 饲养层制备 明胶预包被培养板:取1个6孔培养板(COSTAR ,每孔直径为3.5cm)，先紫外照射30min，每孔用5ml刻度滴管加入3ml的 0.1%明胶水溶液，使其能覆盖孔的底部，室温下静置2h以上，用前吸弃明胶水溶液，并用2ml的PBS洗涤一遍。 丝裂霉素C作用2小时:将3瓶细胞生长连成一片的第3代MEF的培养液吸弃，每瓶加入3ml10ug/ml的丝裂霉素C工作液，再放入37?、5%CO2、RH100%的培养箱中培养2h。 2小时后，吸弃培养瓶中的丝裂霉素C工作液，用预温的PBS洗涤细胞5次，每次3ml(加样时滴管靠在培养瓶的上壁或侧壁，勿直接冲冲击底壁的细胞)。 消化:每瓶中加入2ml0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA消化液，室温下作用10秒，立即吸弃消化液，加入3mlMEF培养液终止消化，并吹打壁底细胞(应注意逐瓶操作，避免消化时间过长而使细胞丢失过多)。 离心:将所有细胞悬液分吸至2个10ml尖底离心管内，1000r/min离 心5min，弃上清，得细胞沉淀块，往一个离心管的沉淀块内加入3ml的MEF培养液混悬细胞，再吸至另一离心管中混悬沉淀块。 计数并调整密度:吸出混悬后的细胞悬液50ul用血细胞计数板计数混合后细胞悬液的密度，然后将细胞悬液吸至一培养瓶或血清瓶中，补加适量的MEF培养液调整细胞密度为3×105个/ml。 接种:每孔加3 ml密度为3×105个/ml的细胞悬液(因为培养孔的直径为3.5cm，故其底面积S=πr2=3.14×1.752=9.42 cm2，根据接种的细胞数为1×105个/cm2,所以每孔可加3 ml密度为3×105个/ml的细胞悬液)。 ?3? 培养:将接种好经丝裂霉素C作用过MEF的6孔板放入37?、5%CO2、RH(相对湿度)100%的培养箱中培养。 饲养层细胞的冻存和复苏实验 冻存 细胞:镜检，将处于对数生长期的小鼠胚胎成纤维细胞用于冻存实验。弃旧培养液，后以PBS或新鲜培养液漂洗细胞一次。 消化:常规0.25%胰蛋白酶,0.02%EDTA消化制备单细胞悬液。 离心重悬:80g离心10min，弃上清，以冻存液悬浮细胞，分装到冻存管中。 冻存:细胞逐级降温冷冻:4 ?冰箱40min,-20? 冰箱40min,-80? 冰箱保存备用。 复苏培养 冻融:从低温冰箱中取出冻存细胞，置于370C水浴锅内，不时振摇冻存管，使细胞快速融化。 洗涤:转移冻存管内细胞于离心管中，80g离心5min，弃上清，沉淀用含新鲜DMEM(低糖型)重新悬浮，制备单细胞悬液。 接种:接种细胞于培养瓶中，置370C、CO2培养箱内进行过夜培养，12,24小时后，更换培养基，按照细胞的生长状况进行相应处理。 四(实验准备 ? 玻璃器皿的洗涤方法 ?自来水冲洗 ? 烘箱烘干，5%稀盐酸浸泡12h; ?洗刷、烘干(自来水---洗涤剂---自来水); ? 泡酸、清洗(重铬酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水1000 ml混合配置的酸洗液浸泡12h;捞出后自来水冲洗15次---蒸馏水冲洗3,5次---二次蒸馏水冲洗3次); ?烘干、包装; ? 高压蒸汽灭菌器消毒----备用。 ? 无菌室灭菌 紫外线灯照射灭菌 ? 实验人员无菌准备 肥皂洗手----穿好隔离衣、戴好帽子口罩、拖鞋----75%酒精棉球擦拭双手。 四(实验结果与分析 五(书写#实验# 实验指导老师 刘章现 屈二军 2011年11月24日 ?4?