欧亚甘草根的活性成分－甘草酸苷对HIV血清阳性患者外周血单核细胞培养物中HIV复制的影响

欧亚甘草根的活性成分－甘草酸苷对HIV血清阳性患者外周血单核细胞培养物中HIV复制的影响 欧亚甘草根的活性成分,甘草酸苷对HIV血清阳性患者 外周血单核细胞培养物中HIV复制的影响 关键词:HIV ，甘草酸苷，β,Chemokines 摘要 本研究是关于甘草酸苷(GR)对感染HIV患者的外周血单核细胞(PBMC)培养物中HIV复制的影响。去除CD8，T细胞后，HIV阳性患者的PBMC和健康志愿者的PBMC分别置于有或无甘草酸苷(100μg/ml)的培养基中培养21天。HIV阳性的42份样本中有13份甘草酸苷可以抑制90,以上的HIV复制。而在这42份样本中，20份为非合胞体诱导型HIV(NSI-HIV)，15份为合胞体诱导型HIV(SI-HIV),其余的7份为合胞体诱导型和/或非合胞体诱导型HIV。甘草酸苷可将NSI-HIV样本中12份(12/20,60%)的HIV复制以超过90,的程度进行抑制，而对于SI-HIV只能抑制其中的1份(1/15,7%)。在HIV阳性的患者PBMC中，甘草酸苷呈剂量依赖型的方式诱导CC Chemokines 配体4(CCL4)和配体5(CCL5)的合成。如果PBMC培养中加入CCL4和CCL5的单克隆抗体，就难以发现甘草酸苷的抗HIV活性。这些结果显示甘草酸苷可能通过诱导β,Chemokines合成而发挥抑制NSI-HIV的作用。 简介 从艾滋病患者体内分离出的HIV可分为两类，一种为复制缓慢的非合胞体诱导型变异体，(NSI-HIV)另一种为复制迅速的合胞体诱导型变异体(SI-HIV)。非合胞体诱导型主要见于 艾滋病的无症状阶段，而合胞体诱导型则主要见于进展期艾滋病患者。通过CCR5的干涉作用，非合胞体诱导型HIV进入靶细胞(巨噬细胞)的过程可被β,Chemokines类物质所调 节，例如CCL3/MIP-1α，CCL4/MIP-1β和CCL5/RANTES. Chemokines可由多种细胞分泌并组成了一类包含6—14KD小肽的超家族。它主要负责 输送和回收免疫应答和炎症反应部位的效应白细胞。Chemokines包含四个高度保守的半胱氨酸位点，可分为两个亚族，这种分类取决于第一对半胱氨酸是紧邻的还是由另一个氨基酸隔开的。α,亚族由CXCL8/IL-8所代表，主要吸引中性粒细胞，而β,亚族则调节多种 效应细胞的转移并且与共同受体CCR5具有亲和力，这种受体正是非合胞体诱导型HIV进入靶细胞的位点。因此，非合胞体诱导型HIV的复制可被这些β,Chemokines所抑制。 甘草酸苷含有20β,羧基,11,氧,30,norolean-12-en,3β,yl,2,O,β,D, 葡萄糖吡喃脲,syl,α,D,葡萄糖吡喃siduronic酸，可以从欧亚甘草的根中提取。在日本甘草酸苷用于临床治疗慢性活动性肝炎。它具有多种生物学活性，包括:诱导干扰素的合成，提高自然杀伤细胞的活性，抑制疱疹病毒的复制。而且，甘草酸苷可诱导抗,2,型 T细胞的分化从而提高机体对特定机会致病病原体的抵抗力。最近发现，甘草酸苷也是 β,Chemokines的诱导物。健康人PBMC给予甘草酸苷就可诱导CCL4和CCL5的合成。 由于非合胞体诱导型HIV的复制可被此类物质所抑制，那么我们就研究了HIV阳性患者 的PBMC培养物中甘草酸苷对HIV复制的抑制作用。 材料和 志愿者 用于此实验的PBMC来自42位HIV阳性的患者，这些患者均得到了系统的抗逆转录病毒 ，治疗。他们的CD4，细胞平均34841个/mm3，病毒含量从微量(<50/ml)到>7500/ml , 不等。另外从Gulf Coast Regional 供血中心采健康者的血样作为对照。 实验试剂 甘草酸苷由日本东京Microphagen药品公司提供。实验组PBMC在RPMI-1640培养基中培养，其中含有20,胎牛血清，2mM L,2谷氨酸，抗生素和20U/ml Hoffman-La Roche公司 (Nutley，N.J.,USA)生产的人重组IL,2。抗CCL4和抗CCL5单克隆抗体购自PharMingen 公司(San Diego ,Calif,USA)。用于此实验的其他试剂为:抗人CD8，细胞单克隆抗体(PharMingen)，low-tox-H 兔补体(Cederlane Lab ,Ontario,Canada)和植物血细胞凝β,Chemokines集素(Difco，Detroit Mich，USA)。 细胞和培养基 将肝素化的全血通过Ficoll,Hypaque密度梯度离心后取得PBMC，然后将实验组和对照组 PBMC中的CD8，T细胞去除。这可以通过使用抗人CD8单克隆抗体(稀释致200倍，4oC。30分钟)兔补体依次处理获得(稀释致30倍，37oC，30分钟)。接下来，将清除掉CD8，T细胞的PBMC分别标注为“患者PBMC”(实验组)和“健康者PBMC”(对照组)。将来自NIH AIDS Research和Reference Reagent Program(Rockville，Md，USA)的MT,2细胞(一种人CD4，T群细胞)分别置入含10,FBS的RPMI,1640培养基中。这些细胞要用来区分HIV亚群。 检测甘草酸苷的抗HIV活性 6个/ml)和健康者的PBMC同时置为检测甘草酸苷的抗HIV活性，患者的PBMC(2*10 入有和无(0.1,100μg/ml)甘草酸苷的两种培养基中培养，这些样品分别放入96个圆底微量滴定盘中。在培养前，健康者的PBMC要加入PHA(5μg/ml)并保存3天以便激活。在一些培养基中要加入抗β,Chemokines(CCL4和CCL5)的单克隆抗体(2.5μg/ml). 在培养的过程中，每个星期要将培养基更换两次，每星期要往健康者的PBMC中 加入一次100μl的细胞悬液(1×106个/ml)。培养21 天后，采用ELISA法检测HIV的p24 抗原(Coulter HIV,1 p24 ELISA试剂盒，Coulter Immunology，Hialeah，Fla. USA)。HIV p24 抗原数量的下降提示甘草酸苷对HIV复制有抑制作用。如果甘草酸苷降低患者PBMC培养基中HIV p24抗原的数量与无甘草酸苷的培养基相比超过90,，那么就认为甘草酸苷抗HIV的活性为阳性。 HIV变异体的鉴定 在含MT,2细胞的培养基中患者PBMC的HIV可分为合胞体诱导型，非合胞体诱导型与 合胞体诱导型/非合胞体诱导型。MT,2细胞置入96个平底微滴定盘中，每个盘中含有50μl培养液，这取自已培养了21天的患者PBMC和健康PBMC培养基。培养过程中，每星期要将130μl的细胞和培养上清液用150μl新鲜培养液替换。培养结束后，在显微镜下观察细胞来确定其感染的HIV的变异体。大的多核细胞定义为合胞体。可观察到合胞体形成(每个微滴定盘中要大于或等于5个气球样细胞)的HIV变异体就归为合胞体诱导型。那么无合胞体形成的则为非合胞体诱导型。若合胞体形成的每个微滴定盘中小于5个气球样细胞，那么就定义为“合胞体诱导型和/或非合胞体诱导型)。 患者PBMC培养基中β,Chemokines的诱导和检测 为了诱导β,Chemokines的合成，患者PNMC悬浮于含10,FBS的RPMI,1640中，再 o培养于含不同剂量甘草酸苷(0.1-100μg/ml)的培养基中，在37C维持12,72小时。采用ELISA方法检测培养液中的CCL4和CCL5。 清除患者PBMC培养基中的β,Chemokines 为确定β,Chemokines对甘草酸苷抗HIV活性的影响，患者PBMC与含抗CCL4和抗CCL5单克隆抗体的甘草酸苷共同培养。21天后，运用ELISA 法检测HIV p24 抗原的含量。 统计学 获得的统计学结果采用方差分析法处理，p值小于0.05认为具有统计学差异。 结果 甘草酸苷对HIV复制的影响 此研究运用42位HIV阳性患者的PBMC(见表1)。大多数患者采用了抗逆转录病毒的 3治疗(见表1)。这些患者的CD4T细胞计数从0到1112个/mm不等，他们的病毒含量从微 量(<50/ml)到>750000/ml(见表1).实验组和对照组共同培养21天，那么HIV则在患者PBMC培养基中复制21天(即实验组)。然而，与甘草酸苷混合培养了21天的健康者PBMC和患者PBMC中，42位患者PBMC之中的13个样品有超过90,的HIV复制被抑制(表2中有12位患者，表3中有1位，表4中无)。甘草甜素对HIV复制的抑制作用是剂量依赖性的。大多数情况下，甘草酸苷以100μg/ml的剂量可以超过90,的程度抑制HIV的复制。图1显示了不同剂量甘草酸苷对HIV复制抑制作用的代表性数据。 甘草酸苷对HIV不同变异体抗病毒活性的差异 根据对人类CD4，T细胞系中MT,2细胞合胞体形成的诱导能力，42个患者PBMC培养样品中的HIV可分为合胞体诱导型和非合胞体诱导型。表2,4列举了获得的数据。在检验的42个患者PBMC样品中，20个感染了非合胞体诱导型(表2)，15个感染了合胞体诱导型(表3)，剩余的7个则归为合胞体诱导型和/或非合胞体诱导型(表4)。表2,4也列举了甘草酸苷的抗HIV活性。当20个感染了非合胞体诱导型HIV患者PBMC样本中的12个(12/20,60%)与健康者PBMC在含有甘草酸苷的培养基中同时培养，90,甚至更多的HIV复制被抑制。(表2)然而，对于感染了合胞体诱导型HIV的样本，则只有1份被抑制(1/15,7%)(表 3)。甘草酸苷对HIV非合胞体诱导型变异体复制的抑制作用具有统计学差异。(p<0.05) β,Chemokines与甘草酸苷抗HIV活性的关系 在以前的出版物中，β,Chemokines(CCL3，CCL4和CCL5)通过干扰HIV与靶细胞表面CCR5受体的结合从而抑制非合胞体诱导型HIV的复制，因此，我们检测了患者PBMC 培养基中β,Chemokines诱导的甘草酸苷活性。在患者PBMC培养基中以100μg/ml的剂量加入甘草酸苷，培养液中就可检测到CCL4和CCL5了。这些由Chemokines诱导的甘草酸苷的活性在0.1到100μg/ml的范围内是剂量依赖性的。图2(患者13，35和36)表示CCL5的代表性结果，而图3(患者20，35和36)则代表了CCL4。这些结果表明甘草酸苷 可以在患者PBMC培养基中诱导CCL4和CCL5的合成。 在患者PBMC培养基中加入抗CCL4和抗CCL5的单克隆抗体可以说明甘草酸苷诱导合成的β,Chemokines对其本身抗HIV活性的影响。如图4所示，患者PBMC(患者20的PBMC)和健康PBMC培养基中的甘草酸苷完全抑制了HIV的复制。然而，如果两者的培养基中有抗CCL4和抗CCL5存在，那么甘草酸苷的抗HIV活性就消失了。运用不同来源 的PBMC反复实验可获得相同的结果。(患者35，和36)。这些结果表明甘草酸苷通过诱导β,Chemokines从而抑制HIV的复制。 讨论 在此研究中，我们检测了提前去除了CD8，T细胞的患者PBMC和健康者PBMC共同培养物中甘草酸苷的活性。42位接受系统抗逆转录病毒治疗HIV阳性患者PBMC样品中有13份其HIV复制可被甘草酸苷以超过90,的程度抑制。而在这42位患者的样品中，20份感染了非合胞体诱导型HIV，15份感染了合胞体诱导型，剩余的7份则感染了非合胞体诱导型和/或合胞体诱导型。甘草酸苷抗HIV的活性在感染了非合胞体诱导型HIV的患者PBMC的培养基中表现突出，(12/20，60,)，但在感染了合胞体诱导型的样品中不明显(1/15, 7%).对于出现这种现象的原因，我们目前还不清楚。这可能源于非合胞体诱导型HIV的变异或者甘草酸苷和细胞之间的相互作用。还有待作进一步的研究。 甘草酸苷对患者PBMC培养基中非合胞体诱导型HIV复制抑制作用的确切机制还不清楚。然而，抗CCL4和抗CCL5的单克隆抗体可消除甘草酸苷在这些培养物中的抗HIV活性。并且实验显示甘草酸苷在患者PBMC培养物中可诱导β,Chemokines(CCL4和CCL5)合成。甘草酸苷对β,Chemokines的诱导作用是剂量依赖性的。当HIV进入靶细胞时，它的包膜(gp120糖蛋白)必须和一种表面受体(一种CD4分子)结合。不过，只有这种 CD4分子还不足以促使HIV进入靶细胞。另外，HIV进入靶细胞还需Chemokines受体或 Chemokines受体样分子协助。实验显示非合胞体诱导型HIV进入靶细胞是通过CCR5的作用。β,Chemokines。可与gp 120-CD4复合体竞争性地结合CCR5，从而阻止非合胞体诱导型HIV进入靶细胞。因此，CCL3，CCL4和CCL5均可以抑制非合胞体诱导型HIV的复制。这些结果强烈表明甘草酸苷通过诱导β,Chemokines合成从而抑制非合胞体诱导型HIV和CCR5受体的结合。 甘草酸苷在人类细胞培养中诱导β,Chemokines合成的机制仍然不清楚。不过，以前的研究中证实了甘草酸苷具有某些免疫调节活性:诱导干扰素γ的合成，提高自然杀伤细胞的活性,抑制炎症反应，诱导抗2型T细胞。这些事实表明甘草酸苷可能具有刺激淋巴细胞合成可溶性免疫调节性因子的功能。这意味着甘草酸苷诱导Chemokines合成的活性可能 是它多种免疫调节活性的一个方面。 早期的研究中，甘草酸苷的抗HIV活性是用MT,4细胞培养来证实的。 在感染了HIV的MT,4细胞的培养基中以494μg/ml的剂量给予甘草酸苷以观察其抗HIV的活性。随后又应用于3位感染HIV患者以观察其抗HIV活性。结果显示以1600mg/d 的剂量可以降低患者的血清p24 抗原水平。另有指出甘草酸苷每日400,800mg的 剂量可以提高感染HIV血友病患者体内CD4，细胞的有丝分裂活性。所有这些研究都 使用了大剂量甘草酸苷。这意味着早期的这些研究和本研究中甘草酸苷的抗HIV病毒活性可能源于不同的机制。早期的研究显示该化合物与HIV之间的直接作用。但是，我们的研究则表明甘草酸苷的抗HIV作用可能源于机体产生Chemokines。 几种可抑制由CCR5介导HIV侵入靶细胞过程的抗HIV物质可以抑制M,tropic HIV 复制。这包括修改后的Chemokines，抗CCR5的单克隆抗体和一种小分子拮抗物, TAK-779。然而，有报道指出单核细胞/巨噬细胞对Tat蛋白相关性CCR5的诱导很敏感 因此，HIV本身就可持续促进这些细胞表达CCR5，这暗示这些CCR5拮抗物对M,tropic HIV复制的抑制作用是有限的。最近的研究显示由Tat蛋白诱导的CCL2/MCP,1在CCR5 6/ml扩张性表达上有一定的作用。另外，甘草酸苷可有效地抑制巨噬细胞合成CCL2。1×10的外周血单核细胞由白介素,10刺激后可产生11.8ng/ml的CCL2，若培养基中加入100μg/ml的甘草酸苷那么只能检测到0.6ng/ml的CCL2。这些事实表明甘草酸苷对单核细胞/巨噬细胞中非合胞体诱导型HIV复制的抑制源于其两种不同功能，诱导CCL4/CCL5的产生和抑制CCL2的产生。还需深入研究探讨甘草酸苷抗HIV作用的机制。 鸣谢 笔者诚挚感谢日本东京Minophagen公司为本研究提供甘草酸苷 表1:参加此项研究的艾滋病患者的临床数据 Patient CD4count Treatment Viral load ceils/μl copies/ml 2 53 382,l40 IDV.DDLRTV.DMP 3 502 3,096 AZT-3TC-NFV 4 535 57,000 No treatment 5 560 66,077 No treatment 6 207 85,000 AZT-3TC-NFV.DMP 7 1,112 79,899 AZTL3TC-SQV 8 29 〉750,000 DDLD4T?RTV-SQV 9 415 187,635 DDLD4T.EFV 10 22 〉750,000 AZTJTC-RTV-SQV 1 1 25 230,035 DDLmT-RIV.SQV 12 1,097 156 D4T.3TC-IDV+IL2 13 624 71,517 D4T.3TC-IDV+IL2 14 505 DDLD4T,EFV-NFV 56,692 15 313 IDV-DMP-ABC 2,174 16 217 DDLD4T-RTV」DV』10'Urea 66J79 17 523 No treatment 134,150 18 300 No treatment 58,985 19 289 AZTJTC-IDV 208 20 510 No treatment 21 37,000 570 AZT-3TC-IDV 22 11 34 DDLD4T.DMP 23 517 83,091 AZT-3TC-NFV 24 332 13,813 AZT??3TC.EFV-NFV 25 57 306 No treatment 26 333 274,313 DDLD4T-NFV.DMP 27 158 482,596 D4T-3TC.DMP 28 697 43,914 AZT-3TC-IDV 29 143 trace No treatment 30 365 〉750,000 DDIL.D4T.DMP 31 142 35,053 No treatment 32 113 193,000 N。treatment 33 82 100,242 AZT-3TC-DMP 34 252 34,921 DDC.IDV-RTV 35 185 9,005 ABC-AZT.3TC-NVP 36 530 336,093 AZT.3TC 37 753 6,697 DDLD4T.NFV-DMP 38 428 6,629 ADF.DDI--3TC-APV 39 372 136,111 No treatment 40 74 24,003 D4T-RTV??SQV 41 218 613,717 D4T-3TC-NVP 42 412 15,515 AZT-3TC-RTV?SQV 12 21,000 D4T-3TC-NVP 123,635 IDVzIndinavir;DDI=didanosine;RTV=ritonavir;DMP= mozenavir;AZT=zidovUdine;3TC=lamivUdine;NFV=nelfIna- vitD4T=stavUdine;SQV=saquinavirlEFV=efavirenz;IL2= interleukin-2;ABC =abacavir;H0'Urea=hydroJWurea;DDC=zal- citabine;NVP=nevirapine;ADF=adefovir;APV=amprenaviI?. 表2:甘草甜素针对非合胞体诱导型HIV的抗病毒活性 2 93 + 5 78 - 6 100 + 13 100 + 14 88 - 15 19 - + 18 100 + 20 100 + 21 100 + + 22 100 - 23 100 - 24 15 - - 26 19 - 27 23 + 28 70 + + 30 12 + 33 91 + 35 100 36 100 40 100 total 2O patients +=12PBMC(60%) -=8PBMC(40%) 表中列举了感染了非合胞体诱导型HIV患者的PBMC并以序号标示，甘草甜素在PBMC 培养基中的抗病毒活性以阳性(，)或阴性(,)。患者PBMC感染的HIV为非合胞体诱导型是通过其能否诱导MT,2细胞产生合胞体的能力来证实(见正文)。患者PBMC(2×106/ml)和健康者PBMC(2×106/ml)同时在加入甘草甜素的培养基中培养了21 天。用ELISA法检验培养液中的HIV p24 抗原含量。如果甘草甜素可使患者PBMC培养液中的HIV p24 抗原含量下降超过90,，那么此样品中甘草甜素的抗HIV活性就标识为阳性，小于90,就标为阴性。 表3甘草甜素针对合胞体诱导型HIV的抗病毒活性 Inhibition ofHIV Anti-HIV Patient replication,q6 activity ofGR - 0 7 - 0 8 - 32 - 10 - 0 1 1 - 0 12 - 0 + 16 - 0 25 - 100 32 - 1 - 34 - 4 37 - 0 38 - 0 - 39 - 0 41 - 0 42 - 0 - - 表中列举了感染了合胞体诱导型HIV患者的PBMC并以序号标示，甘草甜素在PBMC 培养基中的抗病毒活性以阳性(，)或阴性(,)表示。患者PBMC感染的HIV为合胞体诱导型是通过其能否诱导MT,2细胞产生合胞体的能力来证实(见正文)。患者PBMC(2×106/ml)和健康者PBMC(2×106/ml)同时在加入甘草甜素的培养基中培养了21 天。用ELISA法检验培养液中的HIV p24 抗原含量。如果甘草甜素可使患者PBMC培养液中的HIV p24 抗原含量下降超过90,，那么此样品中甘草甜素的抗HIV活性就标识为阳性，小于90,就标为阴性。 表4甘草甜素针对非合胞体诱导型/合胞体诱导型HIV的抗病毒活性 Patient Anti-HIV Inhibition ofHIV activity ofGR replication,% - 3 0 - 4 0 9 - 0 17 0 - 19 1 - 29 0 31 0 - total 7 patients - -=7PBMC(100%) 表中列举了感染了非合胞体诱导型/合胞体诱导型HIV患者的PBMC并以序号标示，甘草甜素在PBMC培养基中的抗病毒活性以阳性(，)或阴性(,)表示。患者PBMC感染的HIV为非合胞体诱导型/合胞体诱导型是通过其诱导MT,2细胞产生合胞体的能力来证实(见正文)。患者PBMC(2×106/ml)和健康者PBMC(2×106/ml)同时在加入甘草甜素的培养基中培养了21 天。用ELISA法检验培养液中的HIV p24 抗原含量。如果甘草甜素可使患者PBMC培养液中的HIV p24 抗原含量下降超过90,，那么此样品中甘草甜素的抗HIV活性就标识为阳性，小于90,就标为阴性。 图1不同剂量甘草甜素对HIV复制的影响。35号患者的PBMC(2×106/ml)和健康者的PBMC (2×106/ml)在加入不同剂量甘草甜素的培养基中分别培养21天。采用ELISA法检测培养液 中的HIV p24 抗原含量。 图2 患者PBMC培养基中CCL5的诱导。取 自13号，35号和36号患者PBMC(2×106/ml) 分别加入甘草甜素(0.1-100μg/ml)培养12 小时。采用ELISA法检测培养液中的CCL5 含量。 图3患者PBMC培养基中CCL4的诱导。取自20号，35号和36号患者PBMC(2×106/ml) 分别加入甘草甜素(0.1-100μg/ml)培养12小时。采用ELISA法检测培养液中的CCL4含量。 图4抗CCL4和抗CCL5单克隆抗体对甘 草甜素抗HIV活性的影响。20号患者PBMC(2×106/ml)和健康者PBMC(2×106/ml)在加有 甘草甜素(100μg/ml)与抗CCL4和抗CCL5单克隆抗体的培养基中同时培养21 天。采用 ELISA法检测培养液中的HIV p24 抗原含量。 参考文献 1.Asjo B,Morfeldt-Manson L,Biberfeld G,Karlsson A,Lidman K,Fenyo EM: Replicative capacity of human Immunodeficiency virus from patients with varying severity of HIV infection. 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