假两性畸型小鼠睾丸胆固醇侧链裂解酶mRNA的异常表达

假两性畸型小鼠睾丸胆固醇侧链裂解酶mRNA的异常达 第 29 卷 第 1 期解剖学报V o l129, N o 11 1998 年 1 月A C TA A N A TOM ICA S IN ICA J an. 1998 假两性畸型小鼠睾丸胆固醇侧链裂解酶 3 的异常表达m RNA 33 J 沙家豪周作民王黎熔林敏朱虎 ′ O Sh au gh n e s sy P 33 ( )南京医科大学组织学胚胎学教研室, 南京210029; D ep a r tm en t o f P h y sio lo gy, U n ive r sity o f G la sgow , G61 1Q H , U K () () 摘 要为了解假两性畸型 小鼠睾丸胆固醇侧链裂解酶 450的水平及影响其 T fm P sccm RN A 转录的机理, 用反转录2多聚酶链反应比较了 5、20、25和 30正常小鼠、小鼠及 30手术隐睾小 ddd d T fm d 鼠睾丸 的 水平, 正常小鼠在 5, 20时, 450水平较低, 从 25起明显增高, 450P scc m RN A d P scc m RN A d 至 30时水平是 5时的 75 倍; 小鼠在 5时, 450水平稍高于正常小鼠, 但随后 d m RN A d T fm d P scc m RN A 直至 30其水平未见明显增高, 在 30时, 450总量低于正常小鼠 110; 30手术隐睾小鼠 ƒd d P scc m RN A d 的 水平低于正常 30小鼠 12, 高于 小鼠 5 倍。结果提示, 25的 细胞功能 450ƒP scc m RN A d T fm d L eyd ig 的 形 成 需 要 受 体 介 导 的 雄 激 素 作 用, 而 小 鼠 由 于 编 码 雄 激 素 受 体 基 因 突 变, 间 接 导 致 青 春 期 T fm 的低水平。450P scc m RN A 关键词 反转录2多聚酶链反应 水平 小鼠450P scc m RN A T fm ( ) 伴 基因隐性遗传所致的假两性畸形 , 小鼠, 具有短的盲端阴道、 X te st icu la r fem in izedT fm 小的阴茎原基和发育良好的乳头线; 睾丸位于腹腔中, 雄性生殖道的其他器官如前列腺、精囊腺和 1 输精管均未发育。尽管血浆中 、和催乳激素的含量均较高, 并且睾丸中 细胞的数L HF SH L eyd ig 3 2 然而其分泌睾酮的能力却十分低下。研究表明, 小鼠睾丸中睾酮生成酶类 量也基本正常,T fm 4 除 3, 1717。由于胆固 2羟甾脱氢酶活性正常以外2羟化酶和 2羟甾脱氢酶的活性明显低于正常ΒΑΒ () 醇侧链裂解酶 450 催化所生成的产物较多, 测定该酶的活性较难, 因而至今未见 小鼠睾 P sccT fm () 丸 活性检测的报道。本研究运用反转录2多聚酶链反应 2的方法测定了正常小鼠、450 P scc R T PCR 小鼠和手术隐睾小鼠睾丸 的水平, 以图了解 小鼠睾丸 450 450 T fm P scc m RN A T fm P scc m RN A 的水平及影响其转录的原因。 和方法 1. 动物 ( 出生后 5d、20d、25d 和 30d 的正常小鼠和 T fm 小鼠均来自 M R C 的放射生物学系 H a rw e ll, 5) , 部分正常小鼠在 19时按等 , 每年龄组动物 3的方法进行隐睾手术U n ited K in gdom d M u rp h y , 4 只。 各组动物被处死后, 立即取出睾丸置液氮中保存。 21 的合成cD NA TM 6 的方法, 取 2睾丸组织, 置 液体中超声粉碎, 氯仿抽提、异丙醇和 按沙家豪等m g RN A zo lB ( 的 3醋酸钠 2 次沉淀,7. 0 ƒ提取睾丸的总 。用 1加 20反应混合液 含 pH m o lLRN A Λg RN A Λl 50mm o lL KC 1, 3mm o lL M gC 12、10mm o lL T r is2H C l pH 8. 3、1mm o lL D T T , 5Λm o lL 随机引 ƒƒƒƒƒ ) 物, 5002反转录酶, 置 37? 60反转录合成第一链ƒ, 26, 8Λm o lL dN T P sU RN A sin U M M L V m in 。cDN A 31 定量 PCR 450 引物 1: 5′223′P scc A GT GGCA GT C GT GGGGA CA GT 3 英国基金资助的课 W e llcom e T ru st 引物 2: 5′223′ TA A TA C T GGT GA TA GGCCA CC7 扩增产物 411;bp 1: 5′223′ 2肌动蛋白引物 ΒGT GGGCC GCCC TA GGCA CCA 引物 2: 5′223′C GGT T GGCC T TA GGGT T CA GGGGGG 8 扩增产物 245。bp 用 015, 1加 30的 反 应 混 合 液 50 , 10ƒ1, 3ƒƒΛl cDN A Λl mm o lL KC mm o lL M gC l2 mm o lL 32 )( 2多聚酶, 200引物×2 40018. 3, 0. 5ƒƒ, 2T r isH C l pH U T aq DN A nm o lL Λm o lL dN T P sΛC i ΑP , 反应程序为 9616?, 3一个循环, 96? 36 , 60? 75 和 73? 60 反复循环, 循环次数dTA P m in ss s 取决于各样本扩增的指数期时的循环数; 反应产物置 1% 琼脂糖凝胶电泳; 将凝胶置 67? 3干燥, h 溴乙锭染色 30或 线片曝光过夜。根据染色的条带或 线曝光的条带, 切下产物带置闪烁液 m in X X 中, 测定各产物的 值。用 的 值比 2肌动蛋白的 值, 得到 的450 450 cpm P scc cpm Βcpm P scc m RN A 表达水平。 结果 各组小鼠睾丸 经抽提和 2 次沉淀后, 用作 2的, 所得扩增片段的大小分别 m RN A R T PCR 的对照组未见任何扩增片段, 表明为: 450 —— 411; 245。 不加 2肌动蛋白—— P scc bp ΒbpcDN A 扩增的扩增产物是特异的。 样本 经不同循环测定 和 2肌动蛋白 450 PCR PCR P scc cDN A ΒcDN A产物的指数期和平台期如图 1 所示。 根据各样本带所在位置, 收集反应产物并测定其 值, 以 cpm 表达水扩增指数期的 值比 2肌动蛋白扩增指数期的 值, 可得 450 450 P scc cpm Βcpm P scc m RN A 平, 并乘各年龄组睾丸的重量, 得每个睾丸的 总水平, 如图 2 所示。450 P scc 正常小鼠 经 不同循环扩 30图 1d cDN A PCR 增 450 和 2肌动蛋白, 凝胶电泳显示 P scc Β32吸收的扩增产物P F ig. 1 A m p lif ica t io n o f cDN A p rep a red f rom 30 . no rm a l m o u se te st is a t day sT h e po lym e ra se ch a in reac t io n w a s ca r r ied 450 2 o u t w ith p r im e r s fo r P scc and Β、20、25和 30正常小鼠和 小 5图 2ddd d T fm 鼠及 30手术隐睾小鼠 450 d P scc m RN Aac t in and reac t io n s w e re sam p led a t th e ( ) 的水平 相对于 2肌动蛋白。 Β32 . cyc le s ind ica tedP inco rpo ra ted in to ( 450 L eve ls o f P scc m RN A re la t ive to F ig. 2 th e am p if ied p ro duc t w a s show n fo l2 ) 25,Βac t inin no rm a l and T fm m ice a t 20, 25 30 and day s o f age and c ryp 2 low ing ge l e lec t rop ho re sis. 30 .to rch id m ice a t day s o f age 1 期沙家豪等. 假两性畸型小鼠睾丸胆固醇侧链裂解酶 的异常表达 m RN A ?61? 讨论 催化胆固醇转换成孕烯醇酮, 在性腺中是所有类固醇生物合成不可缺少的, 也是限制 450 P scc 9 类固醇激素生成的闸门。在大鼠, 细胞生物合成雄激素的能力与 蛋白质水平高 450 L eyd ig P scc 10 度相关, 而与 317。本研究用 2的方法, 测定2羟甾脱氢酶或 2羟化酶蛋白质的水平无关ΒΑR T PCR 正常小鼠、小鼠和手术隐睾小鼠睾丸 的水平, 进一步阐明 小鼠睾丸合成 450 T fm P scc m RN A T fm 雄激素功能障碍的原因。 本实验结果显示, 正常小鼠在出生后第 5时, 450 含量很低, 此时睾丸中的 d P scc m RN A L ey2 11 细胞仍处于胚胎时期。第 20睾丸从腹腔下至阴囊, 细胞的数量明显增多, 功能也明 d ig d L eyd ig 12 , 14 显增强; 在 30时, 每个 细胞合成雄激素的能力已达到峰值, 此时 的450 d L eyd ig P scc m RN A 含量也明显增高, 达到出生 5时的 75 倍。 尽管 小鼠睾丸 细胞在出生 5时, 450 d T fm L eyd ig d P scc 的表达稍高于正常, 但从第 20起, 其表达明显低于正常; 在第 30, 小鼠睾丸 450 m RN A d dT fm P scc 的总含量小于正常的 1ƒ10。手术隐睾小鼠睾丸位于腹腔而影响精子的发生, 导致睾丸的体 m RN A 15 积明显低于正常。用 30的手术隐睾小鼠作为 小鼠的对照, 可反映腹腔环境对 450 d T fm P scc 表明表达的影响。结果显示手术隐睾 30的小鼠 的含量为 小鼠 5 倍, 450 m RN A d P scc m RN A T fm 出生后 20, 30青春期 小鼠睾丸 的调节与隐睾的腹腔环境无关。450 d T fm P scc m RN A 2 由于 小鼠在编码雄激素受体的基因第 1112 位缺失一个碱基, 该基因结构改变, 使其 T fm 翻译和合成雄激素受体蛋白质过早终止, 所产生的受体缺乏与 和类固醇的结合的部位, 导致 DN A3, 4 小鼠的 细胞因缺乏雄激素受体而对雄激素完全不敏感。有报道, 小鼠对雄激 T fm L eyd ig T fm 1 素的不敏感是导致细胞中 17等发现, 小鼠睾丸 2羟化酶活性降低的原因。L eyd ig ΑGo ld ste in T fm 3 中睾酮生成障碍发生在孕烯醇酮转换到睾酮阶段。等发现, 小鼠 细胞中孕M u rp h y T fm L eyd ig 酮明显高于正常, 当用 刺激培养的 小鼠 细胞时, 孕酮含量高于正常 30 多倍, 而hC G T fm L eyd ig 的水平睾酮的含量没有明显的改变。 在我们研究中也发现, 小鼠青春期的睾丸中 450 P scc m RN A ( )与雄激素受体 的水平之间没有相关性 待发表。提示 小鼠雄激素受体基因突变对 m RN A T fm 17, 而与 无关。这些研究结果为本实验所发现的 小鼠 2羟化酶有影响450 450 ΑP scc T fm P scc m RN A 水平的低下, 不是水平低下的机理提供了一个可能的解释: 青春期 小鼠睾丸 450 T fm P scc m RN A 由于隐睾的腹腔环境的影响, 而是 本身突变导致 17, 高浓度的孕 2羟化酶活性低下、孕酮堆积T fm Α 酮负反馈抑制 的转录, 可能是青春期 小鼠 水平低下的根本 450 450 P scc m RN A T fm P scc m RN A 原因。 收稿 1996- 11 修回 1997- 03 参 考 文 献 1 Go ld ste in JL , W ilso n JD. S tud ie s o n th e p a tho gene sis o f th e p seudo h e rm ap h a ro d it ism in th e m o u se w ith te st icu la r fem in isa2 ( ) t io n. J C lin i Inve st, 1972, 51 7: 1647 , , , . : 2 B lack bu rn W R C h ung KW B u llo ck L e t a lT e st icu la r fem in ista io n in th e m o u sestud ie s o f L eyd ig ce ll st ruc tu re and func2 ( ) t io n. B io l R ep ro d, 1973, 9 1: 9 () 3 M u rp h y L , O ′Sh augh ne ssy PJ. te st icu la r ste ro ido gene sis in th e te st icu la r fem in ised T fm m o u se: lo ss o f 17Α2h yd ro xy la se ac2 ( ) t iv ity. J E ndo c r ino l, 1991, 131 3: 443 4 M u rp h y L , O ′Sh augh ne ssy PJ. A bno rm a l L eyd ig ce ll deve lopm en t a t p ube r ty in th e and ro gen2re sistan t T fm m o u se. E n2 ( ) do c r ino l, 1994, 135 4: 1372 , ′5 . : M u rp h y L O Sh augh ne ssy PJT e st icu la r ste ro ido gen sis in th e te st icu la r fem in isa t io n in th e m o u sestudy o f L eyd ig ce ll st ruc2( ) tu re and func t io n. B io l R ep ro d, 1991, 9 1: 9 ( ) Sh a J , B ak e r P , O ′Sh augh ne ssy PJ. Bo th reduc t ive fo rm s o f 17Β2h yd ro xy ste ro id deh yd ro gena se typ e l and 3a re exp re ssed 6 ( ) du r ing deve lopm en t in th e m o u se te st is. B io ch em B iop h y s R e s Comm un, 1996, 222 1: 90 O ′Sh augh ne ssy PJ , M annan M A. D eve lopm en t o f cy to ch rom e P 450 side ch a in c leavage m RN A leve ls in neo na ta l o va r ie s o f no r2 7 ( ) ( ) m a l and h ypo go nada l hp gm ice. M o l C e ll E ndo c r ino l, 1994, 104 2: 133 8 , , , . 22.T o k unaga K T an iguch i H Yo da K e t a lN uc leo t ide seqnence o f a fu llleng th cDN A fo r m o u se cy to sk e le ta l Βac t in m RN A ( ) 1986, 14 6: 2829N uc le ic A c id s R e s 9 Iida S, P ap adopo u lo s V , H a ll P F. T h e inf luence o f exo geno u s f ree cho le ste ro l o n ste ro id syn th e sis in cu ltu re s ad rena l ce lls. ( ) E ndo c r ino l, 1989, 124 5: 2619 10 N o lan CJ , P ayne A H. Geno typ e a t th e P 450 scc lo cu s de te rm ine s d iffe rence s in th e am o un t o f P 450 scc p ro te in and m ax im a l ( ) te sto ste ro ne p ro duc t io n in m o u se L eyd ig2ce lls. M o l E ndo c r ino l, 1990, 4 10: 1459 11 Go ndo s B. D eve lopm en t and d iffe ren t ia t io n o f th e te st is and m a le rep ro duc t ive t rac t. In: S te r inbe rge r A , S te rnbe rge r E () , . : , 1980: 3220ed sT e st icu la r D eve lopm en tS t ruc tu re and F unc t io nN ew Yo rkR aven P re ss ( ) 12 , . . , 1983, 29 5:C h a se D J P ayne A HC h ange s in L eyd ig ce ll func t io n du r ing sexua l m a tu ra t io n in th e m o u seB io l R ep ro d 1194 13 , , , . , V e rgo uw en R P FA J aco b s SGH u isk am p R e t a lP ro life ra t ive ac t iv ity o f go no cy te sste ro li ce ll and in te r st it ia l ce lls du r ing ( ) . , 1991, 93 1; 233te st icu la r deve lopm en t in m iceJ R ep ro d F e r t il 14 V e rgo uw en R P FA , H u isk am p R , B a s RJ , e t a l. Po stna ta l deve lopm en t o f te st icu la r ce ll pop u la t io n s in m ice. J R ep ro d F e r t il, ( ) 1993, 99 2: 479 15 , ′. . M u rp h y L O Sh augh ne ssy PJE ffec t o f c ryp to rch id ism o n te st icu la r and L eyd ig ce ll and ro gen p ro duc t io n in th e m o u seIn te r( ) , 1991, 14 1: 66J A nd ro l 450 A BNO RM AL EXPRESS IO N O F Pscc m RNA A T PUBERTY IN THE Tfm M O USE ? 3, , , , , ′Sh a J iah ao Zho u Zuom in W an g L iro n g L in M in Zh u H u O Sh au gh n e ssy P J (, ,D ep a r tm en t of H istology and Em bry ology N anj ing M ed ica l U n iv ersity 3 ). , , D ep a r tm en t of V etP hy siology U n iv ersity of G lasg ow U K In th is stu dy, R T 2PCR w a s u sed to com p a re th e leve ls o f P 450 cho le ste ro l side2ch a in c leav2 () 450 5, 20, 25 30 age en zym e P sccm RN A in an d day s no rm a l m o u se te ste s an d th e te st icu la r fem 2 () 30 in ized T fm m o u se te ste s an d in day s a r t if ic ia l c ryp to rch idy m o u se te ste s to de te rm in e m ech a2 450 . , 450 n ism s o f regu la t in g P scc m RN A t ran sc r ip t io nIn no rm a l an im a lsP scc m RN A leve ls w e re 5 20. 25 . 30 , 450 low a t day an d day T h e re w a s a m a rk ed in c rea se f rom th dayIn day sP scc m R 2 2755. , 450 N A leve ls w e re fo ld h igh e r th an th a t o n day In th e T fm g ro up sP scc m RN A leve ls 5, w e re no rm a l o n day b u t fa iled to show an y sign if ican t ch an ge th e reaf te r an d rem a in ed a t n eo n a2 230 450 10ta l leve ls o n day an d P scc m RN A leve ls w e re fo ld low e r th an th a t in no rm a l m ice o n day 30. , 450 52In a r t if ic ia l c ryp to rch idy m iceP scc m RN A leve ls w e re fo ld h igh e r th an th a t in T fm 30. 2m ice o n day T h e re su lt s su gge sted th a t adu lt L eyd ig ce lls requ ire recep to rm ed ia ted an d ro gen 25 , ac t iv ity a ro u n d day fo r no rm a l fu n c t io n a l deve lopm en tw h e rea s T fm m o u se w ith a m u ta t io n in 450 .th e gen e en co d in g th e an d ro gen recep to r redu ce s th e p u b e r ta l r ise in P scc m RN A leve ls 22KEY W O RD S ; R eve r se t ran sc r ip t io n po lym e ra se ch a in reac t io nC ho le ste ro l sidech a in c leavage en zym e m RN A leve ls; T fm m o u se ?, , 210029, D ep a r tm en t o f H isto lo gy and Em b ryo lo gyN an jing M ed ica l U n ive r istyN an jing C h ina