人外周血来源的血管内皮祖细胞体外诱导分化

人外周血来源的血管内皮祖细胞体外诱导分化 人外周血来源的血管内皮祖细胞体外诱导 分化 第32卷第1期 2006年3月 兰州大学(医学版) — JournalofLanzh — ouUniversity(Medic— a — lSciences) V_01.32No.1 Mar.2006 文章编号:1000-2812(2006)01.0014.04 人外周血来源的血管内皮祖细胞体外诱导分化 彭瑜,张钲,白锋,黄晏 (兰州大学第一医院心内科,甘肃兰州730000) 摘要:目的研究外周血来源内皮祖细胞的分离,培养,分化及鉴定方法.方法采集正常人外周血单 个核细胞进行体外培养,通过免疫组化,免疫荧光和流式细胞术测定分化细胞表面特异性抗原的表达 及其变化.结果培养7d后多数细胞贴壁生长,逐渐显示内皮细胞的形态特点,传代培养4周后呈典型 铺路石样,并可继续稳定传代扩增;免疫组化和免疫荧光染色CD31,CD34,血管内皮细胞生长因子 受体-2和vwF均呈阳性;流式细胞显示,经体外诱导培养后CD34+/AC133+细胞数 明显增多.结论外 周血来源的单个核细胞中含有能分化成血管内皮细胞的内皮祖细胞,其在一定条 件下可稳定分化,扩 增. 关键词:血管内皮祖细胞;干细胞;血管 Invitroinductionanddifferentiationofhuman endothelialprogenitorcellsfromperipheralblood andtheircharacteristics PENGYu,ZHANGZheng,BAIFeng,HUANG"fan (DepartmentInternalCardiology,TheFirstHospitaloILanzhouUniversity,Lanzhou,780000,China) Abstract:0bjectiveTostudythemethodsofisolation,culture,differentiationandidentifica- tionofendothelialprogenitorcells(EPC1fromperipheralblood.MethodsTotalhPBMNcswere isolatedfromperipheralbloodofhumanvolunteersbyHistopaque-1077density-gradientcentrifu- gation.ThecellsweresuspendedinendothelialbasalmediumsupplementedwithEGM.2.Mv- SingleQuots.Culturedcellsweresubjectedtoimmunohistochemistryandimmunofluorescenceto analyzetheexpressionofCD31.CD34.VEGFR.2andVWF.FCSwasperformedtocountthe numberofCD34+/AC133+cells.ResultsEPCsexhibitedclona1morphologyandcobblestone morphologyafter7daysor4weeksculturerespectively.TheywerepositivestainforCD31,CD34, vascularendotheliagrow~hfactorreceptor2andvWF.ThenumberofCD34+/AC133+cellsin creasedsignificantlyafter2weeksculture.ConclusionEPCscanbeobtainedfromhPBMNCs andexpandedenoughforharvestinginvitroundercertaincondition. Keywords:endothelialprogenitorcell;stemcell;bloodvessel 研究发现血管内皮损伤后结构和功能的尽快 恢复可以阻断或延缓血栓形成,内膜增生等病理 过程的进展.人体外周血中存在的骨髓来源的内 皮祖细胞(Endothelialprogenitorcell,EPC)[1,2]是 一 种能直接分化为血管内皮细胞的前体细胞,有 很高的增殖潜能.它不仅参与胚胎时期血管生成, 收稿日期:2005—10,31 还与出生后血管新生和血管内皮损伤愈合密切相 关I3~5_,具有重要的生理,病理意义.内皮祖细胞 的发现为各种因素所致的内皮结构损害及功能失 常的防治提供了新的思路.本研究拟从人外周血 中分离培养出能稳定扩增的内皮祖细胞,为进一 步进行自体内皮祖细胞移植,促进血管内皮损伤 第1期彭瑜等:人外周血来源的篁塑壅塑堡!堡.一.曼 修复提供细胞学基础. 1和方法 1.1试剂与仪器 Histopaque一1077购自Sigma公司;人纤连蛋白 fHumanfibronectin)购自Roche公司;胎牛血清(FBS) 购自杭州四季青公司;EBM一2培养基,SingleQuots 组合添加剂购自Clonetics公司;FtTC—CD34购白 BDBiosciences:PE—AC133购自MiltenyiBiotec; CD31,CD34,血管内皮细胞生长因子受体一2(VEG FR一2)单抗,vWF多抗,SP试剂盒,FITC一羊抗小鼠 IgG,DAB等购自武汉博士德公司;荧光倒置显微 镜Ix81系日本Olympus公司产品;流式细胞仪Cou- lterEpicsXL系美国Beckman—Coulter公司产品. 1.2方法 1.2.1外周血单个核细胞的分离和培养 取健康志愿者空腹外周静脉血20mL,采用 Histopaque-1077密度梯度离心3Orain,转速为2000 r/rain;吸取中间层悬浮的细胞白膜,用含2%胎牛 血清的PBS重悬,离心,重复洗涤2次后,细胞重悬 于EBM一2培养液中,培养液中添加有EBM.2一MV— SingleQuots,其中含血管内皮细胞生长因子(Vas— cularendothelialgrowthfactor,VEGF)等适合内皮 细胞生长的相关组分,调整细胞密度至1×107个 /mL,然后接种于经人纤连蛋白处理过的培养板 中培养.在培养4d时,用PBS洗去未贴壁生长的细 胞,贴壁细胞给予EBM一2完全培养液继续培养,以 后每3d换液.观察细胞经不同培养时间后的生长 情况. 1.2.2EPC的免疫组织化学检测 内皮祖细胞体外诱导分化后具有内皮细胞的 特异性标志CD31,VEGFR-2和vWF,以不加一抗 的培养细胞作为空白对照,以ECV一304细胞作为阳 性对照,通过免疫组织化学染色来确定培养的细 胞是否有上述标志.将诱导分化的细胞用4.C冰 丙酮固定10min,内源性过氧化物酶用3%H2O2灭 活,非特异性结合用牛血清白蛋白阻断,然后分 别加入单克隆抗体CD31,VEGFR-2和多克隆抗 体vwF,4.C冰箱内孵育过夜,用PBS清洗后加入 二抗30min,二氨基联苯胺显色,显微镜下观察, 胞浆棕色为阳性反应细胞. 1.2.3EPC的免疫荧光检测 如上所述,通过免疫荧光进一步确定内皮祖 细胞是否具有CD31,CD34,VEGFR-2这几种内皮 细胞的特异性标志.以不加一抗的培养细胞作为 空白对照,细胞经PBS清洗后用冷丙酮固定,3% BSA封闭10min,加一抗CD31,CD34,VEGFR.2单 克降抗体4.C过夜.PBS清洗3次,再加?抗FITC标 图1EPCs体外培养的形态变化 d培养4J~J(1Ox100) 16兰州大学(医学版)第32卷 记的羊抗小鼠IgG抗体,37.C孵育30min,于倒置 荧光显微镜下观察,显示绿色荧光者为阳性细胞. 1.2.4EPC的流式细胞检测 用流式细胞仪检测外周血中新分离的单个核 细胞以及培养10d后贴壁细胞中的CD34,AC133, VEGFR-2细胞数.从新分离的单个核细胞调整密 度至1×100个/mL,取100L分别加入FITC.CD34 20L和PE—AC13310L,室温避光孵育20min后 用流式细胞仪分析.取同等量细胞,加入一抗VEG FR2单克隆抗体孵育15min,PBS清洗,加入FITC 标记羊抗小鼠IgG,室温避光孵育15min,PBS清洗 后用流式细胞仪分析.同时设立阴性对照和空白 对照.将培养i0~14d的贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶 消化(含0.02%EDTA),取约100个细胞重悬于EP管 中,采用上述方法检~]CD34,AC133,VEGFR-2的 表达. 2结果 2.1倒置显微镜下观察细胞生长变化 新分离的外周血单个核细胞圆形透亮,悬浮 于培养板中.自培养4d起细胞形态开始变化,7d 后可见多数细胞贴壁生长,呈椭圆形或短梭形,部 分细胞聚集成团呈"血岛"样,即中间是圆形细胞 团,周边为短梭形细胞.细胞传代培养4周时在镜 下呈现典型的铺路石样内皮细胞形态(图1). 2.2细胞免疫染色 外周血单个核细胞经体外培养分化后具有内 皮细胞的表型,CD31,vWF,VEGFR-2免疫组化染 色胞浆胞膜着色,呈阳性,对照组细胞未见着色; 取培养10~14d细胞进行免疫荧光染色,结果显示 CD31,CD34,VEGFR-2表达率均在95%以上,荧 光倒置显微镜下呈绿色荧光,对照组细胞则未见 激发荧光. 2.3流式细胞仪分析细胞裹型 从外周血中新分离的单个核细胞CD34,AC133 阳性率分别为35.3%士3.9%,2.05%士1.2%,双阳性 细胞为2.84%:k0.7%,双阴性细胞为59.8%:k6.2%, VEGFR-2阳性细胞数为0.06%.培养10~-14d后,贴 壁细胞CD34,AC133,VEGFR-2表达均显着升高, 细胞CD34,AC133双阳性率大于90%.VEGFR-2表 达亦在90%以上(图2,3). l2 , _ ':. 4 a培养1d l2 ?34 b培养14d 图2流式细胞仪检测CD34+/AC133+细胞 3讨论 本研究成功进行了外周血单个核细胞中 EPC的体外诱导,增殖和分化.显微镜下可见典 型的内皮细胞形态改变,免疫组化,免疫荧光显 示诱导分化细胞具有CD31,CD34,vWF,VEGFR.2 等内皮细胞的特异性标志.流式细胞检 测CD34,AC133,VEGFR-2的表达,培养2周的贴 壁细胞较新分离的单个核细胞均有明显提高. 在本研究过程中发现.细胞接种密度和培养 条件中的血清浓度与细胞诱导分化成功密切相 关.细胞接种密度小于105个cm时,细胞贴壁率 低,在4d换液后很难继续生存分化;而当细胞接 种密度大于107个cm时,细胞呈克隆样生长,并 在给予的培养环境中最终分化成内皮细胞,说明 细胞间的接触和相互作用在细胞分化初期起着 相当重要的作用.另外,在同样添加EBM.2.Mv_ SingleQuots的基础上,相对于5%的低浓度血清培 养条件,20%的高浓度血清培养更有利于细胞最 初2周的生长,传代以后两种不同血清浓度对细胞 的稳定增殖则无明显差异. 最近有研究显示,人的EPC在分化过程中又 可分为早期EPC和晚期EPC.早期EPC分泌较多的 促内皮细胞生长因子,但在2周左右绝大多数生 第1期彭瑜等:人外用血来粤里堕废塑塑重量坌一! 长停滞并逐渐死亡;少量存活下来继续分化为晚 期EPC,其具有较强的增殖能力,较高的一氧化氮 合成力和血管生成能力【6],这与本研究中细胞生 长特点相符.与成熟血管内皮细胞和人脐静脉内 皮细胞相比,EPC作为血管内皮祖细胞具有高增 殖潜能,其血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR- 21表达水平和对VEGF的敏感性也相对较高[7j.本 研究中外周血来源的EPC通过4周培养后形成典型 的铺路石样内皮细胞形态,并能稳定传代20次以 上,而外周血中的成熟内皮细胞体外培养时存活 时间短,且无法多次传代.由此可以排除细胞诱 导分化过程中来源于外周血的成熟内皮细胞的混 杂. 一 ,一 籁 a培养1d FL2荧光强度 b培养14d 图3流式细胞术检测VEGFR-2+细胞 血管内皮损伤后依赖自身修复的过程非常缓 慢,并且损伤后再生的血管内皮细胞表型发生变 化,不能有效地抑制新生内膜增生.目前关于损伤 后促进内皮修复的研究主要集中于利用药物,细 胞因子基因转染及自体血管内皮细胞移植,从不 同角度补偿,替代受损内皮细胞的功能.上述方 法由于技术,细胞来源等方面的限制,均未获得成 功.最近越来越多的研究表明,循环中的EPC能被 趋化至血管损伤部位,并进一步分化为成熟内皮 细胞参与损伤内皮的修复.通过移植自体EPC或 动员骨髓中的EPC,既避免了以往移植自体静脉 内皮细胞来源的局限,其分化,增殖潜力又使血管 内皮损伤后结构功能的快速恢复成为可能.因此, 如何使作为移植种子细胞的EPC在体外稳定扩增 也就成为人们关注的热点.本研究从人外周血中 分离培养出能稳定扩增的内皮祖细胞,为进一步 进行自体内皮祖细胞移植,促进血管内皮损伤修 复治疗奠定了基础. 参考文献 l1lASAHARAT,MUROHARAT,SULLIVANA,eta1.Iso- lationofputativeprogenitorendothelialcellsforan.- giogenesis[J].Science,1997,275(5302):964-967. 【2]PEICHEVM,NAIYERAT,PEREIRAD,eta1.Ex- pressionofVEGFR-2andAC133bycirculatinghu— manCD34+cellsidentifiesapopul~mnoffunc- tionalendotheliMprecursors[J].Blood,2000,95(3): 952—958. [3】KONGD,MELOLG,G.NECCHIM,eta1.Cytokine? inducedmobilizationofcirculatingendotheliMpro- genitorcellsenhancesrepairofinjuredarteries[J]. Circulation,2004,110(14):2039—2046. 【4JHET,SMITHLA,HARRINGTONs,eta1.Trans— plantationofcirculatingendotheliMprogenitorcells restoresendothelialfunctionofdenudedrabbit carotidarteries[J].Stroke,2004,35(10):2378-2384. [5】KONGD,MELOLG,MANGIAA,eta1.Enhanced inhibitionofneointimalhyperplasiabygenetically engineeredendothelialprogenitorcells[J].Circula- tion,2004,109(14):1769-1775. f6】HuRJ,YOONCH,KIMHS,eta1.Characteriza- tionoftwotypesofendothelialprogen~orcellsand theirdifferentcontributionstoneovasculogenesis[J]. ArteriosclerThrombVascBiol,2004,24:288—293. [7】BOMPAISH,CHAGRAOUIJ,CANRONX,eta1.Hu— manendothelialcellsderivedfromcirculatingpro- genitorsdisplayspecificfunctionalpropertiescom— paredwithmaturevesselwallendothelialcells[J]. B10od,2004.103:257%2583. (本文编辑:李进文)