干酪乳杆菌6033蛋白酶降解肌肉蛋白质的作用研究

干酪乳杆菌6033蛋白酶降解肌肉蛋白质的作用研究 干酪乳杆菌 6033 蛋白酶降解肌肉蛋白质的 作用研究 王 俊，周光宏，徐幸莲, 黄 明 (南京农业大学 农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室，江苏 南京 210095) 摘 要:本试验将干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，Lc)6033 蛋白酶液按 5% 的比例分别加入肌浆蛋白和肌原纤维蛋 白提取液，然后设定不同的 p H 值，于 1 5 ?培养 7 d ，定时取样，测定反应后的 p H 值、十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯 酰胺凝胶电泳(S DS -PA GE )检测蛋白质的变化。结果发现:不同设定的肌浆蛋白和肌原纤维蛋白试验组在反应初 期 p H 值均稍稍降低，随着反应进程，各试验组的 p H 值呈现出逐步升高的趋势;其中，肌浆蛋白以 p H 5 . 0 、 4.5 组的变化较为明显，肌原纤维蛋白则以 pH 6. 0、5 .0 、4 .5 组的变化较为明显。经 7d 振荡培养后，电泳检测发 现，各试验组肌浆蛋白均表现出分解现象，尤其以 pH 5. 0 组和 pH 4. 5 组更为明显;而肌原纤维蛋白也都表现出了 明显的分解现象，尤以 p H 5 .0 组肌原纤维蛋白分解最明显。 关键词:干酪乳杆菌;蛋白酶;肌肉蛋白质;降解 收稿日期:200 3-12 -23 基金项目:“十五”国家高技术研究发展计划(86 3)项目(20 02 A A2 4 80 31 ) 作者简介:王俊( 1 9 7 1 - ) ，男，博士，研究方向为畜产品加工与质量控制。 on microbial an d chemico -physical characteristics of goat 3.1 随着 I H P 处理压力增大，微生物的存活率愈小， cheese[J]. J Dairy Sci, 1999, (5): 851-862. 但下降至一定程度后，变化趋缓。 The Coca-Cola Co. Ultra high pressure homogenization of [6] 3.2 随着 I H P 处理次数增多，微生物的存活率愈小， unpasteurized juice. USA Patent, 1993, (5): 232, 726. 对于某一类微生物的杀灭或许存在多大压力条件下进行[7] 杜军, 张绍英, 等. 动力作用作为冷杀菌方法的可行性初 多少次数可以获得最为经济同时又最彻底的条件。 探[J]. 中国乳品工业, 2002, (6): 25-27. 不同的食品( 介质) 成分对 IHP 杀菌效果影响或许是 3.3 [8] 郑家林. 微射流均质机——一种高效新型乳化设备[J]. 广 不同的，而对于奶类、纤维物料类等介质比蒸馏水更州食品工业科技, 1994, (1): 59. 有利于保护微生物作用。 Sien Y Soon, John Harbidge, et al. Prediction of drop break- [9] age in an ultra high velocity jet homogenizer[J]. Journal of 参考文献:Chemical Engineering of Japan, 2001, (5): 640-646. [10] 刘成梅, 刘伟, 等. Microflidizer对膳食纤维溶液物理性质 Lutz Popper, Dietrich Knorr. Application of high-pressure [1] 的影响[J]. 食品科学, 2004, (2): 72-75. homogenization for food preservation[J]. Food Technology, [11] 刘成梅, 刘伟, 等. Microflidizer对膳食纤维的微粒粒度分 1990, (7): 84-90. 布的影响[J]. 食品科学, 2004, (1): 52-55. Heinz V, et al. Inactivation of Bacillus subtili spores by ultra- [2] 刘成梅, 刘伟, 等. 微射流均质机流体动力学行为分析[J]. [12] high-pressure in combination with other treatment[A]. IFT 食品科学, 2004, (4): 58-62. Annual Meeting, 1995, 268. [13] 刘伟, 刘成梅, 等. 高压过程中的压力与能量分析[J]. 食 Neil H. Mermelstein, High-Pressure pasteurization Juice[J]. [3] 品科学, 2003, (7): 162-164. Food Technology, 1999, (4): 86-90. [14] 刘伟. 瞬时高压作用对膳食纤维的物理性质影响及其杀 S C F eijoo, et al. Effects of microfluidizer technolo gy on [4] 菌机制[D]. 南昌大学硕士毕业论文, 2004. Bacillus licheniformis spores in ice cream mix[J]. Jour of Dairy 李汴生, 等. 超高压杀菌及其反应动力学[J]. 食品科学, [15] Science, 1997, (9): 2184-2187. 1997, (9): 3-8. [5] M E Guerzoni, et al. Effect of high pressure homogenization ※基础研究食品科学2005, Vol. 26, No. 2 91 Degradation of Muscle Proteins by Proteinases from Lactobacillus casei 6033 WANG Jun，ZHOU Guang-hong，XU Xing-lian，HUANG M ing (Key Laboratory of Farm and Animal Products Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China) Abstract:The changes of pH and sarcoplasmic and myofibrillar proteins in extract added with 5% Lc 6033 proteinase subsequent to incubation in d ifferent pH at 15? for 7d were studied. The results showed th at the pH values decreased slightly both in sarcoplasmic and myofib rillar proteins solution, and then increased g radually with the reaction processing. The sig nificant changes occurred at pH5.0, 4.5 for sarcoplasmic protein and pH 6.0, 5.0, 4.5 for myofibrillar proteins, respectively.Electro- phoresis (SDS-PAGE) indicated that both sarcoplasmic and myofibrillar proteins were degraded by Lc 6033 after 7d incubation at 15?. And marked changes were found at pH5.0, 4.5 for sarcoplasmic proteins and pH 5.0 for myofibrillar proteins, respectively. Those results above demonstrated that the proteinases from Lc could degrade muscle proteins. Under low pH values, degradation of both sarcoplasmic proteins and m yofibrillar p roteins w ere m ore distinct than under hig h pH valu es, and the effect of proteinases from Lc on sarcoplasmic proteins was little stronger than myofibrillar proteins under lower pH value, in vitro. Key words:La cto bacillu s casei;proteinase;mu scle protein;degrad ation 中图分类号:TS251.1 文献标识码:A 文章编号:1002-6630(2005)02-0090-07 近年来研究人员对肉制品乳酸发酵的理化特性变质、中分子量标准蛋白质、过硫酸铵:均为 P r o m e g 化研究表明，蛋白酶、脂酶的存在是风味产生的前 、牛血清白蛋白 产，美国;三羟甲基氨基甲烷( T r i s ) ( BS A) 、β - 巯基乙醇、十二烷基硫酸钠( S DS ) 、乙二 提，由糖、蛋白质、脂肪的分解产物相互作用而形 [ 1 , 2 ] 成了发酵香肠特有的风味。国外研究表明:发酵 醇双( 2 - 氨基乙基) 四乙酸( E G T A ) 、四甲基乙二胺 ( T E M E D ) 、叠氮钠:均为 S i g m a 产，美国;其它试 香肠成熟期间，在脂肪降解的同时，蛋白质也发生 剂均为国产分析纯。不同程度的降解产生多肽、氨基酸等呈味物质，部 分氨基酸随后脱羧、脱氨或进一步代谢成醛、酮等 主要仪器与设备1.1.2 小分子化合物，对发酵香肠的鲜味和香味的形成起了 穿刺式 pH 计 HANNA HI 9025，葡萄牙;高速 [ 3 , 4 ] 重要作用。目前，对发酵香肠中肌肉蛋白质降解 冷冻离心机 Beckm an All egra 64R，美国;紫外分光光 及风味物质的研究较多，而对发酵香肠中乳酸菌发酵 度计 UV-754，上海;超声波细胞破碎仪 VCX- 600， 剂对肌肉蛋白质降解能力的研究才刚刚开始，报道也 美国;快速恒温数显水箱 国华 HH- 42，常州;DY602S 较少。稳流稳压电泳仪、CC - B 垂直电泳槽、T Y- 8 0S 脱色摇 本试验将干酪乳杆菌蛋白酶液分别添加到牛肉肌浆 床 均为南京大学产;生物电泳图像分析系统 FR-980 ，蛋白和肌原纤维蛋白提取液中，并设定不同的 p H 值， 上海;高速分散器金达 XH F- 1，上海;一次性滤器 7 d 振荡培养后，分别研究反应物 p H 值和不同 p H 经过D NZ- C，江苏太仓。 Pal l ，Ф 0. 22μm ;振荡培养箱 值条件下肌肉蛋白质的变化，观察干酪乳杆菌 6033 蛋白 1.2 试验方法 酶在离体条件下降解肌肉蛋白质的能力，从而确认干酪 增菌培养1.2.1 6033 在发酵香肠肌肉蛋白质降解中是否起作用， 乳杆菌 将经过两次活化的干酪乳杆菌 6033 菌悬液按 2% 的也为筛选分解蛋白质能力强的发酵香肠发酵剂乳酸菌提 接种量接入 40L MRS 液体培养基，经 30 ?、最佳增菌 供方法。[5]时间 20h 培养。培养物经 4?、10000 × g 离心 15mi n， 0.05mol/L PBS(pH7.0)洗涤 3 次后混悬于两倍体 沉淀物用 材料与方法1 20mmol/L Tris-HCl(pH7.5) 中。积的 1.1 材料与设备 粗酶液制备1.2.2 [ 6] 主要试验材料1.1.1 将上述菌悬液进行超声波破碎，菌细胞裂解液经 干酪乳杆菌购自中国食品发酵工业研究所，编?、1 5 0 0 0 × g 离心 3 0 m i n ，上清液即为粗酶液。 4 牛背最长肌，市售。聚丙烯酰胺、号 6 03 3 ;原料肉1.2.3 肌肉蛋白质的提取 甲叉双丙烯酰胺:F l u ka 产，瑞士;高分子量标准蛋白 肌浆蛋白质的提取1.2.3.1 92 食品科学※基础研究2005, Vol. 26, No. 2 牛背最长肌 肌浆蛋白质的提取参考文献[ 7] 的方法( 图 1) 。 ? 绞肉机牛背最长肌 破碎 ? 绞肉机 ?绞碎 悬浮于 1 L 标准盐溶液(S SS :1 00 mmol/L K Cl，20 mmol/L K HP O ， 2 4 ?HCl 调 pH 至 6. 8;2mmol/L MgC l2，2mmol/L EGT A,10 mmo l/L NaN3) 悬浮于 p H7 .0 、5 0mmo l/L 磷酸缓冲液(P BS ，含 1 0mmo l/L N aN 3、 ?2mmo l/L EG TA、10 0mmol/L KC l) 匀浆(10 s/ 次× 3 次，间隔 20 s) ? ?匀浆(6 00 0r/min /min ，3min ) 10 00 × g ，离心 1 0min ? ?4?、1 0 0 0 0 × g ，离心 3 0 min 沉淀悬浮于 600ml SSS 溶液,匀浆(10s/ 次× 3 次,间隔 20s), ? 取上清，即为肌浆蛋白质提取1000 × g,离心 10min 液 ? 沉淀悬浮于 80 0ml SS S 溶液，匀浆(1 0s/ 次× 3 次，间隔 2 0s) 图1牛肉肌浆蛋白质提取? 匀浆液用尼龙网过滤 后，1 00 0 × g ，离心 1 0min Fig.1 Procedures used for purification of beef myogen ? 沉淀悬浮于 80 0ml SS S 溶液，匀浆(1 0s/ 次× 3 次，间隔 2 0s) 肌原纤维蛋白质的制备1.2.3.2 ? 匀浆液用尼龙网过滤后[8 ]肌原纤维蛋白质的提取和纯化参考 Huf f- lonergan 再离心(10 00 × g ，10min) 的方法，提取流程见图 2 。 ?沉淀悬浮于 60 0ml TSS S 溶液(含 1% Trito n X-1 00 的 SS S 溶液)，匀浆 蛋白质浓度测定1.2.3 (1 0s/ 次× 3 次，间隔 2 0s) [6 ] 采用 Br adf or d 检测法测定蛋白质浓度。 ? 15 00 × g ，离心 1 0min 1.2.4 试验设定 ?参照文献[ 5] 的方法并修改后进行试验设定。 沉淀悬浮于 60 0ml TS SS 溶液，匀浆(10 s/ 次× 3 次，间隔 2 0s) 肌浆蛋白质组试验设定1.2.4.1 ? 取肌浆蛋白提取液 1 0 0 m l ，均分成 5 组，每组各 15 00 × g ，离心 1 0min ?20m l ，一组作空白对照，其余每组分别添加 5% 干酪乳 沉淀悬浮于 8 00 ml S SS 溶液，离心(15 00 × g ，10 min) 杆菌蛋白酶液，分别调 p H 值为 7 . 0 、6 . 0 、5 . 0 、4 . 5 ， ?于 15?振荡培养( 150r/ m in) 7d，定时测定 pH 值、取样。 沉淀悬浮于 80 0ml、1 00 mmol/L NaCl 溶液中，离心(15 00 × g ， 10 min) ;重复该 4 次 肌原纤维蛋白质组试验设定1.2.4.2 ?肌原纤维蛋白用 pH7.0、50m mol/ L PBS 洗涤三次， 沉淀悬浮于 5 00 ml、1 00 mmol/L N aN 3 溶液后，离心(1 50 0 × g ， 然后悬浮于 pH7.0、50mm ol /L PBS(含 15mm ol/ L NaN3、 1 0min ) ;重复此步骤一次 100m mol/ L KCl) 中。取提取液 100ml ，均分成 5 组，每 ? 取沉淀，即为肌原纤维蛋 白质 2 0 m l ，试验处理同上。 组各 1.2.5 试验测定 图2 牛肌原纤维提取流程图pH 值测定 1.2.5.1 Fig.2 Procedures used for purification of beef myofibril 分别于 0 、2 4 、4 8 、7 2 、9 6 h 、7 d 测定每个组的 p H 值( n = 3 ，取平均值) 。 变化 测定样品中蛋白质的变化 SDS-PAGE 1.2.5.2 肌浆蛋白质提取液 pH 值的变化 2.1.1 分别于 0 、2 4 、4 8 、7 2 、9 6 h 、7 d 取样，按文 空白对照组在 7d 培养中 pH 值没有明显变化。由图 献[ 7] 的方法进行电泳分析( SDS-PAGE) 。浓缩胶:浓度 3 可见，pH7.0 组在反应 1d 后 pH 值降到最低( 6.36) ，反 5 % ，电压 6 0 V ;分离胶:浓度—肌浆蛋白质组为 为 3d 6.44，7d pH 6.45 1d 后升至时值为，与相比差异 应 1 5 % 、肌原纤维蛋白质组为 1 0 % ，电压 1 0 0 V 。 ( p , 0.05) ;pH6.0、5.0、4.5 组在 1d 后 pH 值 都不显著 5 . 3 0 、4 . 6 0 、4 . 1 8 ，3 d 后分别升高至 5 . 4 4 、 分别降到 统计分析1.2.6 4. 8 2 、4 .5 4 ，7d 时 pH 值为 5 .4 7 、4 .8 5 、4 . 5 9 ，与 1 d SAS 6.12 版分析，多重比较采用 Fi sher '采用软件 比差异均显著或极显著( p , 0.05 或 p , 0.01) 。 各试验L S D 法。 24 h 左右时 pH 值降到最低，然后 组在反应 2 结果与分析又呈现出逐步升高的趋势，可能是由于随着反应的进 行，肌浆蛋白质发生降解产生了碱性的肽、游离氨基干酪乳杆菌蛋白酶降解肌肉蛋白质过程中 pH 值的 2.1 ※基础研究食品科学2005, Vol. 26, No. 2 93 组反应 1 d 后 p H 值降低的原因也有待于进一步研究。 2.2 SDS-PAGE 测定样品中蛋白质的变化 肌浆蛋白质组2.2.1 1 2 3 4 5 6 7 a b c d e 图 3 肌浆蛋白提取液 pH 值的变化(n=3) 1. 标准蛋白质(k D) :a-97 .4 , b-66 .2 , c-42. 7, d -3 1. 0, e-1 4. 4;2 . 提取液, Fig.3 Changes of pH value from beef myogen 0d ;3 . 提取液 + 酶液, 0 d ;4 . 提取液, pH 7 . 0 , 7 d ;5 . 提取液, p H6 . 0 , 7d ;6 . 提取液, p H5 .0 , 7d ;7 . 提取液, p H 4. 5, 7d 。 酸等而使反应环境 pH 值升高;又以 pH5.0、4.5 组的变 化较为明显，可能是因为低 p H 值条件下蛋白酶活性增 图5肌浆蛋白质电泳图谱(对照) 加，有利于蛋白质的降解。但各试验组在反应的前 24 h Fig. 5 Elec trophoresis profile of bee f sarcoplasmic p H 值为什么会降低，其原因有待于进一步研究。 由图 5 可见，空白对照组在不同 pH 值条件下，经 2.1.2 肌原纤维蛋白质提取液 pH 值的变化 7d 振荡培养后，肌浆蛋白质提取液电泳条带没有明显变 化，表明肌浆蛋白提取液中缺少肌浆蛋白的分解酶。 1 2 3 4 5 6 7 a b ?57.1 c ?37.2 ?34.8 d ? 24.4?21.6 e 1. 标准蛋白质 (kD ):a-9 7. 4, b -6 6. 2, c-4 2 .7 , d-31 .0 , e-14 .4 ;2 . 0d ;3 . 2 4 h ;4 . 4 8 h ;5 . 7 2 h ;6 . 9 6 h ;7 . 7 d 。 图 4 肌原纤维蛋白提取液 pH 值变化(n=3) 图6 干酪乳杆菌蛋白酶降解肌浆蛋白电泳图谱(pH7.0) Fig. 4 Changes of pH value from beef myofibrillar Fig. 6 Electrophoresis profile of hydrolysis of sarcoplas- protein mic proteins by proteinase from Lc 6033(pH7.0) 空白对照组在 7 d 培养过程中 p H 值也没有明显变 组经 7d 振荡培养后，肌浆蛋白表现出一定的 pH7.0 化。由图 4 可见，p H 7. 0 、6 . 0 、5 . 0 、4 . 5 组在反应 1 d 分解现象，但并不明显，和 0h 相比，陆续新增了 57 .1 、 后 p H 值均降到最低，然后逐渐升高，3 d 后分别升至 37.2、34.8、24.4、21.6kD 等条带( 图 6) 。pH6.0 组经 7d 6. 96 、6 .0 6 、5 .1 9 、4 .6 8 ，7d 时 pH 值为 6 .9 8 、6 .0 9 、 培养后，肌浆蛋白也表现出一定的分解现象，和 0 h 相 5.24、4.77，与 1d 比差异均显著或极显著( p , 0.05 或 p 57.1、53.8、37.2、34.8、26.5、24.4 、 比，陆续新增了, 0. 01 ) 。 21.6、10.4kD 等条带;与 pH7.0 组相比，新增 53.8、26.5、 各试验组在反应 1 d 左右时 p H 值降到最低，然后 10.7kD 等条带(图 7)。也呈现出逐渐升高的趋势，同样可能是因为随着反应 从图 8 可以看出，p H 5. 0 组经 7 d 培养后，肌浆蛋 进行，肌原纤维蛋白质降解产生了碱性的肽、游离氨 白表现出了明显的分解现象，和 0 h 相比，原有的条带 p H 值升高。其中以 p H6 .0 、5 .0 、 基酸等而使反应环境 大多数减弱或消失了;与 pH7 .0 组、pH6 .0 组相比，除 4.5 组的变化更为明显，原因可能也是较低的 pH 值适合 了肌浆蛋白原有条带绝大多数减弱或消失，前两者新增 蛋白酶发挥水解作用。与肌浆蛋白组相类似，各试验 94 食品科学※基础研究2005, Vol. 26, No. 2 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 a a b b ?57.1 ?53.8 c c 37.2 ?34.8 ?d d ?26.5 ?24.4 ?21.6 e ?e 10.4 ?13.3 ? 10.4?9.2 1. 标准蛋白质 (kD ):a-9 7. 4, b -6 6. 2, c-4 2 .7 , d-31 .0 , e-14 .4 ;2 . 0d ;3 . 1. 标准蛋白质 (kD ):a-9 7. 4, b -6 6. 2, c-4 2 .7 , d-31 .0 , e-14 .4 ;2 . 0d ;3 . 2 4 h ;4 . 4 8 h ;5 . 7 2 h ;6 . 9 6 h ;7 . 7 d 。 2 4 h ;4 . 4 8 h ;5 . 7 2 h ;6 . 9 6 h ;7 . 7 d 。 图7 干酪乳杆菌蛋白酶降解肌浆蛋白电泳图谱(pH6.0) 图9 干酪乳杆菌蛋白酶降解肌浆蛋白电泳图谱(pH4.5) Fig. 9 Electrophoresis profile of hydrolysis of sarcoplas- Fig.7 Electrophoresis profile of hydrolysis of sarcoplas- mic proteins by proteinase from Lc 6033(pH4.5) mic proteins by proteinase from Lc 6033 (pH6.0) 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 a a b b c d c e d f g e 10.4 ??9.2 h 1. 标准蛋白质 (k D):a-22 5, b-15 0, c-10 0, d-75 , e-50, f-35, g-25, h -10;2 . :a-9 7. 4, b -6 6. 2, c-4 2 .7 , d-31 .0 , e-14 .4 ;2 . 0d ;3 . 1. 标准蛋白质 (kD )提取液, 0 d ;3 . 提取液 + 酶液, 0 d ;4 . 提取液, p H 7 .0 , 0 d ;5 . 提取液 2 4 h ;4 . 4 8 h ;5 . 7 2 h ;6 . 9 6 h ;7 . 7 d 。 + 酶液, p H 6. 0 , 0 d ;6 . 提取液 + 酶液, p H 5 . 0 , 0 d ;7 . 提取液 + 酶液, 图8干酪乳杆菌蛋白酶降解肌浆蛋白电泳图谱(pH5.0)p H 4 . 5 , 0 d 。 Fig.8 Electrophoresis profile of hydrolysis of sarcoplas- 图10肌原纤维蛋白质电泳图谱(对照)mic proteins by proteinase from Lc 6033 (pH5.0) Electrophoresis profile of beef myofibrillar Fig. 10 proteins 的条带也仅有 10.4kD 条带等较为清晰，并新增了 9.2kD 等条带。 1 2 3 5 6 7 ?200 a 而 p H4 .5 组经 7d 培养后，肌浆蛋白则表现出了更 ?160 b 为明显的分解现象，和 0 h 相比，原有条带几乎全部减 ?100 c ?84.5 ?d 73.2 pH 7. 0 组、pH 6. 0 组、pH5 .0 组相比，除 弱或消失;与?68.5 ?64.4 了肌浆蛋白原有条带几乎全部减弱或消失，前三组新增 ?51.2 e ?45.0 ?43.0 10.4、9.2kD 等条带，并新增了 13.3kD 的条带仅保留了f ?32.9 ?30.1 等条带( 图 9 ) 。 ?26.6 g ?23.1 ?19.4 ?18.7 ?16.5 肌原纤维蛋白质组2.2.2 ?12.5 h 11.0 ? 由图 10 可见，空白对照组在不同 pH 值条件下，经 1. 标准蛋白质(kD) :a-2 25, b-150, c-100, d-75 , e-5 0, f-3 5, g-25, h-10;2. 7d 振荡培养后，肌原纤维蛋白提取液电泳条带也没有明 0 d ;3 . 2 4 h ;4 . 4 8 h ;5 . 7 2 h ;6 . 9 6 h ;7 . 7 d 。 显的变化，表明肌原纤维蛋白提取液中不含分解肌原纤 图11干酪乳杆菌蛋白酶降解肌原纤维蛋白电泳图谱 维蛋白的蛋白酶。(pH7.0) pH7.0 组 7d 培养后，肌原纤维蛋白的分解较明显， Fig. 11 Electrophoresis profile of hydrolysis of beef 0h 相比，20 0、16 0、1 00 、43 .0 、32 .9 、30 .1 、26 . 和myofibrillar proteins by proteinase from Lc(pH7.0) 6、19 .4 、18. 7、16 .5 、12 .5 、11 .0k D 等条带不同程度 减弱，并陆续新增 8 4 . 5 、7 3 . 2 、6 8 . 5 、6 4 . 4 、5 1 . 2 、pH6.0 组经 7d 培养后，肌原纤维蛋白表现出了更为明 45.5、23.1kD 等条带( 图 11 ) 。 显的分解现象，和 0h 相比，200、160、100、43 .0 、32 . ※基础研究食品科学2005, Vol. 26, No. 2 95 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 ?200 ?200 a a ?160 b b ?100 c c ? ??84.5 ? 68.5d ?73.2 ?64.4 ? 68.5? ?64.4 e ?45.0 ?43.0 e ?51.2 f ? ?43.0 ?30.1 ? f?g 30.1 ? 26.6?23.1 ??g 18.7 ?16.5 ?19.4 ?18.7 ?12.5 ??11.0 11.0 hh 1. 标准蛋白质(k D):a-22 5, b -1 50 , c-10 0, d -7 5, e-50 , f-35 , g-25 , h-10 ; a-2 25 , b-15 0, c-1 00 , d-75 , e-50 , f-35 , g-25 , h-10 1. 标准蛋白质(kD) :;2 . 0 d ;3 . 2 4 h ;4 . 4 8 h ;5 . 7 2 h ;6 . 9 6 h ;7 . 7 d 。 2 . 0 d ;3 . 2 4 h ;4 . 4 8 h ;5 . 7 2 h ;6 . 9 6 h ;7 . 7 d 。 图12 干酪乳杆菌蛋白酶降解肌原纤维蛋白电泳图谱 图14干酪乳杆菌蛋白酶降解肌原纤维蛋白电泳图谱(pH6.0) (pH4.5) Fig.12 Electrophoresis profile of hydrolysis of beef Electrophoresis profile of hydrolysis of beef Fig.14 myofibrillar proteins by proteinase from Lc 6033 (pH6.0) myofibrillar proteins by proteinase from Lc 6033 (pH4.5) 7 3 4 5 6 [ 3, 4] 发酵香肠风味形成的重要因素。影响发酵香肠中蛋白?200 a b 质分解的因素可能是多方面的，如微生物蛋白酶和肉中c ?84.5 的内源蛋白酶( 组织蛋白酶) ，但目前很难准确衡量每种 ?73.2 d ? 68.564.4 ? 因素对发酵香肠中蛋白质分解所作的贡献。e ?43.0 以前对乳酸菌分解蛋白质的研究主要局限于乳制f ? 32.9?30.1 品。部分学者认为:虽然乳酸菌是发酵香肠生产中的优 ?26.6 g 势菌，但其主要作用是产酸，以获得发酵香肠特有的 酸味及质地，而对蛋白质的分解很微弱，因此一般忽h 略乳酸菌在发酵香肠中小肽及游离氨基酸形成过程中所 1. 标准蛋白质(kD):a-22 5, b -1 50 , c-10 0, d -7 5, e-5 0, f-3 5, g -2 5, h -1 0; 起的作用;相反，肌肉内源蛋白酶对肌肉蛋白具有较强 2 . 0 d ;3 . 2 4 h ;4 . 4 8 h ;5 . 7 2 h ;6 . 9 6 h ;7 . 7 d 。 的分解能力，其中组织蛋白酶 B 、H 、L 、D 等分解 图13 干酪乳杆菌蛋白酶降解肌原纤维蛋白电泳图谱作用强，而且组织蛋白酶已被证实在发酵肉制品发酵和 (pH5.0) [ 9 ]成熟条件下，能长期发挥作用;另外，肌肉中氨肽 Fig.13 Electrophoresis profile of hydrolysis of beef 酶及肽酶也被陆续分离、鉴定，故发酵香肠中肌肉蛋myofibrillar proteins by proteinase from Lc 6033 (pH5.0) [ 1 0 ] 白质分解是由肌肉内源蛋白酶引起的。 近年来，有9、30 .1 、26. 6、19 .4 、18 .7 、16. 5、12. 5、11 .0 kD 等 较多的研究表明乳酸菌能水解肌肉蛋白 [11 ] 质。Toldr a 等发现清酒乳杆菌能分泌二肽酶、三肽酶 条带明显减弱甚至消失，并新增了 8 4. 5 、7 3. 2 、6 8. 5 、 [ 12 ] [ 1 3 ] 64. 4、51 .2 、45 .5 、23 .1k D 等条带( 图 1 2) 。 及氨肽酶，并对这些酶进行了分离、纯化和鉴定。 从图 13 可以看出，pH5 .0 组经 7d 培养后，肌原纤 因此有人认为发酵香肠中蛋白质的分解是肌肉内源酶和 维蛋白表现出非常明显的分解现象，和 0 h 相比，除 微生物共同作用的结果，首先主要由组织蛋白酶分解肌20 0、4 3. 0 、32 .9 、3 0. 1 、2 6. 6 kD 等条带明显减弱外， 肉蛋白成多肽，然后再主要由细菌把多肽分解成氨基酸 [1 4] 其余条带几乎全部消失;与 p H 7. 0 p H 6. 0 组、组相比，。目前又有学者发现乳酸菌细胞壁连接的蛋白酶对肌 [ 1 5, 1 6 ];加之 除肌原纤维蛋白原有条带绝大多数消失或明显减弱了， 原纤维蛋白及肌浆蛋白均有一定的分解作用新增的也仅能看出 84.5、73. 2、68. 5、64.4 kD 等条带。 由于其在整个发酵与成熟过程中一直保持较高的细菌浓 pH4.5 组经 7d 培养后，肌原纤维蛋白也表现出了明 度，因此，所起的作用不可忽视。[1 3][ 15 ]Toldr a 等进一步研究了几种乳酸菌对肌浆蛋白 0h 相比，除 2 00 、43 .0 、32 .9 、30 . 显的分解现象，和 1、19. 4、18. 7、11 .0k D 等条带明显减弱外，其余条带 和肌原纤维蛋白分解能力，发现虽然乳酸菌分解蛋白的 pH7 .0 组、pH6 .0 组相比，新增的也仅能 几乎消失;与能力较弱，但在高浓度下均表现出一定的分解现象。徐 看出 84.5、73. 2、68.5、64. 4、51.2 kD 等条带( 图 14 ) 。 为民等人的研究表明植物乳杆菌 6003 对肌肉蛋白有降解 [ 7 ] 作用。F ad da 等人对干酪乳杆菌、植物乳杆菌、弯曲 3讨 论乳杆菌( C E C T 9 0 4 和 N C D O 2 7 3 9 ) 、清酒乳杆菌 (NCDO2714、CECT4808 和 L110)等不同种的乳杆菌对肌 蛋白质分解成大量的小肽及游离氨基酸已被证明是 96 食品科学※基础研究2005, Vol. 26, No. 2 protein insolubility during the manufacture of some varieties 浆蛋白的降解能力进行了研究，结果也表明乳杆菌对肌 [ 14 ] [1 7, 1 8] of dry sausage[J]. Meat Sci, 1990, 28: 111-117. 浆蛋白有降解作用。 Garcia de Fernado J L, Fox PF. Study of proteolysis during [4] 从图 5 和图 1 0 可以看出，本试验中，肌肉内源蛋 the processing of a dry fermented pork sausage[J]. Meat Sci, 白酶在肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的提取过程中已经失活 1991, 29: 367-383. 或被抑制，因此可以排除内源蛋白酶对肌浆蛋白和肌原 王俊, 黄明, 周光宏, 等. 干酪乳杆菌蛋白酶的性质研究[5] 纤维蛋白降解作用的影响，同时也可确定肌肉蛋白的降 [J]. 食品工业科技, 2003, 24(7): 56-58. 解是由干酪乳杆菌粗酶液作用引起的。[6] 汪家政, 范明. 蛋白质技术[M]. 北京: 科学出版社, 2001. 很多研究表明，干酪乳杆菌、植物乳杆菌、弯曲 [7] 徐伟民, 周光宏, 等. 干发酵香肠发酵剂选择及其工艺研 乳杆菌等的活细胞和细胞裂解液对肌肉蛋白的降解能力 究[J]. 南京农业大学硕士论文, 2001, 8. [1 9] 相差很大。Sanz 等报道，干酪乳杆菌 CRL705 活细胞 Huff-Lonergan, et al. Effects of postmortem aging time, ani- [8] 在肌浆蛋白中培养 96 h 后，20 0、99 ,50 、45 ,31 kD a mal age, and sex on degradation of titin and nebulin in bovine 的蛋白质发生了降解，电泳条带明显减弱;加细胞裂解 longissimus muscle[J]. J Anim Sci, 1995, 73: 1064-1073. Fidel T, Elias R, Jose F. Cathepsin B, D, H and L activities [9] 液后肌浆蛋白也发生降解，但很微弱;而将活细胞和细 in the pro cessin g of d ry-cured ham [J]. J Sci F ood Ag ric, 胞裂解液同时加入肌浆蛋白时，肌浆蛋白质绝大部分被 1993, 62: 157-161. 降解。细胞裂解液对肌原纤维蛋白( 主要是肌球蛋白和 Eva H L, Juan A O. Contribution of the microbial and endog- [10] 肌动蛋白) 有明显的降解作用;而干酪乳杆菌 CRL705 活 enous enzymes to the free amino acid and amine content of 细胞对肌原纤维蛋白的降解作用较弱，同时添加活细胞 dry fermented sausage[J]. J Agric Food C hem, 1999 , 47: 和细胞裂解液时，肌原纤维蛋白的降解作用更加明显。 1156-1161. [ 7 ] [ 18 ] [ 20 ] 徐为民等、Tol dr a 等、Kunj 等的结论与此相似， Montel M C, Seronine M P, Talon R, et al. Purification and [11] 这些都表明肌浆蛋白是干酪乳杆菌活细胞蛋白酶的作用底 characterization of a dipeptidase from Lactobacillus sake[J]. 物，而肌原纤维蛋白是细胞裂解液中蛋白酶的作用底 Appl Environ Microbiol, 1997, 61: 837-839. 物。在本试验中，对干酪乳杆菌活细胞进行了超声波破 Sanz Y, Mulholland, Toldra F. Purification and characteriza- [12] 碎处理，并保留了细胞碎片( 主要是细胞膜) 得到的粗酶 tion of a tripeptidase from Lactobacillus sake[J]. J Agric Food 液中既有胞内酶又有胞外酶，因而对肌浆蛋白和肌原纤 Chem, 1998, 38: 331-352. 维蛋白都表现出明显的降解作用。本试验中所用的干酪 Sanz Y, To ldra F . Purificatio n and characterization o f an [13] aminopeptid ase from Lactobacillus sake[J]. J Agric Food 乳杆菌酶粗提液相当于活细胞和细胞裂解液的复合物。 Chem, 1997, 45: 1552-1558. 从本试验可以看出，反应环境的 p H 值对肌肉蛋白 的酶 Silvina F, Yolanda S, Graciela V, et al. Hydrolysis of pork [14] 降解有一定的影响。对于肌浆蛋白来说，pH5 .0 和 muscle sarcoplasmic proteins by Lactobacillus curvatus and 4 .5 时降解作用非常明显，许多蛋白几乎完全降解。由 L a cto b a cil lu s sa ke[J]. A p p lied an d E n v ir o n m en tal 此可以说明，酶粗提液中肌浆蛋白降解酶类作用的最适 Microbiology, 1999, 65(2): 578-584. p H 值应在 5 . 0 左右;而对于肌原纤维蛋白来说，不同 Silvina F, Yolanda S, Graciela V, et al. Characterization of [15] p H 值条件下都有明显的降解，说明酶粗提液中肌原纤 muscle sarcoplasmic and myofibrillar pro tein hyd roly sis p H 值范围广。电泳检测结果显 维蛋白降解酶类作用的caused by Lactobacillus plantarum[J]. Appl Environ Micro, 6033 粗酶液对肌浆蛋白及肌原纤维 示，尽管干酪乳杆菌1999, 65: 3540-3546. 蛋白均表现出明显的分解作用，但在低 pH 值( 5. 0 左右) Molly K, Demeyer D, Johansson G, et al. The importance [16] 条件下，对肌浆蛋白的降解作用更加明显，这与徐为 of meat enzymes in ripening and flavour generation in dry [ 7 ] 民等 的研究结果相似。fermented sausages, First results of an European project[J]. 总之，干酪乳杆菌 6 03 3 粗酶液对肌浆蛋白及肌原 Food Chem, 1997, 59: 539-545. Fadda S, Vignolo G, Holgado A, et al. Proteolytic activity of [17] 纤维蛋白均表现出明显的分解作用，且酶的适合 pH 值 Lactobacillus strains isolated from dry-fermented sausages on 在 5.0 左右。因此在干酪乳杆菌 6033 制作干发酵香肠过 muscle sarcoplasmic proteins[J]. Meat Science, 1998, 49: 11-18. pH 6033 值，使干酪乳杆菌蛋白酶发挥程中调节基质的Fadda S, Sanz Y, Vignolo G, et al. Characterization of muscle [18] 最佳作用，从而促进肌肉蛋白的降解。sarcoplasmic and myofibrillar protein hydrolysis caused by Lato bacillu s plantarum[J]. Ap plied and En viron mental 参考文献: Microbiology, 1999, 65(8): 3540-3546. Ralf G B, Carlos M, et al. Isolation and identification of dry [1] Sanz Y, Fadda S, Vignolo G, et al. Hydrolytic action of Lacto- [19] salami volatiles[J]. J Food Sci, 1990, 55(5): 1239-1246. bacillus casei CRL 705 on pork muscle sarcoplasmic and Anders P H, Louise HS. Sensory and chromatographic evalu- [2] myofibrillar proteins[J]. J Agric Food Chem, 1999, 47: 3441- ations of water soluble fraction from dried sausages[J]. J Agric 3448. Food Chem, 1997, 45: 2679-2684. Kunj E, Mierau I, Hagting A, et al. The proteolytic systems of [20] [3] Astiasaran I, Villanueva R, et al. Analysis of proteolysis and lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek, 1996, 70: 187.