淫羊藿苷及济南假单胞菌制剂联合应用体外抗转移的研究

淫羊藿苷及济南假单胞菌制剂联合应用体外抗转移的研究 淫羊藿苷及济南假单胞菌制剂联合应用体 外抗转移的研究 534?中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin2000Dec;16(5):534,7 ;一{7 淫羊藿苷及济南假单胞菌制剂联合应用体外抗转移的研究 毛海婷张玲芸李晓冰 (山面科所免疫室.济南250062) 中国图书分类号R一332;R730.52;R730.53}R734.2; R979.1 文献标识码A文章编号1001—1978(2000)05—0534—04 摘要目的将捶羊藿苷(icariin,1CA)和济南假单胞菌制 剂(~seudomonasjinanensisagent,PJA)作用于人高转移肺癌 细胞PG.从肿瘤转移抑制的多个方面和环节探讨两药抗转 移作用的机制.并观察其联合用药的作用性质.采用 粘附实验,运动侵袭实验,流式细胞术,细胞免疫组化等多种 方法进行了检测并按金正均的Q值法计算联合用药效果. 结果ICA,PJA可明显降低PG细胞对层粘连蛋白基质的 粘附率(P<0.05P<0.05),并且这种粘附抑制作用有时间 依赖性;经ICA200mg?L,,PJA0.35mg?L及ICA200 mg-LtPJA0.35mg?L处理48h后,侵袭细胞数由对 照组的470?58分别降为237?31(P<0.01),316?34(P< 0.05),199?23(P<001);运动细胞数由对照组的520? 56.分剐降为354?55(P<005),375?19(P<0.05),256 ?22(P<0.01),并同时伴有细胞面牯附分子C944, LN—R及胞浆内CK18表达的减少.其中两药联合处理对粘 附,运动,侵袭能力的抑制作用均为单纯相加效果.药物处 理96h后.细胞表面HLA-ABC抗原表达率由对照组的 10.78%分别升高至37.54%,38.88%,50.75%(P<0.05). 结论ICA,PJA通过对肿瘤转移多个步骤的抑制而发挥抗 转移作用且两药有明显的相加效应.虢黼浆移 关键词蓬差童童;壹堡兰里堕;PG细胞;粘附 侵袭;转移;相加作用 淫羊藿苷(icariin,IcA)是从小蘖科草本植物淫 羊藿中提取的一种黄酮苷类化合物,具有多种生物 学活性,是一种免疫调节剂.而济南假单胞菌制剂 (pseudomonasjinanensisagent.PJA)是济南假单胞 菌抗癌系列第3代产品,有很强的抑癌作用.我们 的前期研究表明,淫羊藿苷及济南假单胞菌制剂均 具有抑制肿瘤细胞生长,促进其分化,凋亡等作 用_1J.为深入研究其抗癌作用机制,我们将人高转 移肺癌细胞PG作为体外转移模型,从肿瘤细胞的 粘附,运动,侵袭能力及细胞表面抗原性改变等方面 1999.12—23收穑,2000.03—24惨回 山东省科委资助项目,No963000021 作者简介:毛海婷.女,30岁,硬士.助理研究员,主要从事抗肿瘤免 疫研究 张琦.女.49岁.研士.研究员,硕士研究生导师.主要从 事抗肿瘤免疫研究 77,/ 2引 进一步探讨两药抗转移作用的机制.同时将淫羊藿 苷与济南假单胞苗制剂配伍,观察其联合用药的相 互作用性质.为临床应用提供新的治疗. 1材料与方法 1.1药物 1.1.1淫羊藿苷淡黄色结晶,从朝鲜淫羊藿中提 取,纯度大于96%,结构式:3,5,7-三羟基一4一甲氧 基一8一异戊烯基黄酮一3一O—a-L一吡喃鼠李糖一7一O—B—D 一 吡喃葡萄糖苷,相对分子质量为676.65,购于沈阳 药科大学. 11.2济南假单胞菌制剂呈针形结晶体,具有黑 金属光泽.化学结构类似大环内酯类抗癌药物,由山 东省医科院药研所提供.批号:970216. 11.3其它小鼠抗人角蛋白18(eylokeratin. CK18),CD44v6,层粘连蛋白受体(LN—R)单抗及过 氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒.北京中山 生物技术公司产品. 1.2细胞株 1.21PG细胞人高转移肺巨细胞癌系.引自北 京医科大学病理学教研室.本室常规培养. 1.2.2NIH3T3细胞小鼠成纤维细胞.引自北京 医科大学病理学教研室,本室常规培养. 1.3粘附实验_2取24孔培养板.每孔加入层粘 连蛋白(1aminln,LN)溶液0.2ml(含LN20). 置37?c02孵箱孵育1h,PBS洗2次,再加入体 积分数为3%牛血清白蛋白0.2ml,孵育2h,PBS 洗2遍,包被备用.取药物处理48h及对照组PG 细胞.用无血清RPMI1640液稀释.37?孵育30 mln.其间充分振荡以防细胞凝集.将上述细胞悬 液分别接种于已包被LN的板内,每孔0.5ml含5 ×10个细胞.于37?保温20,4O,6O,80min后,弃 去未粘着细胞,用PBS液轻洗2遍,经2.5g-L胰 酶消化后收集粘附细胞计数. 粘附百分率(%)=粘附细胞数/总细胞数X100% 14降解侵袭实验口?J 1.4.1趋化因子的制备NIH3T3细胞用含体积 分数为1O%小牛血清的DMEM培养液在37?,5% co’条件下培养.在细胞长势良好情况下弃去培养 液,用无血清DMEM轻洗2次,加入无血清DMEM 培养液继续培养24h,收集培养上清液,过滤赊菌, 中国药理学通樵ChinesePharmacol~gwalBulletin2000Dec;16(5)?535 — 20?保存备用. 1.4.2侵袭实验取48孔细胞培养板作为装 置的底板,每孔加入上述趋化因子1.6ml,于底板 上依次放置醋酸纤维素膜,橡胶垫片及无底48孔培 养板,上,下两培养板用螺丝固定,以防侧漏.在上, 下两板间的醋纤膜上铺matrigel50l(120/lg, DMEM稀释).于37?聚合30min.收集药物处理 48h及对照组PG细胞1×10?L,取200”l(2 10个细胞)加入已铺有matrigei的孔内.置37?, 0.05C02孵箱培养6h后取出醋纤膜,擦去膜上未 穿过的细胞,将膜于甲醇中固定30min后氨基黑染 色,透明液透明.光镜下计数穿膜细胞数. 15运动实验_3除用7.5nag?L纤粘连蛋白 (fibronectin,FN)溶液50l代替matrigel铺膜外, 其余操作步骤及计数方法同侵袭实验. 1.6流式细胞术检测PG细胞表面HLA-ABC抗原 表达变化收集药物处理96h和对照组PG细胞, 细胞沉淀加入20”l小鼠抗人HLA—ABC单抗,室 温30rain,离心,弃上清,PBS洗1次,加入20l1: 10稀释的羊抗小鼠IgG-FITC,室温30min后,PBS 洗1次.上机检测. 1.7细胞免疫组化染色法(辣根过氧化物酶法】 收集药物处理48h及对照组贴于盖玻片上的PG细 胞,PBS洗2次,体积分数为95.85为两药 拮抗. Q= 2结果 2.1ICA,PJA对PG细胞粘附性的影响经ICA, PJA处理后,PG细胞在LN基质上粘附40rain时, 其粘附率已明显降低(P<0.05,P<0.05),并且这 种粘附抑制作用随时间的延长而更为明显.其中以 ICA+PJA联合处理组的粘附抑制作用最明显(P< 0.01,见图1),其抑制作用为单纯相加效果(20,40, 60,80rain的Q值分别为1.15,0.85,1.05, 1.06). 2.2ICA,PJA处理后PG细胞侵袭力的变化 ICA,PJA作用于PG细胞48h后.有侵袭力,能穿 lOO 8O 60 40 20 O 0204O608O Incubativetime. /mi FigllmqaenceofICAPJA0nPGcellsadhesiveratio ?一?:cotttzo~;?一?:PJA035mg?L;?一?:ICA200mg L10—0:PJA+ICA;’P<005.’.P<0.01.05cont,’ol 过人工基底膜的PG细胞与对照组相比呈下降趋势 (分别为P<0.01,P<0.05),尤以ICA+PJA联合 处理组最为明显(P<0.O1,表1),其作用为单纯相 加效果(Q=0.87). Tab1InflmoftavasiveabilityofPGcellsbyICA,PJA(~;) 2.3ICA,PJA处理后PG细胞运动性的变化 ICA,PJA作用于PG细胞48h后,具运动能力,穿 过FN的PG细胞与对照相比呈下降趋势(P< 0.05),尤以两药联合作用组最为明显(P<0.01,表 2),其作用为单纯相加效果(Q=1.00). Tab2Innm.eofmofilltyofPGbICA,PJA(z?) 2.4ICA,PJA对PG细胞表面HLA.ABC抗原表 达的影响由表3可见,不同剂量ICA,PJA处理96 h后,PG细胞表面HLA_ABC抗原表达率较对照组 明显升高(P<0.05),其中两药联合作用组的变化 最明显. 2.5ICA,PJA处理后PG细胞CK18,cD”V6及 LN.R含量的变化对照组17(3细胞胞浆内CK18, 细胞表面CD44VLN—R均高表达,辣根酶染色呈深 棕黄色(+++),经ICA200mg?L,,PJA0.35mg ? L,,ICA200nag?L+PlA0.35mg?L处理48 h后,CK18,CD4V6及LN—R的表达水平均有不同 536-中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2000Dec;16(5) Tab3ChangesofHLA-ABeantigenexpressionofcontlml andR’eatedPGcells 程度地减少,降低为++,+. 3讨论 肿瘤的浸润和转移是肿瘤细胞与宿主细胞间质 以及宿主细胞之间一系列复杂,多因素,多环节相互 作用的结果.其过程包括:?肿瘤细胞通过表面粘 附分子,受体等与细胞外基质成分,如层粘连蛋白发 生特异性粘附;?到达基底膜的肿瘤细胞分泌蛋白 水解酶降解局都的基质;?基质降解区域发生癌细 胞的移动和侵袭J.在此过程中,含有变异型第6 外显子的粘附分子CD~4(CD~)和LN—R是肿瘤 细胞穿越基底膜向远处转移的关键因素.在细胞对 基质的粘附上已有实验证实维甲酸可使转移性B16 黑色素瘤细胞对LN及?型胶原的粘附明显降 低l.我们的结果与其相符,ICA,vJA通过下调 PG细胞表面CD4V6,LN.R表达水平,可对PG细 胞在LN基质上的粘附率产生影响,当粘附40mIn 时,药物处理组的粘附率已有明显降低,并且这种粘 附抑制作用随时间的延长更为明显,同时伴有细胞 运动性和侵袭力的下降,以及胞浆内CK18水平的 降低.已知肿瘤细胞穿越基底膜的关键在于其运动 能力,而决定细胞运动力的是由微管,微丝和中间丝 等构成的细胞骨架蛋白,它与肿瘤细胞的分化,组织 起源,形态,细胞运动及侵袭力密切相关L8J. Ledinko等l9在对人肺癌细胞的研究中发现伴随肿 瘤细胞体外侵袭力的下降,其中间丝蛋白的一种 CK18水平降低.这一点与我们的结果一致.另外 我们还发现药物处理96h后,PG细胞膜表面 MH0I类抗原(HLA-ABC抗原)的表达有明显升 高.因此,提高肿瘤细胞表面MH0I类抗原的表 达以增强细胞的免疫原性,可能是ICA,PJA抗转移 的另一作用机制. 在临床许多晚期肿瘤患者的化疗过程中或化疗 后可引起不少毒副反应,如头晕,乏力,脱发,免疫功 能低下等.尤其是假单胞菌注射液,虽对恶性胸腹 水,心包积液的治疗效果极佳,但由此所引起的发 热,寒战,局部疼痛等副作用往往使免疫功能低下的 患者更加难以忍受l1ull1_.针对上述情况,我们考虑 将PJA与毒副作用较小的抗肿瘤免疫调节剂ICA 联合应用,以期增强疗效,减少毒副反应,提高免疫 功能.在本实验中,采用国内较通用的评价二药相 互作用性质的0值法.联合用药实验结果表明, 200nag-LICA与0.35nag-LPlA联合处理对 PG细胞粘附,运动,侵袭能力的抑制作用均为单纯 相加效果好.本实验结果初步提示了ICA,PJA及 其联合抗转移作用的机制,为中西医结合治疗肿瘤 提供了新的方法. 参考文献 1毛海婷,张玲王芸ni淫羊营苷对人高转移肺癌细胞恶 性表型的逆转作用及其调拄机制的研究中国肿瘤生枷治杂 志1999;6(1):7 2RafadFTheroleofcellad】1mandmigrati~intheinvitroin一 …ofr【louseadrehalcareinomaceilsInvasionMetastasis. 1990;10:208,24 3JungerWG,C~dozaTA.LiuFCa/Impmvedrapidphoto- metricayforquantitativem~ementPMNmigra6c~, munolMethods,1993;160:73,9 4章祟杰魏大鹏,赵宗蓉盯促党刺激物对淋巴细胞粘附和 穿透内皮细胞的影响上海.屯症学杂志,1997;17(2):95-7 5金正均概率和曲线与oso”——估计台并用药效果的一种新 方法上海第二医学院,1981;1(1);l5,8 6HendfixMIC.WoodWR,Set’tarEAeta1.Retincdcacidhahibi- t[onofh~nsnmelanomacellinvasiontheouthareoz~fitl1tedba5e. mentmembranesndlBrelat?nt.d…inthe伽res5l衄 ofedhakoN,CostgntinoILL.Modtdationofp53geneexpre8.nand eytokemdn18hart…d-mediatedin~asbnsuppressed]ungcsre[- …cellsAnticanc~R.1990;16:1335,40 10王金万济南假单胞菌治疗恶性胸腔积液的临床验证中 国新药軎.盖.1993;2(3):44,7 11自厚喜.帅训超假单胞菌腔内注射治疗恶性心包积液10例 癌盎.1996;18(3):180 Studiesoficariinandpseudomonasjinanensis a窖entonanti-metastaticmechanisminvitro MAOHal—Ting,ZHANGLing,WANGYun,LIXiao-Bing (DeptofImmunoloy,InstituteofBasicMedicalSciences, ShandongAcademyofMedicalSciences.Ji8250062) ABSTRACTAIMMechanismoficariin(ICA)andpseudomonasjirmnensis agent(PJA)Onanti-naetasta- 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin2000Dec;1fi(5):537--9’537 ;7妒 缺血再灌注损伤时脑线粒体功能的改变及姜黄素的保护作用 互—旦豫胡晋红璺学敏 (第二军医太学长海压院临床荮理室,上海200433) 中国图书分娄号R-332;R28271;R32281;R329.24; R743.3L 文献标识码A文章编号1001—1978(2000)05—0537—03 摘要目的观察缺血再灌注时脑细胞线粒体功能的改变 及姜黄素对此改变的影响.方法沙土鼠双侧颈总动脉结 扎造成全脑缺血20rain,再灌注30min后取大脑半球,分离 脑细胞线粒体.用氧电极法测定线粒体的呼吸功能及还原 性辅酶I(NADH)氧化酶,琥珀酸氧化酶和细胞色素氧化酶 的活性.动物随机分为假手术组,模型对照组和姜黄素组. 姜黄素40m?kgI1于缺血模型制作前30minip.结果沙 土鼠缺血后脑细胞线粒体的呼吸功能有所损伤.表现为呼吸 控制率,磷氧比和氧化磷酸化效率均较假手术组有不同程度 的降低,各种氧化酶的活性亦有明显下降.姜黄素组动物的 这种改变明显减轻.结论沙土鼠脑缺血再灌注后脑细胞 线垃体的功能明显受损,而姜黄素对此损伤具有一定的保护 作用.昭香弘 关键词脑缺血;再灌注损伤;线粒体;呼吸功能;氧化酶;姜 黄素;沙百,一—— 1999.09—10收穑.1999.12—24修回 第二军医大学生化教研室.上海20{)433 作者简介石晶,女.41岁,副研究员; 葫晋红.女,50岁.教授,博士生导师 R7j R23s 线粒体是细胞中能量储存和供给的主要场所, 是细胞中非常敏感的细胞器.而脑细胞代谢的最大 特点是耗氧多.对缺氧特别敏感.为了进一步探讨 缺血再灌注时脑细胞损伤的机制及姜黄素作为抗氧 化物质对此损伤的保护作用,本研究拟采用沙土鼠 脑缺血再灌注模型,通过观察脑细胞线粒体呼吸功 能及呼吸链氧化酶活性的变化,了解线粒体水平的 损伤情况及姜黄素的影响. 1材料和方法 11实验动物0沙土鼠,体重(60?10)g,由上海 生物化学研究所提供. 1.2仪器设备低温高速离心机(CR21型,日立 公司);溶氧测定仪(SP一2型,中科院上海植生所); 恒温循环水浴箱(BmmmaLKB公司);平衡纪录仪 (上海大华仪表厂);752分光光度计(上海第三分析 仪器厂). 13药品与试剂姜黄素,北京怀柔生化研究所提 供;ADP,NADH,TMPD等为Sigma公司的产品;其 它试剂均为国产生化试剂及分析纯试剂. 1.4实验方法 141动物分组及脑缺血再灌注模型的制作动 sisofahighlymetastatichumanlungtumorcellline (PG)andtheeffecttypeofthecombinationofICA, PJAwerestudied.METHoDSPGcellsweretreat— edwithIcA,PJA.orthecombinationofbothinvit— TO.Adhesionassay,invasionassay,mrationassay, flowcytometry(FCM)andimmunohistochemieal strainingwereusedTheeffectsofICAandPJA combinationwereevaluatedwithQmethodofJin Zhe.~g-JunRESULTSICA,PJAcoulddecreasePG cellsadhesiveratiotolamininsubstrateinfltime-de— pendentmanner(P<0.05.P<0.05).Thetreat— mentofPGcellswithICA200mg?L一,PJA0.35 mg?L一,ICA200mg?L一’+PJA0.35mg?L一f0r 48hcoulddecreasetheinvasiveeellnumbersfrom 470?58to237?31(P<0.01),316?34(P< 0.05),199?23(P<0.O1).Meanwhilemigrative eellnumbersdecreasedfrom520?56to354?55(P <0.05),375?19(P<0.05),256?22(P<0.01) andtheexpressionofCDuV6,LN—R,CK18ofPG cellsatsoreduced.Therewereenhancedeffectaonthe treatmentofICAandPJAcombination.Ontheother harld.HLA—ABCantigenexpressionratioofPGcells increasedfrom10.78%to37.54%,38.88%, 50.75%(P<0.05)aftertreatmentwithICA,PJA ,ICA+PJAfor96h.coNCLUS10NI(A,PJA mayplayanti—metastaticrolesinmanyaspectsand thetypeofthecombinationofICAandPJAissingle enhancedeffeet. KEYWORDSieariin;pseudomonasjinanensisa— gent;PGcell;adhesion;invasion;metastasis;en— hancedeffect