通脉口服液对气虚血淤证单侧输尿管梗阻大鼠肾小管间质病变的影响-药学论文

通脉口服液对气虚血淤证单侧输尿管梗阻大鼠肾小管间质病变的影响-药学论文 作者:冷伟，杨霓芝，朴胜华，王立新，赵代鑫 【摘要】目的探讨益气活血复方通脉口服液对气虚血淤证肾小管间质病变的干预作用。Wistar大鼠60只，随机分为空白组，模型组，洛汀新治疗组，通脉大、中、小剂量治疗组。采用单侧输尿管梗阻(UUO)+亚急性衰老+游泳力竭致气虚血淤证肾小管间质病变病证结合模型，予相应药物治疗4周，观测体质量等一般状况，进行中医气虚证、血淤证评分，化学法检测血清BUN、Scr含量，ELISA法检测血组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)含量，对病变肾组织进行间质细胞浸润情况评分(CIS)及肾小管间质慢性病变评分(AFS)。结果模型大鼠体质量显著下降，气虚证、血淤证积分显著增高，通脉大、中剂量组大鼠体质量显著改善(P<0.05)，通脉各剂量组大鼠气虚证、血淤证积分显著降低;模型组大鼠PAI-1及t-PA/PAI-1显著升高(P<0.01)，通脉大剂量组PAI-1显著下降(P<0.01)，通脉中剂量及洛汀新组PAI-1明显下降(P<0.05);通脉大剂量组梗阻肾CIS、AFS显著降低(P<0.05)，降低前者与络汀新组相当，降低后者则优于络汀新(P<0.05)。结论通脉口服液大、中剂量可改善气虚血淤证肾小管间质病变大鼠体质量、气虚证、血淤证、血PAI-1升高等整体表现，大剂量通脉可明显减轻肾小管间质病理改变，且在对抗肾小管间质慢性病变方面优于洛汀新。 【关键词】通脉口服液;气虚血淤证;肾小管间质病变 慢性肾脏病(CKD)是世界范围的医疗和公共卫生问。长期以来，对其研究主要集中于肾小球病变，肾小管间质病变 (Tubulointerstitiallesions，TIL)未得到足够重视。随着人类肾脏疾病病理改变和肾病变动物模型研究的深入，提示CKD的发展和预后不仅与肾小球病变有关，更取决于TIL的有无及程度的轻重[1]。以杨霓芝教授为代表的学科组研究表明气虚血淤证为CKD最常见证侯之一，通过十余年的临床与实验研究，证明具有益气活血功效的中药复方通脉口服液(TM)可通过多种机制改善CKD预后[2]。因此进一步开展其对气虚血淤证UUO大鼠TIL干预作用的实验研究，完善其机制探讨。 1材料与仪器 1.1动物健康雄性SPF级Wistar大鼠60只，体质量230,250g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证 号:SCXK(粤)2003-0001。 1.2药物与试剂通脉口服液(由黄芪、三七等制成)由广东省中医院制剂中心提供(批号:06080709，规格:10ml×10支)。对照药物:洛汀新(苯那普利)，北京诺华制药有限公司生产(批号:H20030514，规格:10mg×14片)。t-PA、PAI-1检测试剂盒:美国USCNlifeScienceandtechnologycompany生产，广州威佳科技公司提供。 1.3仪器7170A全自动生化分析仪:日本日立;EclipseE800型光学显微镜:日本Nikon公司;DG5033A酶标仪:南京华东电子公司。 2方法 2.1分组与造模方法适应性饲养7d后将大鼠随机分为2组，空白 组(A)10只，造模组50只，后者复制气虚血淤证UUO模型。造模方法:衰老:采用D-半乳糖亚急性衰老方法[3]，第7,48天注射D-半乳糖(150mg/kg?d);疲劳:采用游泳力竭方法[4]，第7,34天每日9:00开始分批置入直径50cm，高100cm水桶内，桶内水深45cm，水温与室温均保持为(15?0.5)?，以木棒拔打强迫其不断游泳直到力竭(为动物下沉后10s不露出水面);UUO:参考文献[5]方法，第37天5%水合氯醛麻醉成功后，常规消毒，腹正中线切口，游离肾脏及输尿管，将左侧输尿管用组织钳托起中段部位，止血钳夹住，在两端用4-0丝线结扎(近肾盂段两次结扎)后剪断，关腹缝合。术后存活大鼠随机分为模型组(B)，洛汀新治疗组(C),TM大、中、小剂量治疗组(D、E、F)。A组大鼠第7,48天等量生理盐水皮下注射，第34天行假手术处理，手术方式同UUO组，但在进腹腔后分离左输尿管后不结扎。 2.2给药方法第34,60天、B组生理盐水12ml/kg?d灌胃，C组洛汀新2mg/Kg?d灌胃，D组大鼠TM(12ml/kg?d)灌胃，E组8ml/kg?d(生理盐水稀释至12ml/kg?d，下同)灌胃，F组4ml/kg?d灌胃。 2.3取材及处理方法第60天所有大鼠5%水合氯醛麻醉后，腹主动脉取全血6ml，低温离心分离血清(4?，3000r/min，10min)，-20?保存。游离左肾，扇形切取部分肾组织，10%中性甲醛溶液固定。 2.4检测指标与方法 2.4.1治疗前后中医证候积分评定参考文献[6]方法分别于第33，57天对各组大鼠进行证候积分评定。气虚证评分:A:精神正常(0)、 精神萎顿(3)、倦怠嗜睡(5)、对抗性、攻击性完全消失(7);B:毛发正常(0)、毛发枯黄无光泽(3)、毛发结穗打卷(5)、毛发稀疏脱落(7);C:大便正常(0)、轻度稀便(3)、中度稀便(5)、重度稀便或黄绿褐色黏臭便(7)。大鼠血淤证评分:A:舌质红润(0)、舌质暗淡(3)、舌质绛紫(5);B:眼球淡红(0)转为深红(3)、转为暗红(5)，C:尾尖至根部无淤点淤斑(0)、出现轻度淤血点(3)、出现中度以上淤斑(5)。 2.4.2血清指标的测定血肌酐检测采用苦味酸法，血尿素氮检测用尿素酶法，ELISA法检测血清内t-PA、PAI-1含量。 2.4.3梗阻肾组织病理学检查梗阻肾进行大体观察后，固定，包埋，制成4μm切片，HE及Masson染色，光镜下观察TIL。参考文献方法[7]进行肾间质细胞浸润情况评分(Cellinfiltrationscore，CIS):间质细胞浸润:无(0)、局灶细胞浸润(1)、多灶细胞浸润(2)、弥漫细胞浸润(3)。肾间质慢性病变(包括肾小管萎缩和间质纤维化)评分(Atrop-hyandfibrosisscore，AFS):间质纤维化:无(0)、<视野区域25%(1分)、视野25%,50%(2)、>视野50%(3);肾小管萎缩:无(0)、<视野区域25%(1)、视野25%,50%(2)、>视野50%(3)。由两个观察者对每个肾组织样本200倍光镜下随机取互不重叠的10个视野进行盲法评分，取两观察者评分的平均值,代表各样品的TIL程度。 2.5统计学方法采用SPSS13.0统计软件包建立数据库，数据采用?s表示，采用方差分析和q检验进行统计分析。 3结果 3.1各组大鼠一般状况A组及D组各有1只大鼠在UUO手术过 程中死亡，原因为麻醉意外。B组死亡1只，原因为游泳力竭实验过程中溺死。实验结束时，A组大鼠精神状况良好，动作自如，反应灵敏，毛皮有光泽;B组、F组大鼠明显消瘦，大便溏，精神萎靡，反映迟钝，毛竖，无光泽，动作迟缓。通脉各治疗组一般状况较模型组有不同程度改善。实验结束时，各造模组大鼠体重明显下降(P<0.01)，与B组相比，通脉大、中剂量组体质量明显增加(P<0.05)。见表1。表1各组大鼠体质量变化与空白组比较，*P<0.01;与模型组比较，?P<0.05 3.2各组大鼠治疗前后中医证候积分治疗前造模各组与A组相比气虚证、血淤证积分值明显升高(P<0.01);治疗后D、E、F组气虚证、血淤证积分值较B组、C组明显降低(P<0.05或P<0.01)，D、E、F组之间无显著性差异。见表2。表2治疗前、后各组气虚证、淤血证积分比较与空白组比较，*P<0.01;与模型组比较，?P<0.05、※P<0.01 3.3各组大鼠血肌酐、尿素氮、t-PA、PAI-1变化治疗结束时各造模组BUN、Scr与空白组无统计学差异。与A组相比，B组PAI-1及显著升高(P<0.01);各治疗组与B组比较，D组PAI-1显著下降(P<0.01)，C、E组PAI-1明显下降(P<0.05)。见表3。 3.4各组大鼠肾脏组织病理学造模大鼠左侧肾脏明显增大成球形，色泽紫暗。A组HE染色可见:正常肾小球和肾小管间质，肾小管由单层立方上皮组成，胞体较大，细胞核圆形，位于细胞近基底部。Masson染色可见肾小球、肾小管基底膜清晰可见。模型组大鼠HE、 Masson染色可见:大部分肾小管上皮细胞颗粒、空泡变性，部分肾小管上皮细胞坏死脱落，呈裸基底膜，管腔扩展，部分管腔内可见脱落坏死组织及细胞形成颗粒管型及细胞管型，可见灶性肾小管萎缩;间质区明显增宽，炎性细胞浸润，纤维组织增生，呈条索状、片状纤维化;肾小球除部分有肾小囊轻-中度扩张外，无其他明显病变(图1,4)。通脉各剂量组和西药组也有以上类似的改变，但病变与模型组相比有不同程度的减轻。表3治疗后各组大鼠血清t-PA、PAI-1含量 3.5各组大鼠肾小管间质CIS及AFS积分情况与A组相比，各造模组CIS均明显增高(P<0.001);与B组比较，D与C组下降明显(P<0.01)，两者之间无显著差异(P>0.05)。与空白组相比，各造模组大鼠AFS均明显增高(P<0.001);与B组比较，C组AFS降低明显(P<0.05)，D组降低显著(P<0.001)，且较C组明显下降(P<0.05)。见表4。表4治疗后各组大鼠肾小管间质CIS、AFS与空白组比较，*P<0.001;与模型组比较，?P<0.001，?P<0.05;与洛汀新组比较，※P>0.05，?P<0.05 4讨论 TIL最终可导致肾间质纤维化(RIF)，后者几乎是所有CKD发展到后期的病理学特征。通过早期防治TIL以阻止RIF的进展进而改善CKD的预后具有重大意义。研究表明,血管紧张素转换酶抑制剂等药物具有一定保护作用[8]，中医药防治TIL的研究业已获得了不少有意义的研究结果。我们前期应用具有益气活血功效的中药复方制剂TM用于治疗具有气虚血淤证的CKD,疗效明确。因此进一步设计动 物实验探讨TM的疗效与干预TIL的相关性，并设大、中、小剂量组及ACEi类代表药物洛汀新作为对照，以期初步明确其量效关系及作用特点。 当前中医药干预TIL的动物实验研究，大都直接采用现代医学模型，其中单侧输尿管梗阻(UUO)应用最为广泛。但中医药现代化及中西医结合事业迫切需要真正具有中医证候特点的病证结合模型[9]。杨霓芝教授在肾脏病研究领域率先采用抗Thy-1+游泳疲劳试验造成的大鼠慢性肾炎“气虚血淤证”病证结合模型[10]。在此基础上，本实验TIL动物模型，采用了UUO联合亚急性衰老及游泳疲劳的复合因素造模方法。结果显示:梗阻侧肾组织发生典型TIL，说明“病”的复制是成功的。造模后在宏观“证”方面，模型组较空白组大鼠体重下降，并出现了精神萎顿、毛发枯黄无光泽、稀便、舌质暗淡、尾尖至根部出现淤血点、梗阻侧肾色泽紫暗等“气虚血淤证”表现;在微观“证”方面，我们监测了纤溶酶原激活剂/纤溶酶原激活剂下抑制物(PAs/PAIs)这对指标，其不仅是维持血液中凝血与纤溶平衡的关键酶系，同时为调节肾脏细胞外基质代谢的关键酶系之一[11]，PA水平下降、PAI水平上升或其比值下降与淤血证有一定相关性[11，12]。本实验结果显示与空白组相比，模型组PAI-1显著升高，在一定程度上提示该模型具有微观的血淤证。 实验结果表明，应用益气活血中药TM灌胃后大鼠体质量、“气虚证”、“血淤证”血清PAI-1升高得到不同程度改善，洛汀新改善不显著，提示益气活血中药TM的多靶点、多途径的药理作用可能有助 于改善衰老、疲劳、输尿管梗阻对大鼠造成的“气虚血淤”综合病理改变，这为临床上应用TM等中药制剂治疗CKD,在改善患者整体表现方面优于洛汀新等西药提供了实验依据。同时以方测证，本实验在气虚血淤证的复制是比较成功的。病理学是研究肾小管间质病变的最直观、最有说服力的指标，本研究对实验大鼠梗阻肾病理切片行HE、Masson染色，通过对大鼠肾小管间质慢性病变和肾间质细胞浸润情况进行盲法观察评分。结果显示，大剂量TM组改善CIS作用与络汀新相当,改善AFS方面优于洛汀新，提示大剂量TM对TIL具有显著的保护作用，且在改善肾小管萎缩和间质纤维化等慢性疗变方面具有优势，这为临床研究中通脉口服液长期应用可改善CKD预后提供了动物实验依据，同时值得进一步深入研究。至于其机制，根据中医理论，肾小管萎缩和间质纤维化符合中医“虚”与“淤”的证候学特征，TM益气活血正与其相应，因此在这一方面作用突出;对于其具体内在作用机制，本实验结果表明大、中剂量TM可明显降低血清PAI-1水平，初步提示可能为其作用机制之一。 【参考文献】 [1]陈晓农，俞海瑾，王伟铭，等.肾小管间质病变与慢性肾脏疾病进展关系的研究[J].上海医学，2001，24(2):75. 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