口腔白色念珠菌与主要致龋菌相关性分析

口腔白色念珠菌与主要致龋菌相关性 170Mar.2010Vo1.3No.3 论着 口腔白色念珠菌与主要致龋茵相关性分析 文章编号:1674—1595(2010)03—0170—03中图分类号:R78文献标志码:A 赵英姿,宫雁冰 摘要:目的分析口腔白色念珠菌与主要致龋菌关系.选择2007年9—10月辽宁中医药大 学职业技术学 院职工和学生l】9人,采集其口腔牙菌斑,用PCR法检测白色念殊茵,变形链球菌和发酵乳 酸杆菌阳性表达,分析 其相关关系.结果白色念珠茵,变形链球茵,发酵乳酸杆菌阳性率分别为 28.6%(34/l19),62.2%(74/l19), 10.9%(13/119).变形链球菌在白色念珠菌阳性者中检出率(16/34,47.1%)低于白色念珠菌阴 性者(58/85, 68.2%),差异有统计学意义,呈负相关(r=一0.197,P=0.032).发酵乳酸杆菌在白色念珠茵阳性 者中检出率与在 白色念珠菌阴性者中检出率差异无统计学意义(P>O.05).结论口腔白色念珠菌与变形链 球茵可能有拮抗关 系,与发酵乳酸杆菌无拮抗关系. 关键词:白色念珠菌;变形链球菌;发酵乳酸杆菌;龋病 ThecorrelationbetweenoralCandidaalbicansandputativecariogenicbacteria.ZHAOYing-zi,GONG Yan—bing.DepartmentofEndodontics,StomatologyHospitalofShenyang,Shenyang110002,China Abstract:0bjectiveToexploretherelationshipbetweenoralCandidaalbicansandputativecariogenicbacteria. MethodsAtotalof119dentalplaquesampleswerecollected.PCRmethodwaspreformedforidentificationofCandida albicans,Streptococcusmutans,Lactobacillusfermentum.Analyzethecorrelationamongthem.ResultsThepositive rateofCandidaalbicans,Streptococcusmutans,andLactobacillusfermentumwas28.6%(34/119),62.2%(74/119) and10.9%(13/119),respectively.ThepresenceofStreptococcusmutansinCandidaalbicanscarriers(47.1%,16/34) wassignificantlylowerthannon-Candidaalbicanscarriers(68.2%,58/85).Candidaalbicanscarriagewasnegatively correlatedwiththepresenceofStreptococcusmutans(r=一 0.197.P=0.032).NocorrelationwasfoundbetweenCandi— daalbicanscarriageandLactobacillusfermentumdetected(P>O.05).ConclusionOralCandidaalbicansandStrepto— COCCUSmutansmayhaveantagonisticrelationship. Keywords:Candidaalbicans;Streptococcusmutans;Lactobacillusfermentum;dentalcaries 白色念珠菌(Candidaalbicans)又称白色假丝酵母菌, 是口腔常见菌群,也是口腔中重要的条件致病性真菌.在 不同年龄阶段人群的口腔中,可不同程度地检白色念珠 菌….已有的研究发现变形链球菌(Streptococcusmutans) 为光滑面龋的主要致病菌,发酵糖类产生乳酸;发酵乳酸 杆菌(Lactobacillusfermentum)为牙本质龋的主要致病菌, 是牙菌斑中最常见的乳杆菌,发酵糖类产生乙酸.现在很 多食品厂家用山梨糖,木糖醇等变形链球菌不能利用的糖 类来制作抑龋食品.白色念珠菌不仅可发酵蔗糖,葡萄 糖,麦芽糖等糖类产酸,甚至包括山梨醇,木糖醇等多种变 形链球菌不能分解利用的糖类.且白色念珠菌产酸溶解 羟基磷灰石的能力是变形链球菌的20倍左右.因此,白 色念珠菌可能参与致龋作用,其与变形链球菌,发酵乳酸 作者单位:沈阳市口腔医院牙体牙髓科,沈阳110002 电子信箱:leishuhao@126.om 杆菌在牙菌斑中是否竞争营养物质和空问位置,对口腔微 生物动态平衡和研究龋病的流行病学具有十分重要的意 义.本实验通过检测受检者牙菌斑中白色念珠菌,变形链 球菌,发酵乳酸杆菌的阳性表达,分析它们的共栖关系,为 进一步研究龋病的防治提供理论基础. 1资料与方法 1.1研究对象选择2007年9—10月辽宁中医药大学职 业技术学院职工和学生119人.男47人,女72人;年龄3— 81岁,平均37.8岁.受检者均知情同意,自愿参加本项研 究,3个月内未使用抗生素,皮质激素等免疫抑制药物. 1.2主要试剂溶菌酶(Amresco,US),蛋白酶K(Merk, Germany),溶细胞壁酶(Sigma,US),Tris,EDTA,SDS(Si ma,US),dNTP(Roche,Switzerland),TaqE(TaKaRa,大连宝 生物工程有限公司),genefinder核酸染料(Bio—V,厦门百维 信生物科技有限公司),DNA分子量为DL2000Marker 2010年3月第3卷第3期中国实用口腔科杂志17l (大连宝生物工程有限公司).引物参照文献[4—6], 购于上海生工生物工程技术服务有限公司.见表1. 表13种细菌的PCR引物序列及产物大小 引物序列PCR产物(bp) 白色念珠菌 上游(F):GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 下游(R):GCTGCGTTCTI’CATCGATGC 变形链球菌 上游(F):TCTAAGcAAcAAGCTGCTAGTACT 下游(R):TGGTTGAGATGI丫rGCTGAAGITrGC 发酵乳酸杆菌 —匕游(F):AATACCGCATrACAACTITG 下游(R):GGTTAAATACCGTCAACGTA 1.3研究方法 1.3.1样本采集用无菌牙签采集后牙邻间隙牙菌斑样 品,立丑悬浮于100txL生理盐水中,一20%保存. 1.3.2牙菌斑DNA提取参照文献[4],常规酚一氯仿法 提取DNA. 1.3.3PCR扩增PCR反应体系(20L):H014.5txL, 10×buffer2.0tzL,10mmol/LdNTP0.5L,10txmol/L 上游引物和下游引物各0.5IxL,5U/~LTaqE0.2L,牙菌 斑DNA模板1.8L.循环条件:95?热启动5rain;95? 30S,退火30S(退火温度:白色念珠菌和乳酸杆菌均为 50%,变形链球菌为55?),72’:E30S,40个循环;72qC10 min.4?保存.2.0%琼脂糖,1×TBE缓冲液,genefinder 核酸染料染色,电泳(110V)30rain.紫外线凝胶扫描成 像,并记录实验结果. 1.4统计学处理采用SPSS11.5统计软件对数据进行 pearsonx检验,Kendall等级相关分析,对PCR检测结果进 行比较分析.JD<0.05为差异有统计学意义. 6121824M 150bp M为DNAmarker;1,24为不同样本PCR产物:150bp条带(样 本1,2,5,6,9,12,14,18,20,22)为变形链球菌阳性. 图2变形链球菌PCR检测结果 M16121824 337bv M为DNAmarker;1,24为不同样本PCR产物;337bp条带(样 本3,7,9)为发酵乳酸杆菌阳性. 图3发酵乳酸杆菌PCR检测结果 2.2白色念珠菌与变形链球菌相关性分析变形链球菌 在白色念珠菌阳性者检出率为47.1%(16/34),在白色念 珠菌阴性者检出率为68.2%(58/85),经pearsonx检验, 差异有统计学意义(×=4.631,P=0.0031);经Kendall等 级相关分析,与白色念珠菌呈负相关(r=一0.197,P= 0.032). 2.3白色念珠菌与发酵乳酸杆菌相关性分析发酵乳酸 杆菌在白色念珠菌阳性者检出率为14.7%(5/34),在白色 念珠菌阴性者检出率为9.4%(8/85),经pearsonx检验, 差异无统计学意义(x0.699,P=0.403). 2结果3讨论 2.13种细菌PCR检测结果受检者牙菌斑中,白色念珠 菌阳性表达率为28.6%(34/119),其PCR检测结果见图1; 变形链球菌阳性表达率为62.2%(74/119),其PCR检测结 果见图2;发酵乳酸杆菌阳性表达率为10.9%(13/119),其 PCR检测结果见图3. M16121824 250bp M为DNAmarker;1,24为不同样本PCR产物;250bp条带 (样本5,6,7,8,11,,23,24)为白色念珠菌阳性. 图1白色念珠菌PCR检测结果 白色念珠菌属于真菌界半知菌亚门一芽孢菌纲一隐球酵 母目一隐球酵母科一念珠菌属,是双相型单细胞酵母菌.目 前认为只有8种念珠菌能引起人或动物的感染,均为条件 致病菌,其中主要是白色念珠菌.健康人的口腔,阴道,消 化道等处均可带此菌.在普通无症状人群中自色念珠菌阳 性率为22%,70%,有报道口腔白色念珠菌阳性率在新生 儿中为45%,健康儿童为45%,65%,健康成人为30%一 45%,戴可摘活动义齿者为50%,65%].白色念珠菌能 够分解多种糖类,产酸能力远远高于已明确为致龋菌的变 形链球菌,还能利用变形链球菌不能利用的糖类产酸. 有报道4,12岁有龋儿童的白色念珠菌检出率高于无龋 儿童.35—92岁患根面龋中老年人的白色念珠菌检出率 较高.可见,口腔白色念珠菌可能参与龋病发生,进展过 程. 白色念珠菌作为口腔正常菌群,与口腔中的其他微生 0O7 172Mar.2010Vo1.3No.3 物共同作用,相互黏附,对维持口腔中的微生态平衡有重 要作用.有研究表明,血链球菌(Streptococcussanguis),戈 登链球菌(Streptococcusgordonii),13链球菌(Streptococcus oralis),唾液链球菌(Streptococcussalivarius)均能与白色念 珠菌形成共聚体,而变形链球菌不能与白色念珠菌形成共 聚体.本研究也发现,变形链球菌在白色念珠菌阳性者 中的检出率(47.1%)显着低于其在白色念珠菌阴性者中的 检出率(68.2%).由此推测二者可能存在拮抗作用,具体 拮抗因素尚需进一步研究.由于白色念珠菌亦为产酸菌, 其与变形链球菌的拮抗关系并不影响其致龋作用. 牙本质龋的重要致龋菌为乳酸杆菌,与白色念珠菌则 未见拮抗关系.本实验中,发酵乳酸杆菌在白色念珠菌阳 性者中的检出率(14.7%)略高于其在白色念珠菌阴性者中 的检出率(9.4%),但无统计学意义.其他学者也有类似报 道,Strahinic等”取牙菌斑进行16SrDNA的PCR检测,发 现发酵乳酸杆菌与变形链球菌有拮抗作用,与白色念珠菌 无拮抗作用.但女性子宫颈阴道涂片检查发现,在念珠菌 阳性者乳酸杆菌检出率更高,念珠菌生长与乳酸杆菌呈正 相关.白色念珠菌与乳酸杆菌在感染根管中常可共同 检出.由此推测,白色念珠菌与发酵乳酸杆菌可以形成 共生关系,共同参与龋病发展过程. 本研究中自色念珠菌阳性者,其变形链球菌阳性率 (47.1%)高于发酵乳酸杆菌阳性率(14.7%),这可能是由于 本实验取材部位为后牙邻间隙,为光滑面牙菌斑,变形链 球菌含量较大.而乳酸杆菌多位于窝沟龋,在光滑面数量 较少.故本研究的发酵乳酸杆菌检出率低于变形链球 菌. 以上研究表明,白色念珠菌与光滑面致龋菌——变形 链球菌呈负相关,与牙本质龋致龋菌——发酵乳酸杆菌无 拮抗关系.白色念珠菌可与发酵乳酸杆菌共同参与龋病 的发展过程.因此,龋病的预防药物,致龋糖类替代品的 研究,应更多地注意宿主口腔微生态平衡的问. 参考文献 [1]亓庆国,周学东,肖晓蓉,等.正常儿童口腔中白色念珠菌的分 布及基因分组[J].中华微生物学和免疫学杂志,2003,23(9): 读者?作者?编者 674—677. 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